一种基于氧化石墨烯和荧光碳点功能化DNA的生物传感器的制备方法与应用

摘要

本发明公开一种基于氧化石墨烯和荧光碳点功能化DNA的生物传感器的制备方法与应用。该方法为：超声分散制备氧化石墨烯的均一溶液；然后制备双链DNA‑金纳米颗粒荧光探针；水热法制备荧光碳点，并将表面修饰羧基的CDs和末端修饰氨基的Fuel DNA偶联在一起形成Fuel DNA‑CDs复合物；将末端标记碳点荧光基团的Fuel DNA溶液添加到GO溶液中进行荧光淬灭反应；荧光淬灭完全后，加入dsDNA‑AuNPs和miRNA let‑7a，进行两次链式置换反应，检测荧光恢复值。该方法操作简便，为miRNA let‑7a的检测提供了一种新思路，该方法在早期癌症诊断和临床分析中具有巨大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及基于荧光碳点功能化的Fuel DNA充当能量供体和分子识别探针，氧化石墨烯充当能量共振能量转移的受体和荧光淬灭剂，利用链式置换反应实现信号循环放大及荧光恢复强度变化检测miRNA let-7a的生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

核酸是一类生物大分子，其相对分子质量可以达到几十万甚至几百万，核酸的基本单位是核苷酸，而核苷酸又由一分子含氮的碱基、一分子磷酸和一分子五碳糖组成，核酸根据组成核苷酸五碳糖的不同，可以分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，它们承载和传递着重要的生命遗传信息，在细胞增殖，分化，凋亡和代谢等方面起重要作用，核酸类物质的异常表达往往会造成一些遗传病、基因缺陷和癌症等。越早的在细胞水平上发现并检测一些与癌症相关的基因的异常表达可以帮助人们更为深入的认识癌症的致病机理，因此miRNA的检测对生物学研究和疾病诊断具有重要意义。

生物传感器具有生物识别与检测功能，主要由生物识别单元与信号转换器组成，信号转换器将靶标与生物识别元件之间产生的信号转化为更容易读出的信号，并进行信号放大、信号处理等转化过程后，最后以可测电信号形式输出，并进一步被信号检测器读出，从而实现对靶标，如酶，抗体，核酸，细胞等生物活性单元的灵敏性检测荧光生物传感器，因其具有灵敏度高，无样品破坏性，操作简单，信号响应速度快等优点，成为了生物传感器当中的研究热点。荧光物质是荧光生物传感器的基础，传统的荧光生物传感器中的荧光物质主要是一些无机半导体量子点和有机小分子荧光物质，但实际应用时常常因为无机半导体量子点和有机小分子荧光物质其本身较差的水溶性和较高的生物毒性而限制了发展。新兴的荧光生物传感器则更倾向于利用一些生物相容性好，绿色无毒，制备简单的碳量子点，金属纳米团簇等新型荧光纳米材料来扩展其应用领域。

氧化石墨烯(GO)是一种二维蜂窝状的碳材料，由于其在水中有很好的分散性，易于合成，良好的胶体稳定性和良好的生物相容性等优点引起了广泛的关注。GO的另一个优点是它的表面积与体积之比非常大，使其可以与许多生物分子，例如某些核酸，蛋白质，金属离子和小分子相互作用。

碳点(CDs)，是继富勒烯，碳纳米管，石墨烯之后一种新兴的纳米材料，是一种近似球形的零维纳米材料，凭借其光学性能稳定，良好的水溶性，低细胞毒性和良好的生物相容性等优点，CDs被广泛的应用于金属离子检测，光催化，和细胞成像等领域。通过对CDs表面进行特定的修饰可以获得不同荧光产率和发光特性的CDs。CDs通常通过自上而下或自下而上的方式合成，但是，大多数自上而下的方法都有一些缺点，比如设备昂贵，合成条件苛刻，过程繁琐，这都增加了CDs大规模生产的成本。相反，一些自下而上的方法则更加简单，经济高效且环保，易于大规模生产，例如常用的微波法和水热法等。低毒性的CDs克服了传统量子点的一些缺点，也被广泛应用于生物成像，药物载体，是最有希望在疾病检测上实现应用的荧光纳米材料。

发明内容

本发明就构建了一种基于氧化石墨烯和荧光碳点功能化DNA的生物传感器的制备方法，并将其用于生物医学领域。为了解决传统的一些基于重金属的量子点和有机染料的荧光发光性能不稳定，荧光产率低，易光漂白，生物相容性低，细胞毒性大，合成成本高，工艺复杂等问题。本发明提供了一种荧光发光性能稳定，荧光产率高，不易光漂白，生物相容性高，细胞毒性低，合成成本低，工艺简单的碳点合成方法，并将其功能化修饰在单链DNA末端，结合氧化石墨烯淬灭荧光和链式置换反应实现信号循环放大及荧光恢复强度变化，实际应用到miRNA let-7a的定量检测。

本发明以柠檬酸为原料合成荧光碳点(CDs)，并替代传统的小分子荧光染料功能化修饰于Fuel单链DNA末端，基于GO淬灭荧光和两次链式置换反应(TSDR)建立了miRNAlet-7a检测体系。被CDs标记的Fuel DNA充当能量供体和分子识别探针，GO充当荧光能量转移(FRET)受体和荧光淬灭剂，当目标物miRNA let-7a存在时，依次触发两次TSDR，目标物得以循环利用，并且从GO表面解吸大量吸附的Fuel DNA(CDs修饰)，CDs荧光恢复，荧光恢复值与miRNA let-7a的浓度成正比。相比于传统的有机染料标记DNA，用CDs标记DNA合成的探针具有更强的生物相容性和更小的毒性，该方法对miRNA let-7a的检测具有良好的灵敏度和选择性。该方法操作简便，为miRNA let-7a的检测提供了一种新思路，该方法在早期癌症诊断和临床分析中具有巨大的应用潜力。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种检测miRNA let-7a荧光生物传感器的制备方法，包括探针：RecognitionDNA，Hairpin DNA，Fuel DNA，miRNA let-7a，复合探针dsDNA-AuNPs；

所述的复合探针dsDNA-AuNPs是Recognition DNA通过金硫键与纳米金颗粒连接再与Hairpin DNA杂交成双链形成的；

所用到的碱基序列为：

Recognition DNA碱基序列如SEQ No.1所示；具体为：5’-(SH)-AAAAAAAAAAACTATACAACCTACTACCTCATAGGTAC-3’；

Hairpin DNA碱基序列如SEQ No.2所示；具体为：5’-ACAACCTATGAGGTAGTAGGTTGT-3’；

Fuel DNA碱基序列如SEQ No.3所示；具体为：5’-NH

上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)超声分散制备GO的均一溶液；

(2)利用Recognition DNA，Hairpin DNA，AuNPs制备dsDNA-AuNPs荧光探针；

(3)水热法制备荧光碳点(CDs)，并将表面修饰羧基的碳点和末端修饰氨基的FuelDNA脱水缩合偶联在一起形成Fuel DNA-CDs复合物；

(4)将Fuel DNA-CDs溶液添加到GO溶液中进行荧光淬灭反应；

(5)荧光淬灭完全后，加入dsDNA-AuNPs和miRNA let-7a，进行两次链式置换反应，检测荧光恢复值。

所述的步骤(1)的过程为：将5-30mg的GO片添加到5-30mL的去离子水中，随后将该溶液放在冰浴中通过超声处理1-4h；最终收集到均匀的GO棕黄色溶液，并将其在室温下保存以备进一步使用。

所述的步骤(2)dsDNA-AuNPs荧光探针的制备，方法如下：以(1-5)：(100-500)的摩尔比将巯基化的寡核苷酸Recognition DNA用TCEP还原0.5-3h，以防止二硫键的形成；之后将Recognition DNA和Hairpin DNA(HP DNA)以(1-3)∶(1.2-3.6)的摩尔比混合在磷酸盐缓冲液中；将该混合物加热至60-80℃保持5-20min，并使其缓慢冷却至室温以杂交得到dsDNA；向混合物中添加10-30nM AuNPs溶液；然后将混合物溶液在室温下进行过夜处理，将溶液以10000-14000rpm/min的转速离心处理10-30min，撇去上清液以去除未结合上AuNP

所述的步骤(3)的过程为：将1-5g柠檬酸和1-2.5mL乙二胺溶解于10-50mL蒸馏水中；然后将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，在100-150℃下加热2.5-5h；制得的溶液经二次蒸馏水透析，保留分子量为3500-5500Da；然后，将25-50mg制备好的CDs分散在25-50mL含有1-5g NaOH和1-5g ClCH

所述的步骤(4)过程为：将10-50nM Fuel DNA溶液添加到10-30μg·mL

所述的步骤(5)过程为：将20-40nM dsDNA-AuNPs溶液添加到混合物中，最后添加不同浓度的目标miRNA let-7a，并在24-37℃下孵育10-30min，通过FL-8500荧光分光光度计记录混合物的荧光。

上述方法制备的生物传感器在疾病诊断上检测miRNA let-7a的应用。

本发明中一共用到了4条DNA链，其序列分别是：

Recognition DNA：5’-(SH)-AAAAAAAAAAACTAT

Hairpin DNA：5’-ACA

Fuel DNA：5’-NH

miRNA let-7a：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’；

其中，Recognition DNA末端修饰的巯基-HS可以与纳米金颗粒之间通过Au-S键连接，Recognition DNA的下划线部分与Hairpin DNA的下划线部分互补配对，从而形成dsDNA-AuNPs的复合结构。Recognition DNA的加粗部分与miRNA let-7a的加粗部分互补配对，Recognition DNA的斜体部分与Fuel DNA的斜体部分互补配对，在目标miRNA let-7a存在的情况下，会发生第一次链式置换反应TSDR1，将Hairpin DNA从Recognition DNA上置换下来，暴露的碱基区域导致第二次链式置换反应TSDR2的发生，Fuel DNA进一步将miRNAlet-7a从Recognition DNA上置换下来，形成双链的Fuel DNA会从氧化石墨烯上解除吸附，导致荧光恢复。miRNA let-7a作为trigger链继续进行下一轮循环放大反应。

本发明的检测方式是通过荧光检测miRNA let-7a，CDs标记的Fuel DNA的荧光通过荧光共振能量转移至GO发生荧光淬灭。在目标miRNA let-7a存在的情况下，通过dsDNA-AuNPs上相继发生的两次链式置换反应TSDRs，Fuel DNA得以从GO表面解吸，荧光得以恢复，在这个过程中，目标物得以循环利用，信号进一步放大，目标miRNA let-7a的浓度与荧光恢复值成正比。

本发明基于氧化石墨烯和荧光碳点功能化DNA的生物传感器，该传感器具有荧光碳点制备简单，荧光发光性能稳定，生物相容性高，细胞毒性低，检测操作简单，检测速度快，检测限低，检测选择性好等优点，实现对miRNA let-7a的快速，灵敏的定量检测。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)氧化石墨烯充当能量共振能量转移受体和荧光淬灭剂，其荧光淬灭率高，淬灭速度快，可以降低荧光背景信号值。

(2)CDs功能化的Fuel DNA充当能量供体和分子识别探针，其相比于传统的有机染料标记DNA，用CDs标记DNA合成的探针具有更强的生物相容性和更小的毒性。

(3)以AuNPs做为载体，可以在其上负载多个探针，不仅可以提高杂交效率，同时引入多个信号分子，还可以起到信号放大的作用，另外，在AuNPs表面修饰DNA还可以使探针在复杂的环境中更加稳定，增加实验的可重复性。

(4)当miRNA let-7a存在时，触发两次链式置换反应，最终Fuel DNA形成dsDNA-AuNPs的双链体结构，导致被CDs标记的Fuel DNA从GO表面脱离，荧光恢复，两次链式置换反应可以循环利用目标物miRNA let-7a，将信号进一步放大，从而提高传感器的灵敏度，降低检测限。

附图说明

图1为该实验的原理图。

图2为合成的碳点的实物图。

图3为合成的碳点的透射电镜图。

图4为合成的碳点的红外光谱图。

图5为合成的碳点的荧光发射光谱图。

图6为为AuNPs，dsDNA-AuNPs和dsDNA的UV-vis表征图。

图7为氧化石墨烯的条件优化检测图。

图8为dsDNA-AuNPs和Fuel DNA浓度的优化检测结果图。

图9为该传感器检测的标准曲线。

图10为该传感器检测的选择性检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

(1)将10mg的GO片添加到10mL的去离子水中，随后将该溶液放在冰浴中通过超声处理3h。最终收集到均匀的GO棕黄色溶液，并将其在室温下保存以备进一步使用。

(2)dsDNA-AuNPs通过金硫键结合。首先，以1∶100摩尔比将巯基化的寡核苷酸(Recognition DNA)用TCEP还原1h，以防止二硫键的形成。之后将Recognition DNA和Hairpin DNA(HP DNA)以1∶1.2的摩尔比混合在磷酸盐缓冲液(PBS：137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH＝7.4)中。将该混合物加热至75℃保持10min，并使其缓慢冷却至室温以杂交得到dsDNA。向混合物中添加AuNPs溶液(20nM)。然后将混合物溶液在室温下进行过夜处理，将溶液以13000rpm/min的转速离心处理20min，撇去上清液以去除未结合上AuNPs的DNA。最后，将所得溶液洗涤两次，并在避光条件下4℃储存在PBS溶液中。

(3)将柠檬酸(3.0g)和乙二胺(1.875mL)溶解于蒸馏水(30mL)中。然后将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜(50mL)中，在150℃下加热5h。制得的溶液经二次蒸馏水透析(保留分子量：3500Da)。然后，将50.0mg制备好的CDs分散在50.0mL含有2.5g NaOH和2.5gClCH

经检测，如图7，检测到的荧光信号强度逐渐降低后基本保持不变，说明最佳GO淬灭浓度为30μg·mL

实施例2

(1)将10mg的GO片添加到10mL的去离子水中，随后将该溶液放在冰浴中通过超声处理3h。最终收集到均匀的GO棕黄色溶液，并将其在室温下保存以备进一步使用。

(2)dsDNA-AuNPs通过金硫键结合。首先，以1∶100摩尔比将巯基化的寡核苷酸(Recognition DNA)用TCEP还原1h，以防止二硫键的形成。之后将Recognition DNA和Hairpin DNA(HP DNA)以1∶1.2的摩尔比混合在磷酸盐缓冲液(PBS：137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH＝7.4)中。将该混合物加热至75℃保持10min，并使其缓慢冷却至室温以杂交得到dsDNA。向混合物中添加AuNPs溶液(20nM)。然后将混合物溶液在室温下进行过夜处理，将溶液以13000rpm/min的转速离心处理20min，撇去上清液以去除未结合上AuNPs的DNA。最后，将所得溶液洗涤两次，并在避光条件下4℃储存在PBS溶液中。

(3)将柠檬酸(3.0g)和乙二胺(1.875mL)溶解于蒸馏水(30mL)中。然后将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜(50mL)中，在150℃下加热5h。制得的溶液经二次蒸馏水透析(保留分子量：3500Da)。然后，将50.0mg制备好的CDs分散在50.0mL含有2.5g NaOH和2.5gClCH

(4)miRNA let-7a的荧光检测方法如下。将50nM Fuel DNA溶液添加到30μg·mL

实施例3

(1)将10mg的GO片添加到10mL的去离子水中，随后将该溶液放在冰浴中通过超声处理3h。最终收集到均匀的GO棕黄色溶液，并将其在室温下保存以备进一步使用。

(2)dsDNA-AuNPs通过金硫键结合。首先，以1∶100摩尔比将巯基化的寡核苷酸(Recognition DNA)用TCEP还原1h，以防止二硫键的形成。之后将Recognition DNA和Hairpin DNA(HP DNA)以1∶1.2的摩尔比混合在磷酸盐缓冲液(PBS：137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH＝7.4)中。将该混合物加热至75℃保持10min，并使其缓慢冷却至室温以杂交得到dsDNA。向混合物中添加AuNPs溶液(20nM)。然后将混合物溶液在室温下进行过夜处理，将溶液以13000rpm/min的转速离心处理20min，撇去上清液以去除未结合上AuNPs的DNA。最后，将所得溶液洗涤两次，并在避光条件下4℃储存在PBS溶液中。

(3)将柠檬酸(3.0g)和乙二胺(1.875mL)溶解于蒸馏水(30mL)中。然后将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜(50mL)中，在150℃下加热5h。制得的溶液经二次蒸馏水透析(保留分子量：3500Da)。然后，将50.0mg制备好的CDs分散在50.0mL含有2.5gNaOH和2.5gClCH

(4)miRNA let-7a的荧光检测方法如下。将不同浓度的Fuel DNA溶液(0nM-70nM)添加到30μg·mL

经检测，如图8(b)，检测到的荧光信号强度随着Fuel DNA的浓度在0nM-70nM区间内先逐渐增大后逐渐降低。当Fuel DNA浓度为50nM时，荧光强度值达到了最大值，因而，Fuel DNA的最佳浓度为50nM。

实施例4

(1)将10mg的GO片添加到10mL的去离子水中，随后将该溶液放在冰浴中通过超声处理3h。最终收集到均匀的GO棕黄色溶液，并将其在室温下保存以备进一步使用。

(2)dsDNA-AuNPs通过金硫键结合。首先，以1∶100摩尔比将巯基化的寡核苷酸(Recognition DNA)用TCEP还原1h，以防止二硫键的形成。之后将Recognition DNA和Hairpin DNA(HP DNA)以1∶1.2的摩尔比混合在磷酸盐缓冲液(PBS：137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH＝7.4)中。将该混合物加热至75℃保持10min，并使其缓慢冷却至室温以杂交得到dsDNA。向混合物中添加AuNPs溶液(20nM)。然后将混合物溶液在室温下进行过夜处理，将溶液以13000rpm/min的转速离心处理20min，撇去上清液以去除未结合上AuNPs的DNA。最后，将所得溶液洗涤两次，并在避光条件下4℃储存在PBS溶液中。

(3)将柠檬酸(3.0g)和乙二胺(1.875mL)溶解于蒸馏水(30mL)中。然后将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜(50mL)中，在150℃下加热5h。制得的溶液经二次蒸馏水透析(保留分子量：3500Da)。然后，将50.0mg制备好的CDs分散在50.0mL含有2.5gNaOH和2.5gC1CH

(4)miRNA let-7a的荧光检测方法如下。将50nM fuel DNA溶液添加到30μg·mL

经检测，如图9，检测到的荧光信号强度随着miRNA let-7a的浓度的增大而逐渐增大。

图1为实施例1所得该实验的原理图。

图2为实施例1所得碳点的实物图，表明碳点在特定波长范围光照射下有明显的肉眼可见的荧光。

图3为实施例1所得碳点的透射电镜图，表明其粒径平均为10nm。

图4为实施例1所得碳点的红外光谱图，表明碳点表面成功修饰了羧基基团，使其可以与Fuel DNA偶联的同时，具有良好的水溶性。

图5为实施例1所得碳点的荧光发射光谱图，表明合成的碳点在488nm光激发下，在543nm有着稳定的发射峰。

图6为实施例2所得AuNPs，dsDNA-AuNPs和dsDNA的UV-vis表征图，验证dsDNA-AuNPs复合结构的形成。

图7为实施例1所得对实验条件氧化石墨烯GO浓度的条件优化图，能够看到最佳GO浓度为30μg·mL

图8为实施例2，3所得对实验条件dsDNA-AuNPs和Fuel DNA浓度的条件优化图，能够看到最佳dsDNA-AuNPs浓度为30nM，最佳Fuel DNA浓度为50nM。

图9为实施例4所得不同目标物浓度miRNA let-7a(0pM-1nM)的荧光恢复图和目标let-7a的浓度与荧光强度之间的线性关系图，荧光恢复值与目标物浓度成正比。

图10为实施例4所得对体系选择性的分析，在相同的实验条件下选择了不同的miRNA，包括单碱基错配miRNA(M1)和非互补随机miRNA(R)作为干扰物质，结果显示，目标microRNA let-7a(T)的荧光恢复率明显高于M1，R和空白组。测试结果表明，即使错配一个碱基，荧光恢复值也很低，所以该方法也可以应用到单碱基错配识别方面。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。