StCBL4基因在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用

摘要

本发明公开了StCBL4基因在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用，属于基因工程技术领域，其中，StCBL4基因序列如SEQ ID NO.1所示；同时还保护StCBL4蛋白在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用，其中，StCBL4蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说是涉及StCBL4基因在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用。

背景技术

植物能够通过钙感受器对细胞内Ca

CBL4作为CBL蛋白家族的重要成员之一，近年来得到了广泛的研究。如Zhu等(1998)在筛选拟南芥盐敏感突变体时发现AtSOS3(CBL4)，这也是最早被发现在植物抗盐胁迫中具有应答功能的基因。余义和等(2016)研究发现葡萄VvCBL4启动子的活性受低温、盐等逆境胁迫诱导，说明该基因在葡萄抗逆过程中发挥重要作用。

马铃薯属茄科、一年生草本植物，是世界第四大粮食作物，具有产量高、适应性强、营养丰富、粮菜兼用等特点。近年来，我国马铃薯产业得到了快速的发展，已经成为世界马铃薯生产第一大国。但是马铃薯极易受到立枯丝核菌的侵染而影响产量和品质，所以如果能够找到马铃薯植物体内的抗性基因，可以为马铃薯在基因水平上对抗立枯丝核菌提供理论基础。

因此，研究StCBL4基因是否可以增加马铃薯对立枯丝核菌的抗性，并将其应用于抗立枯丝核菌胁迫中是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明针对StCBL4基因耐逆性强的特点，以前期转录组测序获得转录本为基础，克隆获得马铃薯StCBL4基因，利用生物信息学技术对其结构和功能进行系统分析后，采用qPCR技术重点分析StCBL4基因在感染立枯丝核菌后的表达变化，以期为马铃薯抗立枯丝核菌基因筛选提供初步的理论参考。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

StCBL4基因在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用，其中，所述StCBL4基因序列如SEQ ID NO.1所示。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护StCBL4蛋白在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用，其中，所述StCBL4蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护与SEQ ID NO.2所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；或，与SEQ IDNO.2所示的序列具有相同功能，且N端或C端连接标签得到的融合蛋白质在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交且编码SEQ ID NO.2所述蛋白质的DNA分子；或，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码SEQ ID NO.2所述蛋白质的DNA分子；或由SEQ IDNO.1所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；或由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护包含SEQ ID NO.2所示序列的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护包含权利要求4所述的序列的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞在提高马铃薯对立枯丝核菌抗性中的应用。。

经由上述技术方案可知，本发明通过立枯丝核菌侵染马铃薯实验，证实基因StCBL4会上调表达，说明，StCBL4基因与马铃薯抗立枯丝核菌相关，其次，本发明对StCBL4序列分析和亚细胞定位，表明StCBL4蛋白定位在细胞质膜；进而，本发明通过瞬时表达StCBL4基因、VIGS技术沉默本氏烟中StCBL4同源基因以及马铃薯过表达StCBL4转基因株系抗性等试验，证实了StCBL4基因与马铃薯抗立枯丝核菌的胁迫相关。

进一步，StCBL4蛋白的C末端都含有1个FPSF的基序，能被其互作的类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(CBL-interacting proteinkinase，CIPK)磷酸化，从而增强CBL与CIPK蛋白的结合强度及CBL-CIPK复合体对特异的下游靶蛋白的磷酸化活性。当马铃薯受到立枯丝核菌侵染时，StCBL4蛋白与StCIPK蛋白组合形成蛋白激酶复合物，通过感受细胞内Ca

综上所述，本发明发现了基因StCBL4可以正向调控马铃薯对立枯丝核菌的抗性，为在基因水平上对抗立枯丝核菌提供了理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为在立枯丝核菌侵染条件下马铃薯StCBL4基因表达谱分析；A为不同侵染时间下马铃薯品种尤金885中StCBL4基因表达谱分析；B为不同马铃薯种质资源中StCBL4基因相对表达分析；

图2附图为本氏烟中瞬时过表达StCBL4基因显著提高叶片抗病性；A为紫外灯下叶片发病面积；B为叶片发病面积统计和免疫印迹分析，*表明多重比较差异显著；

图3附图为同源基因在本氏烟中的沉默片段；

图4附图为本氏烟中VIGS沉默StCBL4基因明显降低叶片抗病性；A为紫外灯下叶片发病表型观察；B为病斑面积统计分析；C为叶片中StCBL4基因沉默效率分析，*表明多重比较差异显著；

图5附图为马铃薯转基因植株生产流程示意图；

图6附图为马铃薯过表达StCBL4转基因植株基因相对表达量分析图；

图7附图为马铃薯过表达StCBL4转基因植株抗病性测定；A为马铃薯茎部发病表型观察；B为病斑直径统计分析；

图8附图为马铃薯过表达StCBL4转基因植株抗病相关基因表达谱分析；A为StPR1相对表达量；B为StPti5相对表达量；C为StPAL相对表达量；D为StWRKY26相对表达量；

图9附图为马铃薯过表达StCBL4转基因植株ROS测定图；A为WT和StCBL4转基因植株叶片的DAB染色；B为H

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料与方法

病原菌：立枯丝核菌AG3是黑龙江省农业科学经济作物研究所保存的菌株，在25℃条件PDA培养1周后，使用打孔器打5mm直径的菌饼进行接种实验。

植物材料和生长条件

马铃薯种质资源在人工气候箱内培养，条件为25℃，光暗比为16:8。本氏烟的培养条件为白天25℃下14小时、晚上20℃下10小时。所有试验用到的对照和处理植株均为3次生物学样品重复。

实施例1RNA提取，基因克隆和StCBL4序列分析

总RNA提取采用商业化提取试剂盒，方法按照技术手册进行。RNA浓度使用NanoDrop 1000微量分光光度仪测定。使用GoScript

ATGCTTGCTTTAACGGGCTGTTTTCGTTCCATGAGATCTCGACATCCACCTGGATTCGAGAACCATGATCTACTAGCTTCTGAGACTTCATTTTCTGTTAATGAAGTGGATGCATTGTATGTTCTGTATGGAAAACTTAGCAGCTCCATAATTGATGATGGTCTTATTCATAAGGAAGAGTTTCTCCTTGCACTCTTCAACTGTAGCCTTAAGCAAAATCTTTTCGCACAGAGATTGTTTGATTTGTTTGATATTAAGCATAACGGAGTTATTGAGTTTGGAGAATTTGTTCGGTCATTAAGCATATTCCATCCAAGGACTCCTCAAGCAGACAAAATTGAATTTGCATTTAAGTTGTATGACTTGAGGCAAACTGGATTCATAGAACGCGATGAGTTGAAGGAAATGGTATTTGCTATACTGAAGGAATCAGATTTGATACTTCCAGATGACGCTATCGAAGCAATTGTTGATAAGACATTCGTAGAGGCTGACACGAAAGGAGATGGACGGATCGATCCAGAAGAGTGGAAGGAATTGGTCACAAGATACCCTTCTATCATCAAGAACATGACTCTACCATTCCTGAAGGAAATAACTCAAATGTTTCCAAGCTTTGTGTTGACAACTGAAGCTCAAGATTCACAACTAGTGTTTGAGTAA，如SEQ ID NO.1所示；

MLALTGCFRSMRSRHPPGFENHDLLASETSFSVNEVDALYVLYGKLSSSIIDDGLIHKEEFLLALFNCSLKQNLFAQRLFDLFDIKHNGVIEFGEFVRSLSIFHPRTPQADKIEFAFKLYDLRQTGFIERDELKEMVFAILKESDLILPDDAIEAIVDKTFVEADTKGDGRIDPEEWKELVTRYPSIIKNMTLPFLKEITQMFPSFVLTTEAQDSQLVFE*，如SEQ ID NO.2所示。

实施例2载体构建和亚细胞定位

本氏烟中的瞬时表达试验使用pCAMBIA1300-35S-HA载体构建35S:HA-StCBL4。重组质粒电转入GV3101后，通过农杆菌介导法转化到本氏烟中，以空载35S:HA为对照。构建pCAMBIA1300-35S-CBL4-GFP重组质粒。通过农杆菌介导的瞬时表达，将绿色荧光蛋白(GFP)融合构建物在本氏烟叶片中表达。荧光信号在注射后48小时使用共聚焦显微镜观察，激发波长为488-nm，发射波长为495-540nm。激光共聚焦显微镜分析显示StCBL4-GFP定位于质膜。

实施例3马铃薯被丝核菌侵染后基因StCBL4会上调表达

通过转录组分析，对StCBL4的表达进行初步筛选，初步确定了马铃薯感染立枯丝核菌病能够诱导StCBL4基因的表达。因此，测定了该基因在尤金885中不同时间点的表达变化和接种7天后不同种质资源中的表达变化。结果见图1；表明StCBL4在立枯丝核菌侵染过程中表达明显上调。更具体地说，StCBL4表达上调，并在接种24时后达到峰值，比对照组高11.18倍。此外，实时荧光定量分析表明，与有症状的马铃薯植株相比，除了中薯五号中的StCBL4基因未显著上调表达外，该基因在无症状马铃薯植株中均显著上调表达。基于这些观察结果，推测StCBL4可能参与了宿主对立枯丝核菌侵染的应答。

实施例4StCBL4瞬间表达增强本氏烟对立枯丝核菌的抗性

为了研究StCBL4是否能增强寄主对立枯丝核菌的抗性，以空载体(EV)为对照，采用农杆菌介导的瞬时表达方法，在本氏烟中瞬时表达StCBL4-HA。见图2，如图2A所示，与对照相比，表达StCBL4-HA的叶片病斑面积明显小于表达1300-HA的叶片，这表明过表达StCBL4可以增强本氏烟对立枯丝核菌病的抗性。同时，如图2B所示，免疫印迹分析表明在本氏烟中StCBL4-HA的表达可被检测到。

实施例5病毒介导的基因沉默(VIGS)

为了解本氏烟中同源基因的功能，对马铃薯、本氏烟和拟南芥三种植物中的CBLs进行了系统发育分析。在本氏烟中，取同源基因cDNA的300bp PCR片段以反义方向在EcoRⅠ和KpnⅠ位点之间克隆到pBinary tobacco rattle virus(TRV)载体，构建病毒诱导基因沉默(virinduced gene silencing,VIGS)；同源基因沉默片段如图3所示；如前所述，构建GFP的TRV重组质粒作为阴性对照，以表达NbPDS片段的TRV构建物作为阳性对照。2-3周后通过荧光定量RT-PCR检测基因沉默水平。感染TRV:NbPDS的烟草植株在10天后开始出现光漂白现象。3周后，提取了转入TRV:NbCBL重组质粒的农杆菌渗透植株叶片的mRNA，并使用qRT-PCR验证了NbCBL沉默的有效性。qRT-PC R分析结果证实，NbCBL在叶片中的表达被沉默，沉默植株的平均表达水平比阴性对照植株(TRV:GFP)低22％左右。如图4所示，TRV:NbCBL植株接种立枯丝核菌2天后，叶片在接种部位表现出明显的病害症状。在60hpi下测量病变直径，与TRV:GFP对照相比，携带TRV:NbCBL结构的植株病变直径显著增加。TRV:NbCBL基因的沉默导致了立枯丝核菌危害的增加，这表明该基因的表达在本氏烟对立枯丝核菌病的防御反应中起重要作用。

实施例6过表达StCBL4增强马铃薯对立枯丝核菌病的抗性

将StCBL4基因克隆到pBWA(V)KS载体中，利用农杆菌介导的马铃薯转化方法将其转化到根癌农杆菌EHA105菌株中，该过程由武汉伯远生物科技有限公司完成。转基因再生植株移植于含50mg/L卡那霉素的标准MS培养基中。通过RT-PCR检测潮霉素靶标位点，证实转基因植株的阳性世代。空载体转化植物作为野生型(WT)对照，见图5；

qRT-PCR分析结果如图6所示，过表达植株中，与对照相比StCBL4上调了约30倍。随后，用野生型WT和过表达的转基因植株进行接种试验，在相同条件下生长3天后检测发病情况。与野生型植株相比，转基因植株在10dpi时出现茎溃疡病症状的植株较少，如图7；这表明在转基因植株中过表达这些基因可以延迟溃疡病的发展，从而可能改变立枯丝核菌病的侵染过程。

过表达StCBL4的植物中，致病相关基因表达上调。通过qRT-PCR检测了StCBL4过表达植株在3dpi水平上的植物防御基因(StPR1、StPti5、StPAL和StWRKY26)的表达水平，以了解其增强抗性的分子机制。结果显示，与野生型相比，StCBL4过表达的植株中StPR1的表达量上调了2.67倍。同时，St Pti5、StWRKY26和StPAL在StCBL4过表达转基因植株中的表达量为8.14倍，3.49倍，54.46倍，见图8。

实施例7活性氧爆发试验

将过表达上述基因的马铃薯植株培养在23℃、光照16h/黑暗8h的恒温箱中。生长3～4周后，测定离体叶片中ROS产物H

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。