一种悬钩子属植物的DNA条形码及其应用

摘要

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及天目悬钩子的DNA条形码及其应用。本发明的DNA条形码能够通过如SEQ ID NO.1‑2所示的引物对扩增得到。采用该DNA条形码可以鉴定天目悬钩子，具体包括：(1)提取待鉴定悬钩子属植物的DNA；(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.1‑2所示引物进行PCR扩增；(3)对PCR扩增结果进行测序；(4)对测序结果进行拼接和比对；(5)根据比对结果判断待鉴定悬钩子属植物是否为天目悬钩子。本发明的分子标记可有效鉴定天目悬钩子。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及悬钩子属植物的DNA条形码及其应用。

背景技术

天目悬钩子(Rubus tianmuensis K.Zhang&Y.F.Yin)产安徽省、浙江省天目山一带，是最近鉴定出来的悬钩子属新种。生山坡、路边阳处，低海拔至中海拔地区。此种与掌叶复盆子(Rubus chingii)类似，区别在于后者叶为单叶掌状5深裂，而本种叶为鸟足状复叶，顶生小叶具明显小叶柄；掌叶复盆子叶两面仅沿叶脉有柔毛或几无毛，而本种叶两面均具短柔毛；掌叶复盆子托叶线状披针形，而本种花枝托叶披针形，托叶较宽且具明显柔毛；掌叶复盆子花梗无毛，而本种花梗具明显柔毛、短腺毛及钩状刺。虽然二者具有一些表型区别，但由于二者生境重叠，受环境影响，表型常有趋同，且在幼苗期或二者混生群体中，即便是专业人员仍难以通过表型明确鉴定。另外，该地区同时分布他种类悬钩子属物种有掌叶覆盆子、山莓、蓬蘽、高粱泡、插田泡、木莓、空心泡、红腺悬钩子、三花悬钩子，其中有些表型亦与天目悬钩子接近，影响天目悬钩子的鉴别。

发明内容

本发明主要针对上述技术问题，提供一种简便的分子标记的方法，实现天目悬钩子的鉴定。具体提供一种鉴定天目悬钩子的DNA条形码及其应用。

具体地，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种天目悬钩子的DNA条形码分子标记，所述DNA条形码为SEQ ID NO.3第224-229位的碱基序列，能够通过如SEQ ID NO.1-2所示的引物对扩增得到。

本发明利用高通量测序的方法，从天目悬钩子全基因组序列中组装出叶绿体基因组，并与NCBI上已发表的61种悬钩子属物种进行序列比对，发现天目悬钩子在rps16基因内含子中包含一个特异性的6bp插入序列，仅在天目悬钩子叶绿体基因组中存在。

进一步针对上述插入序列设计引物，使上述插入序列包含在引物扩增产物内部。

选择包括天目悬钩子在内的33个(21种)悬钩子属样品，设计引物进行PCR扩增。

对33个扩增产物进行桑格测序，并对比分析，发现该特异性的6bp插入序列是在天目悬钩子中稳定且特异性存在的。

第二方面，本发明提供用于扩增上述DNA条形码的引物。

本发明的引物包括如SEQ ID NO.1-2所示的序列。

第三方面，本发明提供含有上述引物的试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供包含上述引物的DNA芯片。

第五方面，本发明提供上述DNA条形码或引物或试剂或试剂盒或DNA芯片的以下任一应用：

(1)在鉴定天目悬钩子中的应用；

(2)在悬钩子属种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

(3)在悬钩子属杂交育种的筛选或创制不同悬钩子品种中的应用；

(4)在构建悬钩子属的DNA指纹数据库中的应用；

(5)在目悬钩子的种苗质量检测中的应用。

第六方面，本发明提供鉴定天目悬钩子的方法，包括：

(1)提取待鉴定悬钩子植物的DNA；

(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增结果进行测序；

(4)对测序结果进行拼接和比对；

(5)根据比对结果判断待鉴定悬钩子属植物是否为天目悬钩子。

其中，步骤(5)中判断待鉴定悬钩子属植物是否为天目悬钩子的方法如下：将测序序列与SEQ ID NO.3以及已知悬钩子属的rps16基因内含子进行比对，待鉴定悬钩子属植物的测序结果在对应SEQ ID NO:3的224-229碱基位点处含有6bp插入序列5’-ATTTAT-3’时，待鉴定悬钩子植物为天目悬钩子。

其中，步骤(2)中PCR扩增反应体系为25μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，上游引物(10μM)/下游引物(10μM)各1μL，DNA模板200-300ng，ddH2O补充至25μL。2×PhantaMax Master Mix包含了Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、dNTP、保护剂以及缓冲体系；扩增程序为：①95℃预变性3min；②95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸75s，35个循环；③72℃延伸5min；

采用本发明的单一DNA条形码分子标记就能够有效区分待测品种是否为天目悬钩子，为天目悬钩子的鉴定、种植、资源利用和育种提供保证。也对于悬钩子属物种分类、系统发育、系统地理学研究，以及保护和利用悬钩子属资源等方面都具有重要意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明的进行详细说明。

图1是天目悬钩子叶绿体基因组与Genbank上悬钩子属叶绿体基因组序列比对后筛查到的特异性标记位点。

图2是利用SEQ ID NO:1-2扩增33个(21种)悬钩子属样品的PCR产物测序后的比对结果，其中序列30为天目悬钩子高通量测序获得的SEQ ID NO:3，序列29为天目悬钩子PCR产物的桑格测序结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中使用的悬钩子属植物样品可通过市售购买途径获得，或者从野外采集。

实施例1天目悬钩子采集

天目悬钩子(Rubus tianmuensis K.Zhang&Y.F.Yin)产安徽省、浙江省天目山一带。生山坡、路边阳处，低海拔至中海拔地区。此种与掌叶复盆子(Rubus chingii)类似，该地区同时分布他种类悬钩子属物种有掌叶覆盆子、山莓、蓬蘽、高粱泡、插田泡、木莓、空心泡、红腺悬钩子、三花悬钩子。本发明天目悬钩子均采自天目山一带。

实施例2天目悬钩子特异性分子标记的开发

通过以下步骤获得天目悬钩子特异性分子标记，即DNA条形码：

1)采集天目悬钩子叶片；

2)提取天目悬钩子叶片总DNA；

3)对上述总DNA进行二代高通量测序，获得测序reads；

4)利用Noveplastys软件组装叶绿体基因组，获得目悬钩子的完整叶绿体基因组。

5)与Genbank上61个悬钩子属物种的叶绿体比较，筛查特异性标记位点。

结果见图1，天目悬钩子在rps16基因内含子中含有一个6bp的插入片段ATTTAT，该插入片段在其它悬钩子属物种中均不含有，属于天目悬钩子特异性插入片段，推测可作为DNA条形码用于天目悬钩子的物种鉴定。

实施例3天目悬钩子特异性分子标记的引物设计

根据实施例2中的比对结果，设计用于鉴定天目悬钩子的PCR引物，所述PCR引物产物包含天目悬钩子特异性插入片段5’-ATTTAT-3’，引物序列如下：

正向引物TM-F：5’-AAGTTTTCCCCTCGTACGGC-3’(SEQ ID NO:1)

反向引物TM-R:5’-GGAACAACTTCGTAAGTATATTTTCGA-3’(SEQ ID NO:2)

天目悬钩子PCR产物的碱基序列如下,其中下划线部分为天目悬钩子特有的插入片段：

5’-AAGTTTTCCCCTCGTACGGCTCGAGAAAATTAGAAATTATGTCTATGTATCGAATTACAATATCAAATATATCCATAAAATCATCAAATTAATTAGACTATAGATTTAAGTACTTTTTTTGTTATTCTTATCCAATCAAAAAAAAATTAGTCGTATTTGCACCCTCATAACTCAAGTTGGATAACTCTGAAATAACTCAAAAGAGAACCTTTTTAGATATTTC

实施例4天目悬钩子的鉴定方法

1)分别采集33个(21种)悬钩子属植物叶片作为待检测样品；

2)提取待检测样品的总DNA；

3)利用实施例3中设计的引物对，对上述样品的总DNA分别PCR；

PCR扩增反应体系为25μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，上游引物(10μM)/下游引物(10μM)各1μL，DNA模板200-300ng，ddH2O补充至25μL。2×Phanta Max Master Mix包含了Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、dNTP、保护剂以及缓冲体系；

PCR扩增程序为：为①95℃预变性3min；②95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸75s，35个循环；③72℃延伸5min；

4)PCR扩增产物检测：

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，10×Loading Buffer染色上样，于凝胶成像系统下观察PCR扩增情况，条带清晰且单一，可直接送去生物公司进行测序。。

5)测序结果拼接和比对：将测序结果导入软件Vector NTI 11.0进行序列拼接，然后利用Mafft软件进行序列比对。

从比对结果(图2)中可以看出，与包括表型上与天目悬钩子最近接的掌叶覆盆子在内的32个悬钩子属不同种样品相比，天目悬钩子(R2021016)在对应SEQ ID NO:3(图2序列30,编号为TMXGZ，序列为实施例1高通量测序组装结果)的224-229碱基位点处含有6bp插入序列5’-ATTTAT-3’。本发明方法可稳定可靠地对天目悬钩子进行物种鉴定。

综上所述，首先，本发明是传统物种鉴定的强有力补充，而且样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用植物新鲜或干燥叶片，如标本样品进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。其次，本发明能够对天目悬钩子和近缘种进行区分，能够在更高分辨率的水平上稳定、准确的对天目悬钩子和近缘种实施鉴定。最后，本发明方法可对于悬钩子属物种分类、系统发育、系统地理学研究，以及保护和利用悬钩子属资源等方面都具有重要意义。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。