一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法，涉及药用植物组织培养领域，以2年生以上的西南天门冬新发嫩芽枝条作为外植体，包括以下步骤：植体消毒、愈伤组织诱导、丛生芽诱导、生根诱导和炼苗驯化，在炼苗驯化步骤中先将幼苗浸泡于促根溶液，促进幼苗生根，再栽培于苗床基质为泥炭土、腐殖土和河沙按比例为2:1:1配制而成的苗床上，通过组培方法获得西南天门冬种苗。组培各阶段诱导率高，且具有显著的种苗成活率，本发明组培周期短，整个周期为2～3月，进而降低生产成本，适合在西南天门冬优良无性系种苗的规模化生产中推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及药用植物组织培养技术领域，具体涉及一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法。

背景技术

西南天门冬[Asparagus munitus Wang et S.C.Chen]为百合科天门冬属多年生攀援草本植物，别名天冬，以干燥块根入药，是我国传统常用中药材，具有养阴润燥、清肺生津功效，主治肺燥干咳，腰膝酸痛，内热消渴，咽干口渴等。另外，研究发现，西南天门冬具有抗肿瘤、抑菌、镇咳祛痰等药理作用。近年来，随着人们生活水平的不断提高，对西南天门冬的需求不断增加，而西南天门冬野生资源遭到过度采挖，濒临枯竭。

西南天门冬的繁殖方式主要包括分株繁殖和种子繁殖，分株繁殖是将花卉的萌蘖枝，丛生枝，吸芽，匍匐枝等从母株上分割下来，另行栽植为独立新植株的方法，但是分株繁殖增殖系数较低，成活率受诸多因素影响；种子繁殖法即有性繁殖法，是利用雌雄受粉相交而结成种子来繁殖后代，但是种子繁殖发芽率低，整齐度不高，出苗所需时间长，管理费时费工。

近年来，各地虽有小规模种植西南天门冬，但主要以种子繁育种苗，西南天门冬的萌发率和成活率均较低，严重制约规模化发展，利用组织培养快繁方法规模化生产种苗势在必行。本发明为珍稀濒危药用植物西南天门冬进行人工开发利用与野生资源有效保护提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决现有西南天门冬种植方法种植的西南天门冬萌发率和成活率较低的技术问题，本发明提供一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法。

本发明为了实现上述目的，采用的技术方案如下：

一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体消毒：采集2年生以上的西南天门冬新发嫩芽枝条作为外植体，置于清水中浸泡5-7h后，将外植体洗净并用无菌滤纸吸干水分，然后置于消毒液中浸泡，再用无菌水漂洗5次后再次使用无菌滤纸吸干水分，最后使用解剖刀剪掉外植体的枝条叶片，并将外植体剪成2-3cm的带芽茎段；

(2)愈伤组织诱导：将大小和长势相同的外植体接种在愈伤组织诱导培养基中培养25-30d，外植体的切口处萌发愈伤组织；

(3)丛生芽诱导：将外植体诱导长势一样的愈伤组织分成大小一致的愈伤组织小块，接种到丛生芽诱导培养基中培养15-20d，愈伤组织生长成丛生芽；

(4)生根诱导：将丛生芽接种于生根诱导培养基中培养20-25d，丛生芽生根形成幼苗；

(5)炼苗驯化：将形成幼苗的生根诱导培养基置于大棚内炼苗7-10d，之后使幼苗暴漏于大棚环境自然放置5-7d，然后取出幼苗，并洗净根部的培养基，再将幼苗置于促根溶液中浸泡3min，促进幼苗生根，按8×8cm行株距将幼苗栽培于苗床基质上。

进一步的，步骤(5)炼苗驯化中所述促根溶液的制备方法包括以下步骤：将促根剂与水按比例为1:800混合，搅拌均匀后形成促根溶液。

进一步的，所述促根剂包括水杨酸、阿司匹林或吲哚乙酸等。

进一步的，所述苗床基质由泥炭土、腐殖土和河沙按比例为2:1:1配制而成。

进一步的，步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基为在基本培养基中添加0.9-1.1mg/L6-BA和0.4-0.6mg/L NAA，步骤(3)所述丛生芽诱导培养基为在基本培养基中添加0.9-1.1mg/L6-BA和0.4-0.6mg/L IAA，步骤(4)所述生根诱导培养基为在基本培养基中添加0.9-1.1mg/LIBA和0.9-1.1mg/L NAA。

进一步的，所述愈伤组织诱导培养基、丛生芽诱导培养基和生根诱导培养基的基本培养基均为：MS+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8。

进一步的，步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基、步骤(3)所述丛生芽诱导培养基和步骤(4)所述生根诱导培养基的培养条件均为：组培室中光照强度1200lx，光照时间为12h/d，温度为23℃～27℃，湿度为30％～50％。

进一步的，步骤(1)所述消毒液包括0.1％升汞溶液和75％乙醇溶液，所述外植体依次浸泡于0.1％升汞溶液和75％乙醇溶液中。

进一步的，所述外植体在0.1％升汞溶液中浸泡2min，所述外植体在75％乙醇溶液中浸泡5min。

进一步的，步骤(4)所述的将丛生芽接种于生根诱导培养基中培养，所述丛生芽选取高度为0.5cm以上的丛生芽。

本发明具有以下有益效果：

本发明与现有西南天门冬法繁殖的技术相比，本发明对西南天门冬组培快繁方法进行了激素配比优化选择，以及配合炼苗驯化步骤中将幼苗浸泡于促根溶液后再将幼苗种植在配制好苗床基质的苗床上，使西南天门冬种苗组培各阶段诱导率和种苗成活率高，且种苗成活率显著，成活率高达92％。本发明整个组培快繁周期为2～3个月，组培快繁周期短，极大降低了生产企业的生产成本。本发明具有步骤简单、易于操作、投入产出比高、使用效果好等特点。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体消毒：采集2年生以上的西南天门冬新发嫩芽枝条作为外植体，置于清水中浸泡6h后，将外植体洗净并用无菌滤纸吸干水分，然后将外植体移至超净工作台，外植体是依次置于0.1％升汞溶液中浸泡2min，75％乙醇溶液中浸泡5min，再用无菌水漂洗外植体5次后再次使用无菌滤纸吸干水分，最后使用解剖刀剪掉外植体的枝条叶片，并将外植体剪成2-3cm的带芽茎段；

(2)愈伤组织诱导：将大小和长势相同的外植体使用镊子轻轻夹起外植体，接种在愈伤组织诱导培养基中，再将愈伤组织诱导培养基置于无菌组培室中培养30d，当培养周期为15d时，外植体的切口处萌发愈伤组织，诱导率达83.3％，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(3)丛生芽诱导：将外植体诱导长势一样的愈伤组织分成大小一致的愈伤组织小块，接种到丛生芽诱导培养基中，再将丛生芽诱导培养基置于无菌组培室中培养15d，愈伤组织生长成丛生芽，诱导率达80％，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(4)生根诱导：选取高度为0.5cm以上的丛生芽接种于生根诱导培养基中，再将生根诱导培养基置于无菌组培室中培养20d，丛生芽均生根形成幼苗，诱导率达86.6％，平均根长2.7cm，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(5)炼苗驯化：将形成幼苗的生根诱导培养基置于大棚内炼苗7d，接着打开生根诱导培养基的瓶盖自然放置5d，然后取出幼苗并洗净根部的培养基，再将幼苗置于稀释800倍的水杨酸溶液中浸泡3min，促进幼苗生根，按8×8cm行株距将幼苗栽培于苗床基质上，苗床基质由泥炭土、腐殖土和河沙按比例为2:1:1配制而成，种苗成活率达92％。

所述愈伤组织诱导培养基包括以下成分：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8；

所述丛生芽诱导培养基包括以下成分：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8；

所述生根诱导培养基包括以下成分：MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/L NAA+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

所述愈伤组织诱导培养基、丛生芽诱导培养基和生根诱导培养基均是提前放置在培养瓶内，各个阶段培养均是在密封的培养瓶内进行，当将生根诱导培养基的培养瓶移至大棚内经过练苗后，才打开培养瓶的瓶盖自然放置，幼苗得以与外环境接触，使得幼苗适应外环境的生长条件。

实施例2

一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体消毒：采集2年生以上的西南天门冬新发嫩芽枝条作为外植体，置于清水中浸泡7h后，将外植体洗净并用无菌滤纸吸干水分，然后将外植体移至超净工作台，外植体是依次置于0.1％升汞溶液中浸泡2min，75％乙醇溶液中浸泡5min，再用无菌水漂洗外植体5次后再次使用无菌滤纸吸干水分，最后使用解剖刀剪掉外植体的枝条叶片，并将外植体剪成2-3cm的带芽茎段；

(2)愈伤组织诱导：将大小和长势相同的外植体使用镊子轻轻夹起外植体，接种在愈伤组织诱导培养基中，再将愈伤组织诱导培养基置于无菌组培室中培养30d，当培养周期为15d时，外植体的切口处萌发愈伤组织，诱导率达82％，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(3)丛生芽诱导：将外植体诱导长势一样的愈伤组织分成大小一致的愈伤组织小块，接种到丛生芽诱导培养基中，再将丛生芽诱导培养基置于无菌组培室中培养20d，愈伤组织生长成丛生芽，诱导率达85％，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(4)生根诱导：选取高度为0.5cm以上的丛生芽接种于生根诱导培养基中，再将生根诱导培养基置于无菌组培室中培养25d，丛生芽均生根形成幼苗，诱导率达87％，平均根长2.4cm，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(5)炼苗驯化：将形成幼苗的生根诱导培养基置于大棚内炼苗10d，接着打开生根诱导培养基的瓶盖自然放置7d，然后取出幼苗并洗净根部的培养基，再将幼苗置于稀释800倍的吲哚乙酸溶液中浸泡3min，促进幼苗生根，按8×8cm行株距将幼苗栽培于苗床基质上，苗床基质由泥炭土、腐殖土和河沙按比例为2:1:1配制而成，种苗成活率达88％。

所述愈伤组织诱导培养基包括以下成分：MS+0.9mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8；

所述丛生芽诱导培养基包括以下成分：MS+0.9mg/L 6-BA+0.4mg/L IAA+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8；

所述生根诱导培养基包括以下成分：MS+1.0mg/L IBA+0.9mg/L NAA+0.9g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

所述愈伤组织诱导培养基、丛生芽诱导培养基和生根诱导培养基均是提前放置在培养瓶内，各个阶段培养均是在密封的培养瓶内进行，当将生根诱导培养基的培养瓶移至大棚内经过练苗后，才打开培养瓶的瓶盖自然放置，幼苗得以与外环境接触，使得幼苗适应外环境的生长条件。

实施例3

一种西南天门冬嫩芽组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体消毒：采集2年生以上的西南天门冬新发嫩芽枝条作为外植体，置于清水中浸泡5h后，将外植体洗净并用无菌滤纸吸干水分，然后将外植体移至超净工作台，外植体是依次置于0.1％升汞溶液中浸泡2min，75％乙醇溶液中浸泡5min，再用无菌水漂洗外植体5次后再次使用无菌滤纸吸干水分，最后使用解剖刀剪掉外植体的枝条叶片，并将外植体剪成2-3cm的带芽茎段；

(2)愈伤组织诱导：将大小和长势相同的外植体使用镊子轻轻夹起外植体，接种在愈伤组织诱导培养基中，再将愈伤组织诱导培养基置于无菌组培室中培养25d，当培养周期为15d时，外植体的切口处萌发愈伤组织，诱导率达85.2％，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(3)丛生芽诱导：将外植体诱导长势一样的愈伤组织分成大小一致的愈伤组织小块，接种到丛生芽诱导培养基中，再将丛生芽诱导培养基置于无菌组培室中培养17d，愈伤组织生长成丛生芽，诱导率达84％，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(4)生根诱导：选取高度为0.5cm以上的丛生芽接种于生根诱导培养基中，再将生根诱导培养基置于无菌组培室中培养23d，丛生芽均生根形成幼苗，诱导率达85％，平均根长2.4cm，无菌组培室的培养条件包括光照强度为1200lx、光照时间为12h/d、温度为23℃～27℃、湿度30％～50％；

(5)炼苗驯化：将形成幼苗的生根诱导培养基置于大棚内炼苗8d，接着打开生根诱导培养基的瓶盖自然放置6d，然后取出幼苗并洗净根部的培养基，再将幼苗置于稀释800倍的阿司匹林溶液中浸泡3min，促进幼苗生根，按8×8cm行株距将幼苗栽培于苗床基质上，苗床基质由泥炭土、腐殖土和河沙按比例为2:1:1配制而成，种苗成活率达85％。

所述愈伤组织诱导培养基包括以下成分：MS+1.1mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8；

所述丛生芽诱导培养基包括以下成分：MS+1.1mg/L 6-BA+0.6mg/L IAA+7.2g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8；

所述生根诱导培养基包括以下成分：MS+1.1mg/L IBA+1.1mg/L NAA+0.9g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

所述愈伤组织诱导培养基、丛生芽诱导培养基和生根诱导培养基均是提前放置在培养瓶内，各个阶段培养均是在密封的培养瓶内进行，当将生根诱导培养基的培养瓶移至大棚内经过练苗后，才打开培养瓶的瓶盖自然放置，幼苗得以与外环境接触，使得幼苗适应外环境的生长条件。

对比例1

本实施例的步骤(1)-(4)与实施例1相同，(5)炼苗驯化：将形成幼苗的生根诱导培养基置于大棚内炼苗7d，接着打开生根诱导培养基的瓶盖自然放置7d，然后取出幼苗并洗净根部的培养基，按8×8cm行株距将幼苗栽培于苗床基质上，苗床基质由泥炭土、腐殖土和河沙按比例为2:1:1配制而成，种苗成活率达73％。

将本发明实施例1与对比例1进行对比，本发明实施例1的步骤(5)中先将洗净根部培养基的幼苗先浸泡于促根溶液中，再栽培于苗床上，对比例1的步骤(5)未将洗净根部培养基的幼苗浸泡于促根溶液中，直接栽培于苗床上，本发明的种苗成活率为92％，对比例1的种苗成活率为73％。本发明实施例1与对比例1进行对比表明本发明的方法具有显著性的提高种苗成活率，将幼苗浸泡于促根溶液中，为幼苗提供充足的营养成分，促进幼苗生根，进而提高幼苗栽培于苗床上时，提高幼苗的成活率。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。