一种提高弱光条件下番茄果实产量和番茄果实番茄红素含量的方法

摘要

本发明公开了一种提高弱光条件下番茄果实产量和番茄果实番茄红素含量的方法。本发明利用CRISPR/Cas9基因组多靶点编辑技术，靶向番茄叶绿素降解关键基因‑滞绿基因1(SGR1)，也是番茄红素合成关键基因，创制了基因编辑番茄。该基因编辑番茄相比与野生型番茄，具有高番茄红素且耐受弱光，同时经过对SGR1基因基因编辑提高了弱光设施栽培条件下番茄果实的产量。本发明所提供的方法可应用于番茄育种和品质改良。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高弱光条件下番茄果实产量和番茄果实番茄红素含量的方法。

背景技术

番茄是世界上重要的蔬菜作物，营养丰富且口感酸甜，即可鲜食也可深加工，经济效益较高。大棚可以为番茄生长提供了相对适宜生长的环境，减少了自然灾害以及病虫害对植物的损害，有助于提高番茄品质与经济效益。因此，番茄的设施栽培可以打破季节和地域性限制，降低生产难度，有助于满足人们在一年四季都可以购买到优质番茄的需求，已成为冬季和初春种植番茄的主要设施。

但大棚生产也凸显出一些问题，最突出的问题就是光照不足。由于日照时数、天气、设施遮挡、透光率等原因，致使大棚内部的光照只有室外的70％或更少。而番茄是典型的喜温喜光植物，这种光照条件会降低开花坐果量以及阻碍果实充分膨大从而导致减产。目前，解决设施栽培光照不足的主要措施有采用高透光率的塑料薄膜以及补光技术等，但这也意味着成本的大量增加。从植物本身出发，提高其耐弱光能力可以从根本上解决这一问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高弱光生长条件下番茄的产量和/或如何提高弱光生长条件下番茄果实的番茄红素含量和/或如何培育耐弱光番茄。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种提高弱光条件下番茄果实产量和/或番茄果实大小和/或番茄果实纵横径长度和/或番茄果实番茄红素含量的方法，包括降低或抑制番茄中蛋白质的活性或/和所述蛋白质的编码基因的表达量或/和对所述蛋白质的编码基因进行基因编辑或/和使所述蛋白质的编码基因发生突变，从而提高弱光条件下番茄果实产量和/或番茄果实大小和/或番茄果实纵横径长度和/或番茄果实番茄红素含量。

所述弱光条件的光量子通量密度可为正常光照条件的0.5倍以下。如所述弱光条件的的光量子通量密度可为200μmol m

所述蛋白质可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和

/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上文所述方法包括向番茄中导入降低或抑制上文所述的蛋白编码基因表达的物质或对上文所述的蛋白编码基因进行基因编辑的物质；所述物质可为如下c1)-c4)任一种物质：

c1)抑制或降低上文A1所述蛋白编码基因表达的核酸分子；

c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。

上述方法中，c1)所述的核酸分子可为表达靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA；

所述靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列可如序列表中序列2的第378-397位所示和序列表中序列2的第722-741位所示。

上述方法中，所述抑制或降低番茄中上文所述蛋白质的编码基因的表达或对上文所述蛋白质的编码基因进行基因编辑可为将番茄基因组中的序列2所示的所述蛋白编码基因进行下述突变：

将序列2的第380-381位核苷酸之间插入一个碱基G，且将序列2的第738-739位核苷酸之间插入了一个核苷酸C。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了调控蛋白质的的活性或含量的物质或/和调控所述蛋白质的编码基因的表达量的物质和/或对所述蛋白质的编码基因进行基因编辑的物质和/或突变所述蛋白质的编码基因的物质的下述任一种应用：

P1、所述物质在调控番茄果实产量中的应用，

P2、所述物质在提高番茄果实大小中的应用，

P3、所述物质在提高番茄果实纵横径长度中的应用，

P4、所述物质在提高番茄果实番茄红素含量中的应用；

P5、所述物质在番茄育种或品质改良中的应用。

所述蛋白质可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质和/或对所述蛋白质的编码基因进行基因编辑的物质和/或突变所述蛋白质的编码基因的物质。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

上述方法或应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。

术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的同一性。

与上文所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

P1、所述生物材料在调控番茄果实产量中的应用，

P2、所述生物材料在提高番茄果实大小中的应用，

P3、所述生物材料在提高番茄果实纵横径长度中的应用，

P4、所述生物材料在提高番茄果实番茄红素含量中的应用；

P5、所述生物材料在番茄育种或品质改良中的应用。

所述生物材料可为下述任一种：

D1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；

D8)抑制或降低上文所述蛋白质的编码基因的表达或上文所述蛋白质活性的核酸分子或/和对上文所述蛋白质的编码基因基因基因编辑的核酸分子；

D9)含有D8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

上述应用中，所述核酸分子可为如下所示的DNA分子：

b1)编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)、b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。

D8)所述核酸分子可为表达靶向上文A1)所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向上文中A1)所述蛋白编码基因的gRNA。

所述靶向所述A1)蛋白编码基因的gRNA的靶序列可如序列表中序列2的第378-397位所示和序列表中序列2的第722-741位所示。

上述生物材料中，D2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。

可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

上文所述的方法在制备提高番茄果实产量和/或番茄果实大小和/或番茄果实纵横径长度和/或植物番茄番茄红素含量的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上文所述的蛋白质也属于本发明的保护范围。

本发明利用CRISPR/Cas9基因组多靶点编辑技术，靶向叶绿素降解关键基因-滞绿基因1(STAY GREEN 1，SGR1)，也是番茄红素合成关键基因，创制了高番茄红素且耐受弱光的番茄新种质，提高了弱光设施栽培番茄果实的产量。另外，该种质也表现出了更强的采后耐贮性。本发明为番茄种质改良以及提高经济效益提供了新策略和方法。

附图说明

图1为野生型(WT)与基因编辑番茄(L-1)果实的生长发育状况。A为半遮光培养野生型及L-1结果表型，比例尺为3.5cm；B为半遮光培养番茄果实表型，比例尺为2.5cm；C为半遮光栽培条件下野生型和L-1平均单果重和单株产量；D为半遮光栽培条件下野生型和L-1的纵径和横径长度。**表示差异极显著(P<0.01)。

图2为野生型(WT)及基因编辑番茄(L-1)成熟果实番茄红素含量测定比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中的野生型番茄AC(Ailsa Craig)由中国农业大学食品科学与营养工程学院朱鸿亮课题组提供(相关文献：Ma L,Yang Y,Wang Y,et al.SlRBP1 promotestranslational efficiency via SleIF4A2 to maintain chloroplast function intomato[J].The Plant Cell,2022)；pYLCRISPR/Cas9与pYLsgRNA质粒均由华南农业大学生命科学学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光课题组提供(相关文献：曾栋昌,马兴亮,谢先荣,等.植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法.中国科学:生命科学,2018,48:783–794；Ma X,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robustCRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing inmonocot and dicot plants[J].Molecular plant,2015,8(8):1274-1284)。

本发明实施例中番茄的种植条件如下：将番茄种子播种于营养土、草炭、蛭石(2：1：1，v/v/v)混合后的10×10cm的小方盆中，每盆种植两棵，覆膜保湿后在植物生长室中培养，萌发后将薄膜敞开一个小口，再过一周去除薄膜，当幼苗生长至15cm左右时移栽到日光温室中。弱光栽培环境的温度为25℃/18℃(日/夜)，光周期为12h/12h(日/夜)，光密度为100-200μmol m

本发明实施例中所有试验都包括三次以上重复，利用Excel和SPSS24进行数据处理和差异显著性分析。

实施例1、番茄SGR1蛋白在调控弱光条件下番茄果实产量和番茄红素中的应用

1.CRISPR-Cas9重组质粒的构建

番茄SGR1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其cDNA的CDS编码序列为序列表中序列2所示的核苷酸。

参考曾栋昌等(2018)的方法进行CRISPR表达载体的构建：

1.1gRNA片段的获得

在http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR#网站上设计SGR1基因的靶点，选取评分高、无脱靶的靶点序列，设计合成构建表达盒的引物。

SGR1的靶点1的核苷酸序列为5’-GGCCTCCACTAATGTGGCAA-3’，靶点2的核苷酸序列为5’-CCCCAGTGAGTGTTATGCCT-3’，分别对应于SGR1基因的序列表中序列2的第378-397位和第722-741位核苷酸。

1.2CRISPR-Cas9重组质粒的构建

经过PCR反应后回收PCR产物，分别将两个靶点构建到相应的sgRNA载体(pYLsgRNA质粒)上，即得到两个完整的sgRNA表达盒。反应体系：Q5 buffer 5μL，dNTP mix 2.5μL，pYLsgRNA载体模板1μL，上下游引物各1μL，Q5酶0.25μL，ddH

S1-F：5’-GGCCTCCACTAATGTGGCAAgttttagagctagaaat-3’；

S1-R：5’-TTGCCACATTAGTGGAGGCCTgaccaatggtgctttg-3’。

靶点2对应的上下游引物序列分别为：

S2-F：5’-CCCCAGTGAGTGTTATGCCTgttttagagctagaaat-3’；

S2-R：5’-AGGCATAACACTCACTGGGGTgaccaatggtgctttg-3’。

所需通用引物为：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；

gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。

利用Golden Gate法将sgRNA表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9表达载体上得到连接产物。反应体系：10×Cutsmart buffer 1.5μL，10×T4 DNA ligase buffer 1.5μL，pYLCRISPR/Cas9质粒60ng，每个sgRNA表达盒各10ng，Bsa I 1μL，T4 DNA ligase1μL，ddH

1.3重组农杆菌的获得

将连接产物转化DH5α大肠杆菌，涂布于含有卡那抗性的LB平板上，37℃过夜培养，获取阳性克隆后，送去公司测序，将测序正确的菌液大摇提取质粒，即得到CRISPR-Cas9重组质粒Cas9-SGR1。

将重组质粒Cas9-SGR1转化进入农杆菌感受态EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/Cas9-SGR1，用于后续稳定遗传转化试验。

2.转基因番茄植株的获得

2.1农杆菌介导的番茄稳定遗传转化(叶盘法)

番茄种子的无菌播种：

挑取饱满的AC番茄种子，在超净工作台中用70％乙醇浸泡2min，然后用5％次氯酸钠浸泡10min，期间数次颠倒混匀；用枪将液体吸干净后用无菌水冲洗3-5次，将种子置于无菌滤纸上，吸干水分；将消毒过的种子均匀的置于1/2MS培养基上，每瓶7-9棵；将培养瓶至于25℃的暗箱中先培养3天左右，待种子长出2-3cm的白色芽时，取出培养瓶置于光下培养，等到幼苗长至子叶完全伸展而真叶尚未真正长出时可用于侵染(苗子不能太老，否则转化率会下降)。

侵染：

将二次活化好的重组农杆菌EHA105/Cas9-SGR1菌液(OD

将番茄子叶横向剪成两段(两端去除)，置于加入适量MS液体的锥形瓶中，材料准备完成后缓慢倒掉MS液体，加入之前准备好的菌液，确保所有叶片组织都浸于菌液中，无挂壁。28℃摇床慢摇10min，后静置10min，也可以在工作台内静置，期间手动摇晃几次。倒掉菌液，将叶片摊在滤纸上，待叶片表面水膜消失后，迅速平铺于共培养培养基上，用封口膜封住后放在组培室黑暗下培养2-3d。

筛选培养：

共培养结束后，轻柔地将叶片转移至筛选培养基(潮霉素5mg/L)内，黑暗培养1周后放置在光下培养。产生愈伤组织和不定芽后，如未发生污染，不必急于转移至继代培养基。随着培养基中玉米素含量的逐渐下降，诱导产生的不定芽逐渐长大。如由不定芽产生的幼苗已高于1cm，便可直接移至生根培养基。培养过程中不必担心培养基中养分耗尽或水分耗尽的情况。

继代培养：

从筛选培养基内取较大的不定芽，去掉愈伤组织，插至继代培养基中，光照培养。该步中愈伤组织需要去净，否则愈伤组织产生的内源激素将干扰植株整体的激素水平，导致不定芽难以长大，在植株基部产生大块的愈伤组织。如有必要，可将愈伤组织去除褐化部分后，移回至筛选培养基，继续诱导不定芽。如果不定芽较小(<2mm)则难以成活，可弃之。约2-3周，不定芽即会长大成植株。

生根培养：

从继代培养基中选取较大的植株(茎已明显可见，高于1cm)，去除基部的愈伤组织及蘖丛，插至生根培养基中。如有条件，可将植株下部四分之一剪去，以调整植株激素水平，更易于生根。对于筛选培养基内较大的芽子，亦可直接移至生根培养基，不过需要将愈伤组织去净。在培养过程中应注意随时抹去花芽。

对于检测阳性的植株，可剪取植株顶部和母株之后产生的侧枝插于生根培养基中，用于快繁。

上盆栽种：

取出培养瓶内的植株，去净根部的培养基(该步骤很关键，如去除不够干净，则苗子难以成活)及蘖丛，栽种于灭菌的培养土中，浇透水，盖上塑料薄膜，皮筋封口，避光3日后可移至正常光下。栽种过程中切勿使植株在空气中暴露太久，易导致萎蔫。1周后，可将塑料薄膜揭开一角，2周后便可尝试完全揭开，即获得T

2.2基因编辑植株的鉴定

将生根培养基中已生根的T

上游引物：5’-gctcatgacgcatgtcgaaatc-3’；

下游引物：5’-ggcacaacccaacttacaataattg-3’。

经检测，本发明共获得2棵基因编辑T

另一棵为靶点1对应的SGR1基因序列发生了杂合突变，靶点2对应的SGR1基因序列发生了双等位突变；即将番茄基因组中一条染色体的SGR1基因对应的序列表序列2的第380-381位核苷酸之间插入一个碱基G，另一条染色体未发生突变；且同时将番茄基因组中一条染色体的SGR1基因对应的序列表序列2的第738-739位核苷酸之间插入了一个核苷酸C，另一条染色体的SGR1基因对应的序列表序列2的第738位核苷酸G被删除。

将其中一株T

L-1植株中，突变SGR1基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示，突变SGR1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列3所示。

3.表型观察

3.1果实重量和大小观察

将4周大小的番茄小苗移栽至温室进行半遮光(弱光)培养至成熟期。光周期为12h/12h(日/夜)。

其中，半遮光条件即弱光条件的光量子通量密度为200μmol m

通过观察半遮光条件即弱光条件(光周期为12h/12h(日/夜)，弱光条件的光量子通量密度为200μmol m

因此，通过对番茄SGR1基因进行基因编辑，获得的SGR1纯合突变基因编辑植株与野生型番茄相比，更耐受弱光栽培，可应用于设施栽培条件下提高番茄果实的大小和产量。

其中番茄果实单果重、单株产量与果实纵横径的测定方法如下：

采用万分之一电子天平进行果实重量测定，果实纵横径用数显游标卡尺(0-150mm，0.01mm)测定，WT和CR株系各选5个植株，每个植株随机选取10个果实，取平均值；采收整株果实用于计算单株产量，取5个植株的平均值。

3.2果实番茄红素测定

番茄果实番茄红素测定方法如下：

1)取组织块(0.1g～0.5g)在冰冷的PBS中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放入5ml的匀浆管中；

2)按重量(g):体积(mL)＝1:9的比例加入适量的匀浆介质(0.05mol/L Tris-HCl,pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS))于匀浆管中，冰水浴条件下，用眼科小剪尽快剪碎组织块；

3)左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次(6～8分钟)，充分研碎，制成10％的匀浆液，然后低温3000rpm离心10～15min；

4)取上清液，使用上海齐一生物科技有限公司的植物番茄红素ELISA检测试剂盒进行番茄红素含量的测定。

经测定结果显示，与野生型AC番茄相比，SGR1基因编辑番茄果实的番茄红素得到了显著提高(图2，P<0.01)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。