洋葱伯克霍尔德氏菌在促进植物耐盐碱及降低重金属镉含量中的应用

摘要

本发明公开了洋葱伯克霍尔德氏菌在促进植物耐盐碱及降低重金属镉含量中的应用。本发明研究显示，洋葱伯克霍尔德菌JT79菌株具有很好的耐盐碱性和降低重金属镉含量的能力，能够在高盐碱、含镉培养基中正常生长；JT79菌株能显著提高大豆和玉米抗盐碱胁迫的能力，促进大豆和玉米的生长发育，同时能高效地降低镉含量。表明JT79菌同时具有耐盐碱、促生、耐镉且能降低镉含量的作用，能有效缓解盐碱胁迫下植物营养生长过程受抑制的情况，能防治土壤重金属镉污染，提高植株的耐盐碱和耐镉能力，促进植物生长。本发明为盐碱地的利用和防治土壤镉毒、降低镉含量提出了新的方法和思路，提供具有更好耐盐碱、耐镉且促生的优良菌种资源。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及洋葱伯克霍尔德氏菌在促进植物耐盐碱及降低重金属镉含量中的应用。

背景技术

土壤盐碱化是指易溶性盐分在土壤表层积累的现象或过程，表现为土壤有机质含量相对降低，使土壤营养条件变差，土壤微生物活动受到盐碱的抑制。盐碱对作物的危害，一方面是间接改变土壤的理化性状，使植物失去良好的生活环境和营养条件；另一方面是通过土壤溶液直接危害作物细胞，影响作物正常的吸收和代谢机能。盐碱化土壤环境极易造成作物根系因外界渗透压过高脱水，甚至腐蚀根系，加速根系死亡，从而导致作物成片枯萎，颗粒无收，只有极少数耐盐碱作物能在盐碱地生存。

重金属镉的环境污染问题自20世纪20年代就已伴随电解锌生产而开始出现，土壤镉污染的主要来源是采矿、冶炼、电镀及基础化工业的废水、废气和废渣，施用含镉化肥、农药以及农用污泥也是土壤镉污染的重要来源。而长期施用化学肥料导致土壤硬化、土壤重金属污染和水体富营养化等土壤生态问题越来越严重。同时大量的化学农药被用于防控各种病害，导致植物病原菌的抗性越来越强，而且也导致农药残留等严峻问题。

目前在缓解植物盐碱化胁迫、防治重金属镉的对环境污染中，除了采用化学制剂中和盐碱，转化和吸附土壤中的重金属镉，还能利用微生物进行修复和防治，具有可持续性和环境友好性。洋葱伯克霍尔德氏菌作为一种较新型的优良生防菌类，可以分泌多种防病促生的物质，对防治多种病害，以及促进多种植物的生长都有明显的效果。国内已有专利报道洋葱伯克霍尔德氏菌在植物促生和生物防治上具有巨大的开发潜力。例如中国专利CN112625970A公开了一株洋葱伯克霍尔德氏菌，该菌可以稳定定殖在土壤中，可以防治棉花黄萎病菌、菜心炭疽病菌等十余种病害；但是，洋葱伯克霍尔德氏菌对植物缓解土壤盐碱胁迫以及防治重金属镉对环境污染方面的作用鲜有报道，目前也缺少能够用于植物缓解土壤盐碱胁迫以及能够防治重金属镉对环境污染的微生物菌株。在开展植物耐土壤盐碱化、防止重金属镉对环境污染的研究中，筛选耐盐碱、耐镉的微生物菌株是十分必要的，为植物抗盐碱胁、土壤镉含量的降低提供有效手段，和更多的优良菌种资源，也对土壤镉毒的处理也具有重大的意义。

发明内容

本发明提供洋葱伯克霍尔德氏菌在促进植物耐盐碱及降低重金属镉含量中的应用。

本发明另一目的是提供一种促进植物抗盐碱胁迫的方法。

本发明又一目的是提供一种降低样品镉含量的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79菌株的新用途，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。研究显示，洋葱伯克霍尔德菌JT79菌株具有很好的耐盐碱性和降低重金属镉含量的能力，能够在高盐碱以含重金属镉的培养基中正常生长；并且JT79菌株能显著提高大豆和玉米抗盐碱胁迫的能力，促进大豆和玉米的生长发育，表明JT79菌株能够有效缓解盐碱胁迫下植物营养生长过程受抑制的情况，提高植株的耐盐碱能力，促进植物生长。同时，采用JT79菌株对含镉培养基处理72h就能降低80％以上的镉含量，表明JT79菌株对土壤镉毒具有较高的降低作用，能够用于防治土壤重金属镉污染，提高植株的耐镉能力。

因此，以下应用均在本发明的保护范围内：

洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株和/或其菌液在促进植物抗盐碱胁迫或降低镉含量中的应用。

洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株和/或其菌液在制备提高植物抗盐碱性制剂或降低镉含量制剂中的应用。

洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株和/或其菌液在防治土壤重金属镉污染中的应用。

洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株和/或其菌液在盐碱胁迫下促进植物生长中的应用。

洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株和/或其菌液在制备耐盐碱和/或促生剂中的应用。

本发明提供一种促进植物抗盐碱胁迫的方法，采用洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株和/或其菌液对植物进行处理。

进一步地，所述菌液为发酵液。

本发明提供的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液的制备方法为：将菌株活化后取单菌落接种在LB培养基中，在30℃培养48h，获得种子液，然后将种子液和液体培养基混合，培养48h，即得。

优选地，所述LB培养基的配方为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，无菌水定容至1L。

优选地，所述液体培养基为LB培养基或NB培养基。

更有选地，所述LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，无菌水定容至1L；NB培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、无菌水定容至1L。

优选地，所述种子液和液体培养基的体积比为1：10。

优选地，所述发酵液的浓度不低于2×10

优选地，将发酵液稀释5～50倍使用。

更优选地，发酵液稀释25倍使用。

优选地，所述处理方法为进行灌根。

优选地，所述植物为大豆、玉米。

本发明还一种降低样品镉含量的方法，采用洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液对含镉培养液进行处理。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79菌株的新用途，本发明研究显示，洋葱伯克霍尔德菌JT79菌株具有很好的耐盐碱性，耐重金属镉的特性，能够在高盐碱以及含镉培养基中正常生长；并且显示JT79菌株能有效防治高盐碱对作物的危害并促进作物生长发育，能显著提高大豆和玉米抗盐碱胁迫的能力，并促进大豆和玉米的生长发育，增加植物株高分、侧根数、地上部鲜重、地下部鲜重。表明JT79菌株能够有效缓解盐碱胁迫下植物营养生长过程受抑制的情况，提高植株的耐盐碱能力，促进植物生长。同时，JT79菌株具有能明显降低镉含量的作用，在采用JT79菌液及其25倍稀释液对含镉样品处理72h就能降低80％以上的镉含量，表明JT79菌株对样品镉含量具有高效的降低作用，能够用于防治土壤重金属镉污染，提高植株的耐镉能力。本发明为盐碱地的利用和防治重金属镉对环境污染提出了新的方法和思路，提供了具有更好耐盐碱耐镉且能够促生的优良菌种资源，以供生产选择。

附图说明

图1为JT79菌株在含盐碱培养基上的菌落形态。

图2为JT79对大豆盐碱胁迫的处理作用(A：株高；B：须根数；C：地上部鲜重；D：地下部鲜重。CK：清水处理；SA：盐碱处理；SA+Bc：盐碱处理加JT79发酵液；SA+Bc×5：盐碱处理加JT79发酵液的5倍稀释液；SA+Bc×25：盐碱处理加JT79发酵液的25倍稀释液；SA+Bc×50：盐碱处理加JT79发酵液的50倍稀释液)。

图3为JT79对玉米盐碱胁迫的处理效果(A：株高；B：侧根数；C：地上鲜重；D：地下鲜重。CK：清水处理；SA：盐碱处理；SA+Bc：盐碱处理加JT79发酵液；SA+Bc×5：盐碱处理加JT79发酵液的5倍稀释液；SA+Bc×25：盐碱处理加JT79发酵液的25倍稀释液；SA+Bc×50：盐碱处理加JT79发酵液的50倍稀释液)。

图4为JT79菌体悬浮液对大豆盐碱胁迫的处理效果(CK：清水处理；SA：盐碱处理；SA+Bc(Solution)：盐碱处理加JT79发酵液；SA+Bc(Thallus)：盐碱处理加JT79的菌体悬浊液)。

图5为JT79菌体悬浮液对大豆盐碱胁迫的促生效果图(从左到右依次为非盐碱处理，盐碱处理，盐碱+菌液处理，盐碱+菌体处理)。

图6为JT79菌株在含镉培养基上的耐受性试验结果图。

图7为JT79发酵液处理前后镉含量的检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1洋葱伯克霍尔德菌JT79发酵液的制备

本实施例采用的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79菌株为本发明课题组保存菌株，已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。

将-80℃下保存的菌株活化，挑取活化后的菌落在LB液体培养基(酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.2)，在121℃下灭菌15min，30℃培养48h，获得种子液。

按照含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液和液体培养基体积比为1:10将含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液加入NB液体培养基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加无菌水定容至1L)中，在30℃、180r/min下培养48h，得到洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液。其中，洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的发酵液浓度为2×10

实施例2洋葱伯克霍尔德菌JT79盐碱培养基耐受性试验

1、盐碱培养基的制备

NA固体盐碱培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂20g、0.06mM盐碱，pH 9.0、加无菌水定容至1L，在121℃下灭菌15min。

2、试验处理

在超净工作台将含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的发酵液适当稀释后，取200μL，用涂布棒均匀涂开于NA固体盐碱平板上，待完全阴干后用封口膜封好平板，并置于室温培养箱，每天观察记录菌落生长情况，并用NA固体培养基作对照。

3、结果分析

结果如图1所示，洋葱伯克霍尔德菌JT79具有很好的耐盐碱性，在0.06mM、pH＝9.0的盐碱下也能正常生长。

实施例3洋葱伯克霍尔德菌发酵液对大豆的抗盐碱胁迫促生效果

将15株长势相同的大豆幼苗培养生长至4片叶片后，移入直径6cm，高12cm的盆栽容器内，各添加100g基质土进行种植，定植2天后进行处理。设置五个实验处理，每个处理3个重复：

处理一：非盐碱处理，浇灌20mL无菌水。

处理二：盐碱处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和10mL无菌水。

处理三：盐碱+菌液处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)，再加入10mL JT79发酵液。

处理四：盐碱+菌液稀释处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和加入10mLJT79的5倍稀释菌液。

处理五：盐碱+菌液稀释处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和加入10mLJT79的25倍稀释菌液。

处理六：盐碱+菌液稀释处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和加入10mLJT79的50倍稀释菌液。

将经过上述各组处理后的将植物放在温室培养，每隔7天处理1次，完成培养30天后，测量植株的株高、侧根数、地上部分鲜重以及地下部分鲜重。

实验结果如图2所示，与对照处理一相比，在盐碱处理下，大豆的株高、侧根数、地上地下部鲜重分别下降了60.23％，66.71％，40.52％，50.23％，差异显著。在大豆盐碱胁迫下，添加JT79发酵液原液以及5倍、25倍、50倍稀释液处理下，大豆的株高分别增加3.71％，81.82％，20.37％，64.81％；侧根数分别增加30.31％，42.42％，96.97％，81.82％；地上部鲜重分别增加48.38％，33.79％，38.63％，49.66％；地下部鲜重分别增加-8.9％，23.64％，47.13％，61.97％，表明洋葱伯克霍尔德菌JT79的发酵液的添加能够缓解大豆的盐碱胁迫，从而促进大豆的生长。

实施例4洋葱伯克霍尔德菌发酵液对玉米的抗盐碱胁迫促生效果

将15株长势相同的玉米幼苗培养生长至4片叶片后，移入直径6cm，高12cm的盆栽容器内，各添加100g基质土进行种植，定植2天后进行处理。设置五个实验处理，每个处理3个重复：

处理一：非盐碱处理，浇灌20mL无菌水。

处理二：盐碱处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和10mL无菌水。

处理三：盐碱+菌液处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)，再加入10mL JT79菌液。

处理四：盐碱+菌液稀释处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和加入10mLJT79的5倍稀释菌液。

处理五：盐碱+菌液稀释处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和加入10mLJT79的25倍稀释菌液。

处理六：盐碱+菌液稀释处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和加入10mLJT79的50倍稀释菌液。

将经过上述各组处理后的植物放在温室培养，每隔7天处理1次，完成培养30天后，测量植株的株高、侧根数、地上部分鲜重以及地下部分鲜重。

实验结果如图3所示，显示对照处理一相比，在盐碱处理下，玉米的株高、侧根数、地上地下部鲜重都下降了40％，盐碱条件严重抑制玉米生长。在玉米经盐碱处理后，添加JT79发酵液原液以及5倍、25倍、50倍稀释液处理后，玉米的株高分别增加0％，47.06％，58.82％，11.76％；侧根数分别增加2条，4条，4条，1条；地上部鲜重分别增加19.67％，87.83％，133.35％，31.65％；地下部鲜重分别增加-7.39％，28.24％，72.36％，11.82％。其中，菌液稀释25倍后的促生效果为最佳，在JT79发酵液25倍稀释液处理下，株高、侧根数、地上地下部鲜重分别为13.5cm，4条须根，0.3275g，0.4996g。与处理一差异不显著。

实施例5JT79菌体悬浮液的抗胁迫促生效果

将12株长势相同的大豆幼苗培养生长至4片叶片后，移入直径6cm，高12cm的盆栽容器内，各添加100g基质土进行种植，定植2天后进行处理。

JT79菌体悬浮液的制备方法为：取100mL JT79发酵液，用50mL无菌离心管分装后，于6000rpm转速下离心10min。去掉上清液，加等量无菌水冲洗菌体，上下颠倒成菌悬液，再于6000rpm转速下离心10min。去掉上清液，菌体沉淀物加入10mL无菌水重悬，用分光光度计测量OD

处理一：非盐碱处理，浇灌20mL无菌水。

处理二：盐碱处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)和10mL无菌水。

处理三：盐碱+菌液处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)，再加入10mL JT79发酵液。

处理四：盐碱+菌体处理，加入10mL盐碱溶液(0.06mM，pH 9.0)，再加入10mL JT79菌体悬浮液。

经过上述各组处理后，每隔7天处理1次，完成培养30天后，测量植株的株高、侧根数、地上部分鲜重以及地下部分鲜重。

实验结果如图4所示，对照组大豆株高为14.3厘米，盐碱处理中植物株高为4.3厘米，为对照组株高的30％，两者差异显著；在JT79菌液处理后的植物株高为13.8厘米，为对照组株高的96.5％，两者差异不显著；在JT79菌体处理后植物株高为11厘米，为对照组株高的76.9％，两者差异不显著。JT79菌液对大豆盐碱胁迫的促生效果如图5所示，显示采用JT79发酵液对植物在盐碱胁迫下的促生效果优于JT79菌体悬浮液，其促生效果与正常条件下的对照组相当。

实施例6洋葱伯克霍尔德菌JT79含镉培养基耐受性试验

1、含镉培养基的制备

NA固体含镉培养基(15mg氯化镉、牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、加无菌水定容至1L，在121℃下灭菌15min。)

2、试验处理

在超净工作台将含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液适当稀释后，取200μL，用涂布棒均匀涂开于NA固体含镉平板上，待完全阴干后用封口膜封好平板，并置于室温培养箱，每天观察记录菌落生长情况，并用NA固体培养基作对照。

3、结果分析

结果如图6所示，洋葱伯克霍尔德菌JT79具有很好的耐镉性，在含镉量15mg/L的环境下也能正常生长。

实施例7洋葱伯克霍尔德菌JT79含镉培养基降低镉含量试验

1、含镉培养基的制备

NB液体含镉培养基(15mg氯化镉，牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加无菌水定容至1L，在121℃下灭菌15min)。

2、试验处理

按照含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液和液体培养基体积比为1:10将含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液分别加入NB液体含镉培养基中，在30℃、180r/min下分别培养72h、96h，得到洋葱伯克霍尔德氏菌JT79含镉发酵液。其中，本实验以含镉(5mg/L)NB培养基为对照，以添加洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的发酵液(浓度为2×10

3、结果分析

结果如图7所示，对照组的镉浓度达到15.51mg/L，而用JT79菌株发酵液分别处理72和96h后，溶液中镉的浓度分别为0.92mg/L和0.75mg/L。溶液中镉含量降低率超过90％，说明JT79菌株对镉有钝化或富集的作用且效果显著。

综上可知，洋葱伯克霍尔德菌JT79菌株具有很好的耐盐碱性和降低重金属镉含量的能力，能够在高盐碱培养基以及含镉环境中正常生长，具有很好的耐盐碱和耐镉性；并且显示JT79菌株能有效防治高盐碱对作物的危害并促进作物生长发育，能显著提高大豆和玉米抗盐碱胁迫的能力，并促进大豆和玉米的生长发育，增加植物株高分、侧根数、地上部鲜重、地下部鲜重。表明JT79菌株能够有效缓解盐碱胁迫下植物营养生长过程受抑制的情况，提高植株的耐盐碱能力，促进植物生长。同时，采用JT79菌液及其10倍稀释液对含镉样品处理72h就能降低80％以上的镉含量，表明JT79菌株对样品镉含量具有高效的降低作用。本发明为盐碱地的利用和镉金属污染土壤的防治与利用，提出了新的方法和思路，研究得到具有更好耐盐碱、促生活性，且能够用于重金属污染土壤防治的优良菌种资源，以供生产选择。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。