Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途及其蛋白、基因、转化体

摘要

本发明“Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途及其蛋白、基因、转化体”属于生物医药领域。本发明提供Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途，并基于该Ago2的新用途提供一种治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物及制备方法，以及具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的蛋白、基因、重组表达载体和转化体。本发明经动物试验证实基于Ago2的本发明的抗心衰药物可显著改善心衰动物的心脏功能，起到有效的抗心衰和抗糖尿病性心肌病作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途及其蛋白、基因、转化体、药物。

背景技术

心血管疾病已成为国人第一位的死亡原因，心力衰竭是不同的心血管疾病发展到终末阶段的临床综合征。虽然近年来有一些新药被应用于临床，但仍有约50%的心衰患者在确诊后5年内死亡

糖尿病是威胁人类健康的重大疾病之一，预计到2025年，全球糖尿病的患病人数将达到3亿。其中，80%的糖尿病患者最终死于心血管并发症，糖尿病心肌病为糖尿病患者的死亡首因。糖尿病心肌病的发病机制涉及葡萄糖毒性、脂毒性、细胞凋亡和坏死、钙平衡受损、线粒体功能障碍、心肌胰岛素信号改变和氧化应激等，其中，高血糖被认为是糖尿病心肌病发生与发展的最主要因素。然而，许多大规模的临床研究却表明：对于糖尿病合并心衰患者，严格控制血糖，并没有改善糖尿病心衰患者的预后。例如，旨在研究血糖控制对心血管事件结局的影响大规模随机对照临床试验（ACCORD，ADVANCE，VADT，UKPDS）表明，强化血糖控制可以降低心梗的发病率，却没有降低心衰的再入院率和死亡率。这种现象表明糖尿病患者曾经处于高血糖状态,即使经过降糖治疗,仍易发生糖尿病相关心血管并发症，被称为“高糖记忆(hyperglycaemic memory)”现象。临床上，糖尿病性心肌病目前尚无有效的治疗措施，因此发掘新的治疗措施迫在眉睫。

目前多采用腺病毒和慢病毒作为基因治疗的表达载体，但慢病毒多由白血病病毒或HIV改造而来，而腺病毒载体表达时间短、对机体有免疫原性，均不适合将来的临床应用。而重组腺相关病毒载体 (rAAV)克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，无免疫源性，能驱动目的基因在体内长期表达，从而成为基因治疗最有前途的载体。

microRNA (miRNAs)是近年来新发现的一类具有重要调控基因表达作用的非编码小RNA。成熟 miRNAs 一般通过碱基互补配对原则与其靶 mRNAs 的 3’端非翻译区（3’UTR）序列完全或不完全互补结合，。有研究发现miRNA参与多种病因引起的心力衰竭。近年来研究发现，针对miR-132为靶点设计的药物CDR132L的人体安全性和耐受性良好，没有明显的毒性反应（EurHeart J.2021;42(2):178）。同时，CDR132L可以使患者的心衰标志物NT-proBNP显著减少，心电图QRS波明显变窄，心肌纤维化标志物也呈现降低的趋势。然而CDR132L对心衰患者EF值的改善却并不显著，因此需要寻找心衰中作用更为重要的miRNA及miRNA行使功能的关键调节因子。Ago2被报道作为miRNAs行使调控功能的核心蛋白(Science.2014;346(6209):608-13;Cell. 2014；158(3):607)，但是目前为止尚未见关于Ago2与心衰、Ago2与糖尿病性心肌病之间关联的报道，而有关Ago2在心力衰竭中的治疗作用、Ago2在糖尿病性心肌病中的治疗作用及相关的治疗药物用途的报道更是一片空白。

发明内容

发明人根据本领域客观存在的上述问题和不足，偶然发现了线粒体Ago2与心衰、糖尿病性心肌病的发生机制之间的关系，并进一步进行分子实验，开发出一种以线粒体Ago2为药物靶点的抗心衰药物和治疗糖尿病性心肌病的药物，同时进行动物实验验证其效果，发现高表达线粒体靶向的Ago2能显著改善小鼠心脏功能，治疗心力衰竭和糖尿病性心肌病。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途。

所述治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物的作用靶点为Ago2；

优选地，所述Ago2为线粒体靶向的Ago2；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2。

一种治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物，包含：药效活性成分；其特征在于，所述药效活性成分包含：高表达线粒体靶向的Ago2的物质。

所述高表达线粒体靶向的Ago2的物质选自：连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体、转化有连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体的转化体、依次连接了心肌特异性启动子、可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体、转化有依次连接了心肌特异性启动子、可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体的转化体；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2；

优选地，所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；

优选地，所述可定位线粒体的前导肽序列选自：Cox8，Su9，Sod2；

优选地，所述心肌特异性启动子选自：tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin；

优选地，所述连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体选自：连接了Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2、或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述转化体的宿主细胞选自：293细胞；

优选地，所述转化有连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体的转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述Cox8基因序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述Ago2基因序列如SEQ ID NO.2所示。

一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的蛋白，其特征在于，包含：可定位线粒体的前导肽序列和Ago2序列。

可定位线粒体的前导肽选自：Cox8，Su9，Sod2；

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的蛋白指由Cox8和Ago2组成的融合蛋白。

一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因，其特征在于，包含：可定位线粒体的前导肽基因序列和Ago2基因序列。

所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因还包含：心肌特异性启动子；

优选地，可定位线粒体的前导肽选自：Cox8，Su9，Sod2；

优选地，所述心肌特异性启动子选自：tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2；

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因选自：由Cox8基因序列和Ago2基因序列组成的基因、或，由心肌特异性启动子tnt序列、Cox8基因序列和Ago2基因序列组成的基因；

优选地，所述Cox8基因序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述Ago2基因序列如SEQ ID NO.2所示。

一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的重组表达载体，其特征在于，为连接了所述的一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因的序列的表达载体。

所述表达载体选自：为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的重组表达载体选自：连接了Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2，或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2。

一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的转化体，其特征在于，为转化有所述的一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的重组表达载体的宿主细胞。

所述宿主细胞选自：293细胞；

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-tnt-cox8-Ago2。

一种治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物的制备方法，其特征在于，表达由可定位线粒体的前导肽和Ago2组成的融合蛋白。

将可定位线粒体的前导肽的基因序列和Ago2的基因序列连接表达载体得到重组表达载体；

优选地，将心肌特异性启动子、可定位线粒体的前导肽的基因序列和Ago2的基因序列依次连接表达载体得到重组表达载体；

优选地，将重组表达载体转化宿主细胞得到转化体；

优选地，采用钙磷共转染法将重组表达载体转化宿主细胞得到转化体；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2；

优选地，所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；

优选地，所述可定位线粒体的前导肽序列选自：Cox8，Su9，Sod2；

优选地，所述心肌特异性启动子选自：tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin；

优选地，所述重组表达载体选自：连接了Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2、或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述Cox8基因序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述Ago2基因序列如SEQ ID NO.2所示。

在一些国家或地区的专利法允许的前提下，本发明还请求保护高表达线粒体靶向的Ago2的物质，或，可定位线粒体的前导肽序列和Ago2序列组成的融合蛋白、或，Cox8和Ago2组成的融合蛋白，或，连接了Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2，或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-tnt-cox8-Ago2在治疗心力衰竭或糖尿病性心肌病方面的应用。

本发明提供一种用于治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物，其特征在于，所述药物的药效成分包括以线粒体靶向的Ago2为药物靶点，能够增加线粒体靶向的Ago2的表达所述的物质。

所述药物的药效成分包括高表达线粒体靶向的Ago2的物质。

所述线粒体靶向的Ago2的物质包含线粒体靶向信号序列片段及Ago2序列片段，所述仅以cox8-Ago2的序列片段为例如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述药物还包括药学上可接受的辅料，和/或，用于缓冲、合成、和/或纯化所述序列片段的试剂。

一种用于治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物的制备方法，其特征在于，包括：将可高表达所述线粒体靶向的Ago2的物质作为治疗心衰或糖尿病性心肌病药物的活性成分。

将可表达Cox8-Ago2的序列片段插入表达载体，从而制备得到可稳定表达粒体靶向的Ago2的重组质粒。所述Cox8-Ago2的序列片段如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的一个目的在于提供一种用于治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物，所述药物的药效成分包括以线粒体靶向的Ago2为药物靶点，且通过高表达所述线粒体靶向的Ago2的物质起到治疗心衰或糖尿病性心肌病的药效。

高表达：即通过各种载体将含有线粒体定位序列的Ago2特异高表达于线粒体，可通过线粒体定位序列如Cox8，Su9，Sod2等前导信号将Ago2特异性高表达于线粒体；或通过线粒体靶向纳米颗粒递送Ago2进入线粒体；

以上述方式中的任一种皆可起到增加线粒体靶向的Ago2表达量的作用。任何规模的出于商业目的将上述各物质装入标有抗心衰用途的商品包装内的行为均落入本发明请求保护的范围。

进一步的，所述药物的药效成分包括高表达线粒体靶向的Ago2的物质。

进一步的，所述高表达线粒体靶向的Ago2的物质包含线粒体定位cox8的前导肽序列片段及Ago2的序列片段如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料，和/或，用于缓冲、合成、和/或纯化所述序列片段的试剂。本领域技术人员可根据客观需求，将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。

本发明的另一目的在于提供一种用于治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物的制备方法，包括：将高表达线粒体靶向的Ago2的物质作为治疗心衰或糖尿病性心肌病药物的活性成分。

在进一步的实施例中，所述制备方法包括：将可包含线粒体定位cox8的前导肽序列及Ago2的序列片段插入表达载体，从而制备得到可稳定表达的线粒体靶向的Ago2的重组质粒。

在具体的实施例中，所述包含线粒体定位cox8的前导肽序列及Ago2的序列片段的表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)。

为了实现心力衰竭或糖尿病性心肌病的基因治疗目的，本发明将线粒体靶向的cox8-Ago2与含心肌特异性启动子tnt的重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测获得满足治疗要求的高滴度，在动物实验中证实了其可以有效改善心力衰竭小鼠或糖尿病心肌病小鼠的心功能。因此，本发明基于上述发现和结果，提供一种以线粒体Ago2为治疗靶点的用于临床心力衰竭或糖尿病性心肌病治疗的药物。

本发明涉及一种用于治疗心力衰竭或糖尿病性心肌病的药物。所述抗心衰/抗糖尿病性心肌病药物涉及能特异性靶向线粒体的Ago2的重组腺相关病毒重组体 (rAAV-cox8-Ago2)的构建和制备方法，且通过高表达所述线粒体靶向的rAAV-Ago2起到所述治疗心力衰竭或抗糖尿病性心肌病的药效。本发明利用化学合成法构建pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2表达质粒，利用三种质粒磷酸钙共转染法包装制备含目的片段的重组腺相关病毒并纯化。经动物试验证实本发明提供的抗心衰、抗糖尿病性心肌病药物可显著改善心衰动物的心脏功能，起到有效的抗心衰或抗糖尿病性心肌病作用。

本发明基于靶向线粒体的cox8前导碱基序列及Ago2碱基序列，设计并合成了线粒体靶向Ago2的序列，并成功插入真核表达载体pAAV-D(+)中构成重组质粒 pAAV-D(+)-cox8-Ago2。之后，将以下三种质粒：1)pXX9质粒、2)phelper质粒、3)pAAV-D(+)-cox8-Ago2质粒，用钙磷共转染法分别转入293细胞包装制备能表达线粒体靶向的cox8-Ago2的重组腺相关病毒(rAAV9)，经纯化后，real-time PCR法测定滴度。下一步将包装制备的同一血清型的重组腺相关病毒(rAAV-cox8-Ago2)经尾静脉注射至主动脉结扎术(TAC)导致的心力衰竭模型小鼠中，发现小鼠心脏中线粒体Ago2的长期表达发生明显变化，说明重组腺相关病毒能介导线粒体Ago2的长期有效表达。超声及导管结果表明重组腺相关病毒介导的线粒体靶向Ago2表达能明显改善TAC小鼠的心功能，进一步支持线粒体靶向Ago2的抗心力衰竭作用。

同时，将包装制备的同一血清型的重组腺相关病毒(rAAV-cox8-Ago2)经尾静脉注射至1型糖尿病（链脲佐菌素STZ）和2型糖尿病（瘦素受体基因突变db/db）导致的心功能损害模型小鼠中，发现小鼠心脏中线粒体Ago2的长期表达发生明显变化，说明重组腺相关病毒能介导线粒体Ago2的长期有效表达。超声及导管结果表明重组腺相关病毒介导的线粒体靶向Ago2表达能明显改善糖尿病小鼠的心功能，进一步支持线粒体靶向Ago2的抗糖尿病心肌病作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示心力衰竭小鼠心脏线粒体定位的Ago2含量明显增加；其中，A为sham小鼠和TAC小鼠体内Ago2含量的western blot结果图；B为sham小鼠和TAC小鼠的Ago2含量的柱形图；图中标记含义如下：VDAC1表示为线粒体的内参蛋白；sham表示假手术对照组；TAC表示TAC导致的心力衰竭模型小鼠。

图2是显示pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的质粒构成；其中，tnt启动子代表心肌细胞特异性启动子，m-Ago2代表小鼠源Ago2。

图3是实验例2的Western blotting检测不同处理的TAC小鼠心脏中Ago2的表达情况；图中各标记含义列示如下：rAAV-tnt-GFP代表注射了特异性靶向心肌细胞的的表达GFP的重组腺相关病毒载体的TAC小鼠，rAAV-tnt-cox8-Ago2代表注射了特异性靶向心肌细胞且在线粒体内高表达Ago2的重组腺相关病毒载体的TAC小鼠，VDAC1表示为线粒体的内参蛋白；检测结果显示rAAV-tnt-cox8-Ago2可明显增加TAC小鼠心脏线粒体Ago2的表达。

图4是实验例2的心脏超声及导管监测rAAV-tnt-cox8-Ago2治疗对TAC小鼠心脏功能的影响，其中A为射血分数的柱形图，B为缩短分数的柱形图，C为等容收缩期左心室压力最大上升速率的柱形图，D为等容收缩期左心室压力最小上升速率的柱形图；结果显示rAAV-tnt-cox8-Ago2可明显增加TAC小鼠的心脏收缩功能及舒张功能。

图1-图4中各标记含义列示如下：rAAV-tnt-GFP代表注射了特异性靶向心肌细胞的表达GFP的重组腺相关病毒载体的TAC小鼠，rAAV-tnt-cox8-Ago2代表注射了特异性靶向心肌细胞且在线粒体内高表达Ago2的重组腺相关病毒载体的TAC小鼠；control代表注射生理盐水的作为空白对照的TAC小鼠；sham代表假手术对照小鼠，TAC代表TAC导致的心力衰竭模型小鼠。

图5为实验例3和4对糖尿病心肌病小鼠心脏线粒体定位的Ago2含量的westernblot结果图，其显示糖尿病心肌病小鼠心脏线粒体定位的Ago2含量明显降低；其中，A为对照小鼠和STZ诱导的1型糖尿病小鼠心脏线粒体Ago2含量的western blot结果图；B为对照小鼠和STZ小鼠的Ago2含量的柱形图；C为BKS对照小鼠和db/db 2型糖尿病小鼠心脏线粒体Ago2含量的western blot结果图；D为BKS对照小鼠和db/db小鼠的Ago2含量的柱形图；图中标记含义如下：VDAC1表示为线粒体的内参蛋白；Control表示对照组；STZ表示STZ导致的1型糖尿病模型小鼠；BKS表示db/db同窝对照正常小鼠，db/db代表基因突变导致的2型糖尿病模型小鼠

图6是实验例3的Western blotting检测不同处理的STZ小鼠心脏中Ago2的表达情况；图中各标记含义列示如下：rAAV-tnt-GFP代表注射了特异性靶向心肌细胞的表达GFP的重组腺相关病毒载体的STZ小鼠，rAAV-tnt-cox8-Ago2代表注射了特异性靶向心肌细胞且在线粒体内高表达Ago2的重组腺相关病毒载体的小鼠，VDAC1表示为线粒体的内参蛋白；检测结果显示rAAV-tnt-cox8-Ago2可明显增加STZ小鼠心脏线粒体Ago2的表达。

图7是实验例3的心脏超声及导管监测rAAV-tnt-cox8-Ago2治疗对STZ诱导的1型糖尿病小鼠心脏功能的影响的柱形图，其中A为射血分数的柱形图，B为缩短分数的柱形图，C为等容收缩期左心室压力最大上升速率的柱形图，D为等容收缩期左心室压力最小上升速率的柱形图；结果显示rAAV-tnt-cox8-Ago2可明显增加1型糖尿病小鼠的心脏收缩功能及舒张功能。图中各标记含义列示如下：rAAV-tnt-GFP代表注射了特异性靶向心肌细胞的表达GFP的重组腺相关病毒载体的STZ小鼠，rAAV-tnt-cox8-Ago2代表注射了特异性靶向心肌细胞且在线粒体内高表达Ago2的重组腺相关病毒载体的糖尿病小鼠；control代表注射生理盐水的作为空白对照的小鼠；STZ代表STZ导致的1型糖尿病模型小鼠。

图8是实验例4检测不同处理的db/db小鼠心脏中Ago2的Western blotting结果图；图中各标记含义列示如下：rAAV-tnt-GFP代表注射了特异性靶向心肌细胞的表达GFP的重组腺相关病毒载体的db/db小鼠，rAAV-tnt-cox8-Ago2代表注射了特异性靶向心肌细胞且在线粒体内高表达Ago2的重组腺相关病毒载体的db/db小鼠，VDAC1表示为线粒体的内参蛋白；检测结果显示rAAV-tnt-cox8-Ago2可明显增加db/db小鼠心脏线粒体Ago2的表达。

图9是实验例4的心脏超声及导管监测rAAV-tnt-cox8-Ago2治疗对db/db 2型糖尿病小鼠心脏功能的影响的柱形图，其中A为射血分数的柱形图，B为缩短分数的柱形图，C为等容收缩期左心室压力最大上升速率的柱形图，D为等容收缩期左心室压力最小上升速率的柱形图；结果显示rAAV-tnt-cox8-Ago2可明显增加2型糖尿病小鼠的心脏收缩功能及舒张功能。

图5-图9中各标记含义列示如下：rAAV-tnt-GFP代表注射了特异性靶向心肌细胞的表达GFP的重组腺相关病毒载体的db/db小鼠，rAAV-tnt-cox8-Ago2代表注射了特异性靶向心肌细胞且在线粒体内高表达Ago2的重组腺相关病毒载体的db/db小鼠；BKS代表同窝对照的小鼠；db/db代表基因突变导致的2型糖尿病模型小鼠。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例或实验例涉及到的仪器设备、试剂与耗材及生物材料的来源如下：

1）仪器设备

Nanodrop® ND-1000核酸分析仪、ABI 9700 PCR仪、ABI 7900HT荧光实时定量PCR仪、Beckman X-15R低温高速离心机；

2）试剂与耗材

链脲佐菌素STZ(购自Sigma)、RNasey Mini Kit试剂盒（购自Qiagen）、TRIZOL（购自Invitrogen公司）、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自TaKaRa公司）、E.Z.N.A.® Endo-Free Plasmid Maxi Kit（质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司）、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit（质粒提取试剂盒，购自北京全式金公司）；真核表达载体pAAV-D(+)由合作的肖啸教授构建并赠予，cox8-Ago2DNA序列片段由武汉科锐斯特生物有限公司合成。

生物材料的来源：

C57背景小鼠购自北京华阜康公司；

BKS鼠及db/db小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司；

293T细胞来自美国ATCC公司。

第1组实施例、Ago2的制药用途

本组实施例提供Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途。

在具体的实施例中，所述治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物的作用靶点为Ago2；

优选地，所述Ago2为线粒体靶向的Ago2；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2。

第2组实施例、本发明治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物

本组实施例提供一种治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述药物包含：药效活性成分；所述药效活性成分包含：高表达线粒体靶向的Ago2的物质。

在一些实施例中，所述高表达线粒体靶向的Ago2的物质选自：连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体、转化有连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体的转化体、依次连接了心肌特异性启动子、可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体、转化有依次连接了心肌特异性启动子、可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体的转化体；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2；

优选地，所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；

优选地，所述可定位线粒体的前导肽序列选自：Cox8，Su9，Sod2；

前导肽Cox8为“Double deletion of PINK1 and Parkin impairs hepaticmitophagy and exacerbatesacetaminophen-induced liver injury in mice”一文记载的Cox8；

前导肽Su9为“MicroRNA directly enhances mitochondrial translationduring muscle differentiation”一文记载的Su9；

前导肽Sod2为“Specific elimination of mutant mitochondrial genomes inpatient-derived cells bymitoTALENs”一文记载的Sod2。

优选地，所述心肌特异性启动子选自：tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin；

tnt为“Nuclear miR-320 Mediates Diabetes-Induced Cardiac Dysfunctionby Activating Transcription of Fatty AcidMetabolic Genes to CauseLipotoxicity in the Heart”一文记载的tnt；

α-MHC为“Deletion of BCATm increases insulin-stimulated glucoseoxidation in the heart”一文记载的α-MHC；

MLC-2v为“Molecular In Vivo Imaging Using a Noninvasive Cardiac-Specific MLC-2v Promoter Driven Dual-Gene RecombinantLentivirus MonitoringSystem”一文记载的MLC-2v；

Desmin为“Muscle-Specific Promoters for Gene Therapy”一文记载的Desmin。

本文中，心衰、心力衰竭均具有本领域技术人员所熟知的常规技术含义，均为“心力衰竭”一词所表达的普通技术含义。

糖尿病心肌病、糖尿病性心肌病均具有本领域技术人员所熟知的常规技术含义，均为“糖尿病性心肌病”一词所表达的普通技术含义。

优选地，所述连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体选自：连接了Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2、或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述转化体的宿主细胞选自：293细胞；

优选地，所述转化有连接了可定位线粒体的前导肽序列和Ago2基因序列的表达载体的转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述Cox8基因序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述Ago2基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本组实施例提供了一种用于治疗心力衰竭的药物，所述治疗心力衰竭的药物的药效成分以线粒体Ago2为药物靶点，且通过高表达所述线粒体靶向的Ago2起到所述治疗心力衰竭的药效。本发明通过一些实验发现，心力衰竭小鼠心脏线粒体定位的Ago2含量明显增加（图1），这表明线粒体内的Ago2可能在心力衰竭病理生理过程中起调控作用，并进一步进行小鼠实验，通过增加线粒体Ago2的含量，可明显改善TAC小鼠的心脏射血分数（图4A），从而实现增强心脏功能，达到心衰治疗目的的作用。

本发明还通过另一些实验发现，STZ 1型糖尿病和db/db 2型小鼠心脏线粒体定位的Ago2含量明显降低（图5），这表明线粒体内的Ago2可能在糖尿病心肌病病理生理过程中起调控作用，并进一步进行小鼠实验，通过增加线粒体Ago2的含量，可明显改善STZ及db/db糖尿病小鼠的心脏射血分数（图9A，7A），从而实现增强心脏功能，达到糖尿病心肌病治疗目的的作用。

发明人基于心衰/糖尿病心肌病的临床治疗领域的多年研究经验，推测Ago2极有可能在心衰或糖尿病心肌病的发生发展中扮演至关重要的作用，并开展了相关实验。

本发明通过实验发现TAC心衰小鼠中的线粒体Ago2水平显著高，而在TAC心衰小鼠中过表达线粒体Ago2又能抗心衰，基于发明人在临床研发中的多年经验，推测前后两者的逻辑关联可能如下：在心衰中，线粒体Ago2蛋白的增加说明线粒体Ago2在心衰中可能起重要作用。但是这种升高是代偿性的保护作用还是破坏作用，需要进行后续的功能研究。在功能研究中本发明发现线粒体Ago2过表达能够治疗心衰，说明心衰中的升高的线粒体Ago2起代偿性的保护作用，只是力度不够大，需要更大量的过表达才能放大保护作用。

本发明通过实验发现在两种糖尿病心肌病的小鼠心脏中，线粒体Ago2水平降低。而在糖尿病心肌病小鼠中过表达线粒体Ago2能够抗糖尿病心肌病。基于发明人在临床研发中的多年经验，推测前后两者的逻辑关联可能如下：在糖尿病中，线粒体Ago2蛋白的降低说明线粒体Ago2在糖尿病中可能起重要作用。但是这种降低是代偿性的保护作用还是破坏作用，需要进行后续的功能研究。在功能研究中本发明发现线粒体Ago2过表达能够抗糖尿病心肌病，说明抗糖尿病心肌病中降低的线粒体Ago2可能是糖尿病心肌病病情进展的原因，经过外源性补充Ago2可以起到保护心脏的作用。

因此，在心衰和糖尿病心肌病的小鼠中，虽然线粒体Ago2的变化趋势不一致（原因尚不清楚，需要进一步研究），但过表达线粒体Ago2均能够提高心脏功能。说明本发明发现的线粒体Ago2过表达能够起到治疗心衰和糖尿病心肌病的作用。

进一步地，所述药物的药效成分包括可增加线粒体靶向的Ago2的物质。本领域技术人员熟知，可在Ago2序列前加上线粒体定位信号，从而达到特异性增加线粒体Ago2的表达进而起到治疗作用，也可采用其它手段，例如某些线粒体靶向纳米颗粒，直接将Ago2递送至线粒体，也可同样达到增加Ago2线粒体水平的目的。

优选地，所述药物的药效成分包含线粒体靶向的Ago2序列片段。分子生物学中最常见的方式就是在目的序列片段前加上线粒体定位信号序列，使Ago2转运至线粒体，起治疗的作用。Cox8线粒体信号肽是常用的一种线粒体定位信号，所述co8-Ago2的序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

在本发明一些可替换的实施例中，一些其他的线粒体定位信号序列，例如Su9，Sod2等前导序列，也能够将Ago2特异性递送至线粒体，包含这些前导序列的Ago2的重组质粒具有与下面实验例2相类似或等同的抗心衰效果，鉴于篇幅有限，本文中不再一一赘述。

在本发明一些可替换的实施例中，一些其他种属的Ago2序列片段，例如人源Ago2、大鼠源Ago2等序列，这些序列与小鼠Ago2基因序列高度同源，包含这些种属的Ago2的重组质粒具有与下面实验例2相类似或等同的抗心衰效果，鉴于篇幅有限，本文中不再一一赘述。

在本发明一些可替换的实施例中，一些重组腺相关病毒质粒pAAV-D(+)的其他启动子，例如α-MHC、MLC-2v、Desmin等序列，这些序列同tnt一样均可达到使重组腺相关病毒载体特异性性靶向心肌的效果，包含这些启动子序列的pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组质粒具有与下面实验例2相类似或等同的抗心衰效果，鉴于篇幅有限，本文中不再一一赘述。

在本发明最具体的一个实施例中，所述药物的药效成分为表达线粒体靶向小鼠Ago2的重组腺相关病毒质粒pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2；本发明采用的重组腺相关病毒载体(rAAV)克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，它可以携带目的基因转染分裂期和非分裂期细胞(即具有广泛的转基因范围)、无副作用(无免疫源性)、感染效率高、能驱动目的基因在体内长期表达，而且成功地解决了无腺病毒污染的体外大量复制问题，从而成为基因治疗最有前途的载体。

更具体地，所述cox8线粒体引导序列及mus-Ago2序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示插入至腺病毒表达载体pAAV-D(+)中构建出 pAAV-D(+)-tnt-cox-Ago2质粒进行表达。上述双链核苷酸序列由武汉科锐斯特生物有限公司合成并插入载体pAAV-D(+)中。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料，和/或，用于缓冲、培养、和/或扩繁所述重组腺相关病毒质粒pAAV-D(+)-cox8-Ago2的试剂；本领域技术人员可根据客观需求，将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。

第3组实施例、本发明的蛋白

本组实施例提供一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的蛋白。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的蛋白包含：可定位线粒体的前导肽序列和Ago2序列。

在一些实施例中，可定位线粒体的前导肽选自：Cox8，Su9，Sod2；

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的蛋白指由Cox8和Ago2组成的融合蛋白。

第4组实施例、本发明的基因

本组实施例提供一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述基因包含：可定位线粒体的前导肽基因序列和Ago2基因序列。

在进一步的实施例中，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因还包含：心肌特异性启动子；

优选地，可定位线粒体的前导肽选自：Cox8，Su9，Sod2；

优选地，所述心肌特异性启动子选自：tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2；

本文中的m-Ago2、mus-Ago2均代表小鼠源Ago2。

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因选自：由Cox8基因序列和Ago2基因序列组成的基因、或，由心肌特异性启动子tnt序列、Cox8基因序列和Ago2基因序列组成的基因；

优选地，所述Cox8基因序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述Ago2基因序列如SEQ ID NO.2所示。

第5组实施例、本发明的重组表达载体

本组实施例提供一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的重组表达载体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的重组表达载体为连接了第4组实施例任意一项所提供的一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的基因的序列的表达载体。

在具体的实施例中，所述表达载体选自：为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的重组表达载体选自：连接了Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2，或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2。

第6组实施例、本发明的转化体

本组实施例提供一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的转化体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的转化体为转化有第5组实施例任意一项所提供的一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的重组表达载体的宿主细胞。

在一些实施例中，所述宿主细胞选自：293细胞；

优选地，所述一种具有治疗心衰或糖尿病性心肌病效果的转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-tnt-cox8-Ago2。

第7组实施例、本发明药物的制备方法

本组实施例提供一种治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：表达由可定位线粒体的前导肽和Ago2组成的融合蛋白。

在一些实施例中，将可定位线粒体的前导肽的基因序列和Ago2的基因序列连接表达载体得到重组表达载体；

优选地，将心肌特异性启动子、可定位线粒体的前导肽的基因序列和Ago2的基因序列依次连接表达载体得到重组表达载体；

优选地，将重组表达载体转化宿主细胞得到转化体；

优选地，采用钙磷共转染法将重组表达载体转化宿主细胞得到转化体；

优选地，所述Ago2选自：人源Ago2、大鼠源Ago2、小鼠源Ago2；

优选地，所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；

优选地，所述可定位线粒体的前导肽序列选自：Cox8，Su9，Sod2；

优选地，所述心肌特异性启动子选自：tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin；

优选地，所述重组表达载体选自：连接了Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2、或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、Cox8基因序列、Ago2基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-cox8-Ago2，或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-cox8-Ago2的重组腺相关病毒rAAV-tnt-cox8-Ago2；

优选地，所述Cox8基因序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，所述Ago2基因序列如SEQ ID NO.2所示。

在本组一些具体的实施例中，将可高表达线粒体靶向的物质-包含cox8线粒体定位信号的Ago2的序列片段的重组腺相关病毒质粒pAAV-D(+)-cox8-Ago2作为所述抗心衰药物的活性成分。

进一步地，采取全基因合成技术合成mus-cox8-Ago2双链核苷酸并克隆在pAAV-D(+)载体上，从而制备得到可稳定表达线粒体靶向的Ago2重组质粒。更进一步的具体方案中，所述可表达线粒体靶向的cox8-Ago2序列片段如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)。

本组实施例的具体实验操作步骤可参看实验例1。

下面通过实验例来进一步验证和说明本发明的技术效果。

实验例1、重组腺相关病毒的构建

1. pAAV-D(+)载体构建

依据线粒体引导序列Cox8及mus-Ago2（小鼠来源的Ago2）的碱基序列，采取全基因合成技术合成cox8-Ago2双链核苷酸并克隆在pAAV-D(+)载体上(图2)，双链核苷酸由武汉科锐斯特生物有限公司合成。cox8、Ago2序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.质粒转化

将pAAV-D(+)-cox8-Ago2质粒加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min；42℃加热45sec后，再在冰中放置1min；加入500μl无抗生素LB培养基，37℃100rpm振荡培养60min；在Amp+的LB平板培养基上培养，挑选白色单克隆菌落鉴定。

3.质粒小提

挑取单克隆菌落，加入到3ml Amp+的LB液体培养基中，37℃280rpm振荡培养过夜。使用北京全式金公司EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒，具体操作步骤如下：1.取1.5ml过夜培养的细菌10,000g离心1min，尽量吸尽上清；2.加入250μl无色溶液RB(含RNaseA)，震荡悬浮细菌沉淀；3.加入250μl蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液；4.加入350μl黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置 2min；5.15,000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中；6.15,000g离心1min，弃流出液；7.加入650μl溶液WB，15,000g离心1min，弃流出液；8.15,000g离心2min，彻底去除残留的WB；9.将吸附柱置于新Ep管中，在柱中央加入20μl 70℃预热的EB，室温静置1min；10.10,000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃保存。

4.质粒大提

准备1L的无菌锥形瓶，加入300ml无菌LB培养基，加氨苄青霉素溶液至终浓度为100μg/ml。分别加入50μl所需质粒(pXX9、phelper、pAAV-D(+)-GFP、pAAV-D(+)-cox8-Ago2)，280rpm，37℃过夜培养。按照OMEGA公司 Endo-Free Plasmid Maxi Kit说明书操作，提取质粒，具体步骤如下：1.室温下5000g离心10min收集细菌；2.弃培养基，加入10mlSolution I/RNase A混合液，漩涡震荡完全重悬；3.重悬混合液中加入10mlSolution II，轻轻颠倒混匀10-15次后，室温放置。

5.rAAV介导的病毒包装

293T细胞生长至90％，钙磷转染前1-2hr，每个培养皿换新鲜培养基(含血清)12-15ml，在50ml离心管内先加入氯化钙(CaCl2 )，再加入质粒，形成Ca-DNA混合液，充分混匀，向 Ca-DNA混合液中缓慢滴加2XHEBS BUFFER，形成Ca-DNA-P混合液，一边加2XHEBS一边振荡离心管，充分混匀形成钙磷颗粒。8-12hr后，换18-20ml无血清培养基，72hr后，吸弃培养基，用PBS洗3遍，每个培养皿中加入Tris+NaCl(pH 8.5)1ml，用刮匙刮取细胞，收集于干净离心管，-80℃冻存。

6.病毒纯化

将冻存于-80℃的细胞取出，在37℃解冻溶解，反复冻融4次，8,000g离心15min，将上清放至干净离心管，弃细胞沉淀。用-20℃预冷的无水乙醇与rAAV以3∶1的体积比充分混匀，-20℃冰箱放置2hr后，4℃，13,000rpm离心15min，弃上清；乙醇挥发后，加入相应体积Tris+NaCl(pH 8.5)溶解沉淀。用Millipore小滤器(0.22μm)过滤。

7.病毒滴度测定

样品处理：

rAAV病毒液40μl

蛋白酶K(20mg/ml)5μl

55℃，反应1hr；

酚：氯仿：异戊醇45μl

4℃，12,000g离心5min回收水相；

氯仿45μl

4℃，12,000g离心5min回收水相。

Real-time PCR：

Primer 1(10μm)0.4μl

Primer 2(10μm)0.4μl

SYBR Green I Mix 10μl

ddH

Template 1μl

95℃30sec---(95℃5sec---60℃5sec---72℃20sec)×40个循环---MeltingCurve

实验例2、以rAAV9型表达cox8-Ago2的重组腺相关病毒为例检测其对心力衰竭的治疗作用

1.TAC小鼠心脏线粒体Ago2表达的检测：

采用8周龄的C57小鼠，行TAC手术：胸主动脉结扎术(Transverse AorticConstriction，TAC)及假手术对照组，至实验终点(4周后)时采用碧云天组织线粒体提取试剂盒提取心肌线粒体采用Western blot法检测TAC小鼠心脏中线粒体Ago2的表达情况，结果显示：TAC小鼠心脏线粒体Ago2含量明显增加（图1）。

采用8周龄的C57小鼠，通过尾静脉分别注射rAAV-tnt-cox8-Ago2和对照rAAV-tnt-GFP病毒，病毒滴度1×10

2.TAC小鼠心功能检测：实验终点时采用心脏超声检测TAC小鼠心功能，方法如下：

使用仪器为配有30MHz高频探头的超声仪。在使用异氟烷麻醉小鼠后，将小鼠仰卧放置于检测平台，沿小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室二维图像，同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期M型超声影像，根据采集的影像使用软件分析结果，得到心脏超声检测心脏血流动力学指标，经相关软件分析后计算出下列指标：包括心率 (Heart rate ,HR)、左室舒张期内径(LeftVentricular Internal Dimension，diastole，LVIDd)、左室收缩期内径(Left Ventricular Internal Dimension，systole，LVIDs)、左室后壁舒张期厚度(LeftVentricular Posterior Wall，diastole，LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(Left Ventricular Posterior Wall，systole，LVPWs)、室间隔舒张期厚度(Interventricularseptal thickness，diastole，IVSd)、室间隔收缩期厚度(Interventricular septal thickness，systole，IVSs)、射血分数 (EjectionFraction，EF)以及缩短分数(Fractional Shortening，FS)等。结果显示：rAAV-cox8-Ago2处理可明显改善TAC小鼠的心脏功能(图4)。

实验例3、以rAAV9型表达cox8-Ago2的重组腺相关病毒为例检测其对STZ诱导的1型糖尿病引起的心功能损伤的治疗作用

1. STZ小鼠心脏线粒体Ago2表达的检测：

STZ溶液的配制：将STZ溶于柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成8 mg/mL浓度的STZ溶液，采用8周龄的C57小鼠，术前12h禁食模型组小鼠按照40mg/kg 剂量的STZ 进行腹腔注射，连续注射5天，对照组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液。STZ注射完成3天后，测空腹血糖，选择血糖高于16.7 mmol/L纳入正式实验。采用碧云天组织线粒体提取试剂盒提取心肌线粒体行Western blot法检测STZ小鼠心脏中线粒体Ago2的表达情况，结果显示：STZ小鼠心脏线粒体Ago2含量明显降低（图5A、B）。

采用8周龄的C57小鼠，进行STZ造模，造模成功后，通过尾静脉分别注射rAAV-tnt-cox8-Ago2和对照rAAV-tnt-GFP病毒，病毒滴度1×10

2. STZ小鼠心功能检测：实验终点时采用心脏超声检测STZ小鼠心功能，方法如下：

使用仪器为配有30MHz高频探头的超声仪。在使用异氟烷麻醉小鼠后，将小鼠仰卧放置于检测平台，沿小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室二维图像，同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期M型超声影像，根据采集的影像使用软件分析结果，得到心脏超声检测心脏血流动力学指标，经相关软件分析后计算出下列指标：包括心率 (Heart rate ,HR)、左室舒张期内径(LeftVentricular Internal Dimension，diastole，LVIDd)、左室收缩期内径(Left Ventricular Internal Dimension，systole，LVIDs)、左室后壁舒张期厚度(LeftVentricular Posterior Wall，diastole，LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(Left Ventricular Posterior Wall，systole，LVPWs)、室间隔舒张期厚度(Interventricularseptal thickness，diastole，IVSd)、室间隔收缩期厚度(Interventricular septal thickness，systole，IVSs)、射血分数 (EjectionFraction，EF)以及缩短分数(Fractional Shortening，FS)等。结果显示：rAAV-cox8-Ago2处理可明显改善STZ小鼠的心脏功能(图7)。

实验例4、以rAAV9型表达cox8-Ago2的重组腺相关病毒为例检测其对2型糖尿病引起的心功能损伤的治疗作用

1. db/db小鼠心脏线粒体Ago2表达的检测：

采用碧云天组织线粒体提取试剂盒提取心肌线粒体行Western blot法检测db/db小鼠及其同窝对照BKS小鼠心脏中线粒体Ago2的表达情况，结果显示：db/db小鼠心脏线粒体Ago2含量明显降低（图5C、D）。

采用8周龄的BKS及db/db小鼠，通过尾静脉分别注射rAAV-tnt-cox8-Ago2和对照rAAV-tnt-GFP病毒，病毒滴度1×10

2. db/db小鼠心功能检测：实验终点时采用心脏超声检测db/db小鼠心功能，方法如下：使用仪器为配有30MHz高频探头的超声仪。在使用异氟烷麻醉小鼠后，将小鼠仰卧放置于检测平台，沿小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室二维图像，同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期M型超声影像，根据采集的影像使用软件分析结果，得到心脏超声检测心脏血流动力学指标，经相关软件分析后计算出下列指标：包括心率 (Heart rate ,HR)、左室舒张期内径(LeftVentricular Internal Dimension，diastole，LVIDd)、左室收缩期内径(Left Ventricular Internal Dimension，systole，LVIDs)、左室后壁舒张期厚度(LeftVentricular Posterior Wall，diastole，LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(Left Ventricular Posterior Wall，systole，LVPWs)、室间隔舒张期厚度(Interventricularseptal thickness，diastole，IVSd)、室间隔收缩期厚度(Interventricular septal thickness，systole，IVSs)、射血分数 (EjectionFraction，EF)以及缩短分数(Fractional Shortening，FS)等。结果显示：rAAV-cox8-Ago2处理可明显改善db/db小鼠的心脏功能(图9)。