大豆钙依赖蛋白激酶基因GmCDPK17的应用

摘要

本发明公开了大豆CDPK激酶基因GmCDPK17的应用。SEQ ID NO.1所示大豆CDPK激酶基因GmCDPK17在基因工程改造大豆对斜纹夜蛾抗性中的应用。过表达GmCDPK17能够恢复cpk10拟南芥突变体对斜纹夜蛾的敏感性，也能够显著提高大豆对斜纹夜蛾的抗性。本发明所述的大豆CDPK激酶基因GmCDPK17可通过基因工程转化到大豆毛状根中，并最终正调控大豆的对斜纹夜蛾的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及大豆钙依赖蛋白激酶基因GmCDPK17的应用，属于基因工程领域。

背景技术

大豆作为重要的油料和经济作物，为人类和动物提供了优质的油脂和蛋白。大豆整个生育期内都有植食性昆虫危害，其中斜纹夜蛾取食部位广泛，取食量大，给南方大豆产量造成严重损失。单一的依赖化学农药防治虫害，不仅持续性污染环境、危害人和动物健康，而且诱导昆虫产生抗药性。因此，挖掘和利用大豆抗虫基因，培育抗性品种是大豆害虫防御重要策略之一，对农业可持续发展具有重要研究意义。

前期研究在大豆6号染色体上定位了一个抗虫位点，该位点包含了18个基因，其中一个钙依赖的蛋白激酶基因(calcium-dependent protein kinase，CDPK)GmCDPK17。钙依赖蛋白激酶参与植物的生长发育、对生物、非生物胁迫及激素的响应。拟南芥同源基因AtCPK10通过促进水杨酸(SA)的积累提高拟南芥对病原菌的抗性和耐旱性，响应ABA、IAA、2,4-D、GA(3)和6-BA激素处理的诱导，参与激素信号通路，调控幼苗根系发育。水稻中的同源基因OsCPK9通过气孔调节增强水稻抗旱能力，调节小穗育性。OsCPK21响应植物激素ABA诱导，提高水稻的耐盐性。烟草中，NtCDPK2与MAPKs共同调控乙烯合成基因的表达，促进乙烯合成。仅有少量基因在植物抗虫方面有功能，这些基因也都来自CDPK亚家族Ⅴ。NaCDPK4和NaCDPK5均参与调控JA的积累，同时参与虫胁迫的响应，突变体植株的抗虫性强。大豆中同属亚家族Ⅴ的GmCDPK38被报道敲除大豆植株对斜纹夜蛾的抗性增强，但该基因与本发明GmCDPK17基因的相似性仅52.06％。但尚未见关于大豆CDPKⅢ亚家族基因具有抗虫性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于公开大豆CDPK基因GmCDPK17的抗虫基因工程应用，该基因主要在大豆根中表达，并且在斜纹夜蛾胁迫诱导后于叶片中迅速上调表达。此外，亚细胞定位分析得知GmCDPK17为核定位和膜定位蛋白。GmCDPK17可作为目的基因导入拟南芥和大豆毛状根中，均正调控植株对斜纹夜蛾的抗性。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

大豆CDPK基因GmCDPK17在基因工程改造大豆对斜纹夜蛾抗性中的应用，所述的大豆CDPK基因GmCDPK17编码区序列如SEQ ID NO.1所示。

在拟南芥中，过表达GmCDPK17恢复拟南芥cpk10突变体对斜纹夜蛾的抗性。在大豆中，过表达该基因显著提高大豆的抗虫性。

有益效果

GmCDPK17是一种大豆CDPK基因，该基因正调控转基因拟南芥和大豆毛状根对斜纹夜蛾的抗性。通过表达量分析，证明GmCDPK17在大豆根、茎、叶中均有较高的表达，在虫诱导的叶片中上调表达。通过亚细胞定位分析，证明GmCDPK17为核定位和膜定位蛋白。同时通过功能验证发现该基因正调控转基因拟南芥和大豆毛状根对斜纹夜蛾的抗性。因此，GmCDPK17可以作为调控大豆对斜纹夜蛾抗性的靶点，用于大豆抗虫性的改造。

附图说明

图1 PCR克隆GmCDPK17后琼脂糖凝胶电泳图。目的片段大小1656bp。Marker：DL2000

图2 GmCDPK17组织表达模式。N＝3。

图3 GmCDPK17能响应斜纹夜蛾胁迫诱导。虫诱导后1、6、12、24、48h，大豆叶片中GmCDP17表达量的变化(N＝3)。

图4 GmCDPK17蛋白的亚细胞定位分析。GFP：荧光；Light：明场；Merge：荧光和明场融合；35S:GFP：空载对照；35S:GmCDPK17-GFP：带GFP标签的GmCDPK17蛋白。比例尺：50μm。

图5转基因拟南芥PCR检测。(A)拟南芥cpk10突变体(T-DNA插入)的PCR检测。拟南芥cpk10突变体可以扩增出一条较短的片段，而Col-0植株能扩增出较长的片段。(B)

GmCDPK17转基因拟南芥的PCR检测，目的片段大小1713bp。M：Marker DL2000，P：阳性质粒，Col-0：拟南芥野生型Col-0，cpk10：拟南芥cpk10突变体，1-5：不同的GmCDPK17-OEcpk10转基因植株，H

图6 cpk10突变体中GmCDPK17的过量表达提高了植株对斜纹夜蛾的抗性。(A)用拟南芥Col-0、cpk10突变体和GmCDPK17-OE cpk10植株喂养0、2和4d的斜纹夜蛾幼虫重。两尾测验，N＝3。*：P<0.05，ns：不显著，误差线表示±SEM。(B)用拟南芥Col-0、cpk10突变体和GmCDPK17-OE cpk10植株喂养0和4d的斜纹夜蛾幼虫。比例尺＝1cm。

图7转基因毛状根的PCR检测。(A)过表达毛状根OE-GmCDPK17和过表达空载毛状根OE-KZ的PCR检测。目的片段大小1655bp。M：Marker DL2000，P：阳性质粒(pMDC83-GmCDPK17)，H

图8转基因大豆毛状根中GmCDPK17基因的相对表达水平和其对斜纹夜蛾抗性的鉴定。(A)大豆过表达毛状根OE-CDPK17及对照OE-KZ、RNA干扰毛状根RNAi-CDPK17及对照RNAi-KZ。比例尺＝2cm。(B)4种基因型大豆毛状根中GmCDPK17的相对表达水平。N＝3。*：P<0.05；**：P<0.01。误差线表示±SEM。(C)4种基因型大豆毛状根喂养0、4和6d的斜纹夜蛾幼虫重及0和6d的幼虫。比例尺＝1cm。两尾测验，N＝3。****：P<0.0001。误差线表示±SEM。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1大豆GmCDPK17基因的克隆与表达特性分析

1)大豆GmCDPK17基因的克隆

以大豆品种PI 227687为取材对象，取其叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，利用RNA提取试剂盒提取总RNA(上海浦迪)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照诺维赞公司反转录试剂盒(HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit，南京)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃恒温，获得PI 227687的cDNA。

以大豆数据库Phytozome v12中GmCDPK17(Glyma.06g189600)的编码序列为模板设计特异引物，利用PCR反应从大豆品种PI 227687的叶片cDNA中扩增基因，PCR产物与T载体链接，构建T-GmCDPK17重组载体，经过测序后获得大豆GmCDPK17基因的完整的CDS序列，全长1656bp(图1)。GmCDPK17基因编码序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列见SEQ ID NO.2。PCR反应所需特异引物序列为F1:attgtcgccaggggacacta和R1:tcaaaccaccacagcttgac。

2)GmCDPK17的组织表达分析

采集大豆品种PI 227687的根、茎、叶、花和种子鉴定GmCDPK17在不同组织中的表达水平。V4期取根、茎和叶，R2期取花，开花后15天采集种子和荚。样品于液氮速冻后-80℃保存。总RNA的提取同1)。以上述各组织的总RNA为模板，反转为cDNA。GmCDPK17荧光定量引物序列为:F2:ttttcagagattgttgggag和R2:ccacaccttgctcagtctct，通过进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)检测基因在各组织的相对表达量，以大豆Tubulin基因作为内部参照，引物序列见F3:ggagttcacagaggcagag和R3:cacttacgca tcacatagca。GmCDPK17主要在大豆根、花、叶中表达，茎和种子中的表达量较低(图2)。

3)GmCDPK17在斜纹夜蛾胁迫诱导下的表达分析

将斜纹夜蛾分别放于V4期大豆品种PI 227687植株真叶和第二片复叶上，每株两头。48h后，将虫子取出，诱导处理完成，此时大豆叶片损失面积达20％左右。诱导处理后1、6、12、24和48h诱导组和对照组(未诱导组)分别取新鲜叶片，液氮速冻后于-80℃保存。总RNA的提取同1)。以上述诱导组和对照组叶片的总RNA为模板，反转为cDNA，并进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)。GmCDPK17荧光定量引物序列和内参基因Tubulin引物序列同2)。

用斜纹夜蛾处理大豆叶片后，GmCDPK17表达量显著上调，在24h时达到峰值(图3)，表明GmCDPK17受斜纹夜蛾胁迫诱导表达。

4)大豆GmCDPK17基因亚细胞定位

设计特异引物，通过PCR反应从T-GmCDPK17载体上扩增不含终止密码子的GmCDPK17基因CDS序列，将该序列插入到含有GFP标签的pFGC5941表达载体，构建亚细胞定位载体。该载体具有35S启动子，可强烈诱导目的基因GmCDPK17在受体中的表达。通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中(35S:GmCDPK17-GFP)。同时将空载pFGC5941也转化到EHA105中，作为空载对照(35S:GFP)。构建载体引物序列为F4:acaaatctat ctctctctcgagatgggaaactgcaacgtgtg和R4:gctcaccatggatccaaccaccacagcttgaccag。

将含有35S:GmCDPK17-GFP和35S:GFP的菌液分别注射到7-8周大小的本氏烟的叶片中，培养36-48小时后用Leica TCS SP2型激光共聚焦显微镜观察报告基因GFP的定位情况。GFP信号显示，GmCDPK17-GFP融合蛋白定位细胞核和细胞膜上，而空载定位于整个烟草细胞内(图4)。

实施例2大豆CDPK基因GmCDPK17的基因工程应用

1)大豆CDPK基因GmCDPK17的植物表达载体构建

构建基因过表达载体时，设计含有过表达载体(pMDC83)双酶酶切位点(BamHI和KpnI)的引物(见F5:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccatgggaaactgcaacgtgtg和R5:ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcaaaccaccacagcttgac)，从T-GmCDPK17载体上克隆带接头的GmCDPK17基因完整的CDS序列，通过双酶酶切该CDS序列与pMDC83载体序列，通过连接酶链接构建重组载体pMDC83-GmCDPK17。植物转化载体pMDC83含有35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmCDPK17在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株EHA105和发根农杆菌菌株K599中。同时将空载pMDC83也转化到K599中，作为空载对照。

构建RNA干扰载体时，选取GmCDPK17基因CDS中190bp序列与Invitrogen公司的

2)GmCDPK17基因能拯救拟南芥cpk10植株的抗虫性

拟南芥突变体cpk10购自arashare(

利用沾花法转化拟南芥，将cpk10拟南芥突变体花蕾浸于步骤1)含pMDC83-GmCDPK17的根癌农杆菌菌株EHA105菌液中，侵染30s～1min。用保鲜膜或保鲜袋包裹植株以保持湿度，暗培养24h。之后可视植株生长状况，待新的一批花序长出后再次转化。将拟南芥放于正常条件下继续生长，收获种子。将收获的种子与拟南芥野生型Col、突变体cpk10种子同时播种，提取各拟南芥叶片的DNA，通过PCR反应鉴定过表达GmCDPK17拟南芥突变cpk10，得到5株T

种植拟南芥WT、cpk10、35S:GmCDPK17/cpk10各5株，用于斜纹夜蛾强迫喂养试验。将随机挑选的5头二龄斜纹夜蛾放置在莲座叶上，把拟南芥放入白色网袋内进行强迫喂养。分别于第0、2和4天称重，计算平均幼虫重，以斜纹夜蛾单头幼虫重作为抗性鉴定指标。如图6所示，取食突变体cpk10的幼虫重在第2天和4天显著高于WT，其斜纹夜蛾幼虫较大，表现为不抗虫。取食35S:GmCDPK17/cpk10的幼虫重与WT相比幼虫重和幼虫大小均没有显著差异。表明GmCDPK17在突变体cpk10中过表达恢复了拟南芥突变体的抗虫性。

3)GmCDPK17基因正调控大豆对斜纹夜蛾的抗性

对生长5天的大豆幼苗子叶背部进行创伤处理，再将步骤1)获得的分别含pMDC83-GmCDPK17和pB7GWIWG2(II)-GmCDPK17载体以及相应空载对照的根癌农杆菌菌株K599菌液接种到大豆子叶背部的伤口处，并将接种后的子叶置于含有500μg/mL羧卞和50μg/mL头孢的White培养基中。25℃黑暗培养3周后，毛状根会从子叶背部伤口处长出，将过表达毛状根称之为OE-CDPK17，其空载对照为OE-KZ；将干扰毛状根称之为RNAi-CDPK17，其空载对照为RNAi-KZ。为检测是否为阳性毛状根，利用特异性引物对提取的大豆毛根DNA进行PCR检测。过表达毛状根检测引物序列为F7:ATGGGAAACTGCAACGTGTG和R7:GATAATCATCGCAAGACCGG。PCR阳性毛状根检测胶图见图7A。RNA干扰毛状根检测引物序列见F8:GGGAGTCCTTACTACATGG和R8:GAACGGAGGAACCCCACA，PCR阳性毛状根检测见图7B。实时荧光定量qPCR发现在过表达毛状根(OE-CDPK17)中GmCDPK17基因表达量要显著高于OE-KZ的，而在RNA干扰的毛状根中(RNAi-CDPK17)中GmCDPK17基因表达量要显著低于RNAi-KZ中的(图8A和B)。GmCDPK17和大豆内参基因Tubulin荧光定量引物序列同实施案例1中步骤2)。

取4种基因型(OE-CDPK17、OE-KZ、RNAi-CDPK17和RNAi-KZ)的大豆毛状根，室内用培养皿喂养大小一致的2龄斜纹夜蛾幼虫，每皿5头幼虫，10个重复。每天更换新鲜毛根，分别于喂养0、2、4和6天称重。计算每皿平均虫重，并以斜纹夜蛾平均幼虫重作为抗虫性的鉴定指标。用OE-CDPK17转基因毛根喂养的斜纹夜蛾幼虫显著轻于其对照OE-KZ喂养的幼虫，表现为抗虫，而用RNAi-CDPK17转基因毛根喂养的斜纹夜蛾幼虫显著重于其对照RNAi-KZ喂养的幼虫，表现为感虫(图8C)。该结果说明GmCDPK17过表达能增加大豆对斜纹夜蛾的抗性。