一种基于16s rRNA的牛链球菌引物组及其LAMP检测方法

摘要

本发明提供了一种基于16s rRNA的牛链球菌引物组及其LAMP检测方法，该技术涉及分子诊断的快速检测技术领域。所述引物组包括引物F3‑3、B3‑3、FIP‑3、BIP‑3、FL‑3和BL‑3；所述引物F3‑3、B3‑3、FIP‑3、BIP‑3、FL‑3和BL‑3的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.18所示；所述LAMP检测方法包括所述检测试剂、反应条件和引物组。用牛链球菌保守性序列16s rRNA设计引物建立的特异牛链球菌LAMP检测方法能在检测现场不需特殊PCR扩增仪器，在30‑60分钟内快速完成特异扩增，结果肉眼可视，具有敏感性高、特异性强、无需特殊设备的特点，可实现在牧区、农场、屠宰场、食品厂以及环境等应用场景对牛链球菌感染的实时快速检测，有利于及时对牛病的快速现在诊断和对牛链球菌的快速识别，对牛链球菌引起的感染疾病治疗以及牛链球菌的疫情防控提供了分子新诊断组合。

说明书

技术领域

本发明涉及分子诊断的快速检测技术领域，具体涉及一种基于16s rRNA的牛链球菌引物组及其LAMP检测方法。

背景技术

牛链球菌(Streptococcus bovis)是瘤胃中常见的一种兼性厌氧菌，属D群链球菌，包括4个不同的种，即马链球菌(Streptococcus equinus)、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)、婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)和解乳链球菌(Streptococcus alactolyticus)。1945年McNeal和Blevins首次报道牛链球菌可引起感染性心内膜炎，且牛链球菌心内膜炎与结肠癌存在相关性。牛链球菌不仅是胃肠道常在菌，也是一种严重的致病菌，可引起败血症和心内膜炎。胃肠道是该菌常见的入侵途径，泌尿道、肝胆系统等也是其可能的入侵途径。牛链球菌能引起人及动物相互感染，为饲养业带来巨大的经济损失，因此应高度重视链球菌的危害性，保障人类健康和食品安全，有效地控制牛链球菌病的流行和传播，保障养殖业的健康和可持续发展。

目前，牛链球菌的检测主要依靠细菌分离培养和16s rRNA测序技术，但细菌的分离培养复杂耗时、需要在专业实验室内由专业技术人员操作，因此测序技术需要专业的测序公司才能完成，无法实现在畜牧场对感染牛链球菌的牲畜进行快速现场检测。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)将靶基因与4到6个引物耦合，利用Bst DNA聚合酶的链置换活性在恒温条件下高效扩增，可以通过观察荧光扩增曲线、或者添加核酸染料等指示剂进行扩增结果的判断，具有敏感性高、特异性强、无需特殊设备等特点，可应用于病原微生物的检测。

发明内容

针对上述问题，本发明利用牛链球菌保守性序列16s rRNA设计引物组，提高了牛链球菌检测的敏感性和特异性；利用该牛链球菌引物组建立LAMP检测方法，无需特殊设备、所用时间短、结果通过肉眼易判断，可实现在农场、畜牧场等地点对牛链球菌感染的实时检测有利于及时治疗感染患畜，减少经济损失。

本发明采用下述的技术方案：

本发明提供了一种基于16s rRNA的牛链球菌引物组，利用牛链球菌保守性序列16s rRNA设计得到引物组，所述引物组包括引物F3-3、B3-3、FIP-3、BIP-3、FL-3和BL-3；所述引物F3-3、B3-3、FIP-3、BIP-3、FL-3和BL-3的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ IDNo.18所示；所述引物组对牛链球菌有很高的特异性和敏感性。

本发明提供了一种基于16s rRNA的牛链球菌LAMP检测方法，包括利用检测试剂、扩增反应条件和所述的引物组对牛链球菌进行LAMP检测。

进一步的，所述检测试剂包括1.4mmol/L dNTP Mix、20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH

进一步的，所述酸碱指示剂选自苯酚红、酚红、溴百里酚蓝、中性红、酚磺酞、甲酚红、玫红酸中的任一种。

进一步的，所述酸碱指示剂为苯酚红，若检测试剂由红色变为橙黄色，则为牛链球菌阳性；当羟基萘酚蓝作为指示剂时阴阳性在肉眼观察时不明显；当钙黄绿素作为指示剂时需在反应后加入不便于应用；而苯酚红作为指示剂变色明显且对反应没有影响。

进一步的，所述引物F3-3、B3-3、FIP-3、BIP-3、FL-3和BL-3的浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L、1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L。

进一步的，所述扩增反应时间为30-60min、温度为60-67℃。

进一步的，所述最佳扩增反应温度为65℃、时间为30min

进一步的，所述LAMP方法检测牛链球菌16s rRNA基因的检测限为1.0×10

基于16s rRNA的牛链球菌引物组及其LAMP检测方法在牛链球菌检测试剂盒中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供的牛链球菌引物组是以16s rRNA为模板设计，对牛链球菌具有特异性高的特点；通过LAMP扩增反应后溶液颜色发生改变，肉眼观察即可判别样本中是否含有牛链球菌；本发明提供的牛链球菌核酸扩增方法对设备要求低，不需要大型仪器设备，在野外、家庭、农场等均可操作；操作方法简单，无需复杂的培训或专业技术人员。解决了现有检测技术所需时间长、工作量大、操作复杂等不足。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1为牛链球菌16s rRNA基因引物组合1-5筛选结果；

图2为牛链球菌16s rRNA基因引物组合1特异性结果；

图3为牛链球菌牛链球菌16s rRNA基因温度可视化筛选结果；

图4为琼脂糖凝胶电泳验证牛链球菌16s rRNA基因温度可视化筛选结果；

图5为牛链球菌16s rRNA基因温度筛选扩增曲线；

图6为牛链球菌16s rRNA基因温度筛选可视化结果；

图7为牛链球菌16s rRNA基因可视化检测结果；

图8为琼脂糖凝胶电泳验证牛链球菌16s rRNA基因可视化结果；

图9为牛链球菌16s rRNA基因LAMP检测特异性扩增曲线；

图10为牛链球菌16s rRNA基因LAMP检测特异性扩增条带；

图11为LAMP方法检测牛链球菌16s rRNA基因的灵敏度荧光扩增曲线；

图12为LAMP方法检测牛链球菌16s rRNA基因的灵敏度琼脂糖电泳条带；

图13为LAMP方法检测牛链球菌16s rRNA基因的灵敏度可视化检测结果；

图14为牛链球菌16s rRNA基因标准质粒拷贝数与LAMP荧光扩增曲线的线性回归分析。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

将牛链球菌DNA裂解样本作为阳性对照，不加DNA裂解物作为阴性样本，进行LAMP检测方法的建立。将所述引物组合与反应体系配制成25μL体系在65℃恒温条件下扩增30-60min后观察结果。利用酸碱指示剂苯酚红建立可视化检测系统，在反应结束后肉眼观察体系为橙黄色则为阳性结果，体系为红色则为阴性结果。利用SYBR Green I建立荧光定量检测系统对所建立的LAMP检测方法进行定量验证，根据荧光定量扩增曲线判读检测结果，出现特异性扩增曲线为阳性结果，未出现扩增曲线为阴性结果。LAMP检测方法建立过程中用2％琼脂糖凝胶电泳验证检测结果的可靠性。

实施例一牛链球菌16s rRNA引物的设计

根据牛链球菌16s rRNA靶基因，设计出5套引物组合：组合1(F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1，序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示)、组合2(F3-2、B3-2、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2，序列分别如SEQ ID No.7～SEQ ID No.12所示)、组合3(F3-3、B3-3、FIP-3、BIP-3、FL-3和BL-3，序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.18所示)、组合4(F3-4、B3-4、FIP-4、BIP-4、FL-4和BL-4，序列分别如SEQ ID No.19～SEQ ID No.24所示)、组合5(F3-5、B3-5、FIP-5、BIP-5、FL-5和BL-5，序列分别如SEQ ID No.25～SEQ ID No.30所示)。引物合成自生工生物有限公司。经过实验验证，引物组合1和组合3对阴性和阳性样本具有较好的检测能力，组合2不能工作，组合4和5出现非特异性扩增(图1)。后续验证发现引物组合1特异性较差，在乙型链球菌、甲型链球菌、副溶血弧菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌均出现非特异性扩增(图2)，引物组合3特异性较好(图7、8)。因此筛选出最佳的引物组合3，其中包括引物F3-3、B3-3、FIP-3、BIP-3、FL-3和BL-3。具体如下：

F3-3：GTGGGGAGCAAACAGGATT(SEQ ID No.13)

B3-3：CCTGGTAAGGTTCTTCGCG(SEQ ID No.14)

FIP-3：CGGCACTAAGCCCCGGAAAG-GTAGTCCACGCCGTAAACG(SEQ ID No 15)

BIP-3：CCTGGGGAGTACGACCGCAA-CATGCTCCACCGCTTGTG(SEQ ID No.16)

FL-3：GGCCTAACACCTAGCACTCAT(SEQ ID No.17)

BL-3：GGTTGAAACTCAAAGGAATTGACG(SEQ ID No.18)

实施例二基于16s rRNA牛链球菌引物组的LAMP检测反应条件

引物F3-3、B3-3、FIP-3、BIP-3、FL-3和BL-3的浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L、1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L。

检测试剂包括1.4mmol/L dNTP、20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH

为了筛选最佳反应温度，将扩增温度分别设置为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃和67℃，恒温扩增1h后观察可视化结果。如图3所示，该体系在60℃-67℃均能产生阳性扩增，肉眼可观察到变化，温度为65℃和66℃时阴性对照和阳性对照颜色差异最为明显。同时用2％琼脂糖凝胶电泳进行验证，如图4所示，用2％琼脂糖凝胶电泳可以看到在65℃时扩增条带最亮，67℃时出现非特异性扩增。因此，牛链球菌16s rRNA基因LAMP检测的最佳扩增温度为65℃。

为了筛选最佳扩增时间，将反应体系中的苯酚红换成SYBR Green I荧光染料，应用荧光定量PCR仪每1min测定一次反应体系的荧光值，绘制出荧光曲线，根据荧光曲线判读最佳反应时间。结果如图5所示，扩增反应在30min后进入平台期。同时，应用苯酚红酸碱指示剂，验证反应体系在65℃下反应10min、20min、30min、40min、50min、60min的显色性能。如图6所示，在反应30min后可视化体系显色明显。因此，牛链球菌16s rRNA基因LAMP检测的扩增时间为30-60min，在30min，65℃可得出较好的结果。

实施例三基于16s rRNA牛链球菌引物组的LAMP检测

在LAPM反应过程中，阳性扩增会不断消耗dNTPs生成新链以及焦磷酸镁、氢离子等副产物，溶液中pH值降低。因此，将反应体系中的SYBR Green I荧光染料换成苯酚红(变色范围pH 6.8-8.4，红色变为橙黄色)酸碱指示剂，在65℃水浴锅中反应30min后肉眼观察可视化检测结果。如图7所示，阴性对照为红色，阳性对照为橙黄色。同时用2％琼脂糖凝胶电泳验证可视化结果，如图8所示，阳性对照中可见扩增条带，阴性对照中无扩增条带。

实施例四牛链球菌16s rRNA基因LAMP检测的特异性

为了验证牛链球菌16s rRNA基因LAMP检测的特异性，应用牛链球菌和乙型链球菌、甲型链球菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌等10种对照菌株进行实验。牛链球菌、乙型链球菌和甲型链球菌购自宁波明舟生物科技有限公司，其余菌种为四川大学华西基础医学与法医学院微生物教研室保存菌株。如图9所示，荧光扩增曲线结果显示仅在牛链球菌出现扩增曲线，其他菌均未见扩增曲线。如图10所示，2％琼脂糖凝胶电泳与荧光扩增曲线结果一致，仅有牛链球菌出现扩增条带，其他菌株菌未见扩增条带。因此，本方法建立的牛链球菌16srRNA基因检测具有很好的特异性。

实施例五牛链球菌16s rRNA基因的灵敏度检测

为了确定LAMP方法检测牛链球菌16s rRNA基因的灵敏度，将链球菌16srRNA靶基因序列导入pUC57质粒(购自生工生物有限公司)建立标准品，将标准质粒稀释成1.0×10

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。