一种治疗艰难梭菌感染的合成微生物群构建方法及应用

摘要

本发明涉及微生物，具体涉及一种利用多种方式筛选并构建合成微生物群并用于治疗艰难梭菌感染的方法；一种利用多种方式筛选并构建合成微生物群的方法，其特征在于包括以下步骤：肠道菌群数据库的筛选、单株菌的益生特性以及对艰难梭菌的抑制、合成微生物群对艰难梭菌的抑制以及抵抗侵袭作用；最后应用于小鼠艰难梭菌感染模型，可有效改善艰难梭菌感染导致的各种症状。该方法具有评估项目完善，合成微生物群稳定，且可达到治疗效果的优点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一组包含了十株不同细菌的合成微生物群的构建及其在治疗小鼠艰难梭菌感染模型的应用。

背景技术

艰难梭菌是一种革兰氏阳性菌，严格厌氧，可产芽孢，是一种条件致病菌，可引起肠道内的严重感染。艰难梭菌感染(CDI)是一种严重的传染性结肠炎，可引起伪膜性结肠炎、剧烈的腹泻甚至死亡，在全球范围内均具有一定的发病率和死亡率。通常认为，CDI的发生与滥用抗生素导致的肠道菌群被破坏有关，特别是克林霉素、广谱青霉素、头孢菌素和氟喹诺酮类药物。在肠道菌群平衡失调后，内源性或外源性的艰难梭菌大量增殖并取代了原本菌群的生态位，并产生作用于结肠上皮和免疫细胞的毒素，从而导致宿主的严重疾病。

先前治疗CDI主要依赖于甲硝唑、万古霉素、非达霉素等抗生素，但随着耐药性的增加以及CDI的复发性，粪菌移植(FMT)逐渐成为治疗复发性CDI的更好的疗法。FMT通过恢复肠道菌群的多样性，重建肠道黏膜屏障并且恢复菌群的代谢以达到治疗CDI的目的。但是，FMT同样存在一些已知的问题，例如伦理问题；造成抗生素耐药微生物的转移并导致死亡，以及与周围神经病变、特发性血小板减少性紫癜、干燥综合征和类风湿性关节炎等疾病的一些无法确定的联系。

合成微生物群落是合成生物学和微生物组的交叉领域，即包含多个物种的合成共培养体系。相比于FMT，合成微生物群的组成更加明确，菌株背景更加清晰，整个治疗过程的安全性也会相应的提高；而相较于单一益生菌则可以更好地适应环境变化，物种间不同的分工合作以及相互依赖使得整个体系可以完成更加复杂的任务。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于构建出对CDI有治疗作用，并规避FMT可能带来的危害，在具有明确疗效的同时更具安全性、稳定性及合规性的人工筛选的合成微生物群。

为了实现上述目的，本发明提供了合成微生物群的构建方法：对肠道菌群数据库的筛选；单株菌对艰难梭菌的抑制作用，完成合成微生物群的成员的挑选；单株菌的益生特性探究，确定其安全性与可用性；评估合成微生物群对艰难梭菌的抑制作用，完成体外对合成微生物群的评价。其有益效果是，构建方法可以有效地筛选出具有积极作用的菌株，并且所选择的单个菌株及构建的整个菌群均可以在某些指标达到抑制艰难梭菌的效果。

优选地，所述筛选包括选择出CDI后丰度下降严重的细菌。

优选地，所述单株菌抑制作用包括抑制艰难梭菌的生长、抑制群体感应信号分子的分泌和抑制艰难梭菌毒素B的生成。

优选地，所述益生特性包括不具有溶血性、可耐受胃肠道的低pH及胆盐存在的环境、不具有危害宿主的耐药性和具有抗氧化特性。

优选地，所述菌群抑制作用包括抑制艰难梭菌生物膜的生成以及帮助线虫抵御艰难梭菌侵袭。

本发明还提供了所合成的微生物群的在治疗小鼠CDI的应用，其有益效果是，可以有效治疗小鼠的CDI，降低死亡率等一系列风险。

进一步地，所述治疗应用包括提高小鼠生存率、降低临床症状评分、减轻结肠缩短、降低组织损伤评分，降低血清中炎症因子水平以及减少盲肠中艰难梭菌毒素B的含量。

附图说明

图1是单株菌对艰难梭菌的抑制生长作用。

图2是单株菌对艰难梭菌群体感应信号分子的生成抑制作用。

图3是单株菌对艰难梭菌毒素B的生成分泌抑制作用。

图4是单株菌在胃肠道环境模拟下的存活率。

图5是单株菌在体外的自由基清除率。

图6是合成微生物群对艰难梭菌的生物膜形成抑制作用。

图7是合成微生物群帮助线虫抵御艰难梭菌的侵袭。

图8是合成微生物群减轻了CDI小鼠的临床症状。

图9是合成微生物群减轻了CDI小鼠的盲肠及血清的炎症反应。

具体实施方式

以下实施例的目的均为进一步详细说明本发明，而非对本发明的限制。

BHIS培养基指添加了0.5％酵母提取物以及0.1％盐酸半胱氨酸的BHI培养基，PBS缓冲液指磷酸缓冲盐溶液。

实施例1：

数据库的数据筛选

肠道数据库选用基于人类肠道宏基因组数据，并对其进行注释的数据库“GMrepo”，将phenotype设置为“Clostridium Infections”，同时将年龄设置为大于2，对肠道内丰度较大的菌种进行逐一筛选，挑选出在CDI后丰度下降较大的菌种。

筛选结果：长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌、卵型拟杆菌以及嗜黏蛋白阿克曼菌。并且将已被证实对CDI具有治疗作用的鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌以及已应用于菌群失调相关疾病的活菌药物：地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌添加至候选目录中。

实施例2：

单株菌对艰难梭菌的抑制作用和益生特性

A.抑制艰难梭菌生长

在3mL的液体BHIS培养基中加入1mL所选菌株的过夜培养物的无细胞上清液以及100μL艰难梭菌的过夜培养物100μL，并以对应的无菌培养基作为空白对照，混匀后共培养(37℃，厌氧)。在混匀后的0h、1.5h、3h、4.5h、6h、8h、10h及12h测量共培养物的OD

短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌均可完全抑制艰难梭菌的生长；而长双歧杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜黏蛋白阿克曼菌和丁酸梭菌则可以明显减慢艰难梭菌的生长速度，并让达到平台期时的细菌浓度下降。两株拟杆菌则无影响。具体抑制效果详见图1。

B.抑制群体感应信号分子的生成

将所选菌株和艰难梭菌培养24h的培养物离心，并用无菌PBS缓冲液洗涤两次，接着将艰难梭菌与所选菌株的数量比调整至1∶10后接种至液体BHIS培养基中进行共培养(37℃，厌氧)。在白色96孔板内将20μL共培养8h后的无细胞上清液与180μL以1∶5000稀释后的报告菌株哈维氏弧菌BB170混匀，同时将无菌BHIS培养基作为阴性对照，在30℃、170rpm的条件下培养5h后测定发光量。

除了长双歧杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌均可显著抑制艰难梭菌群体感应信号分子的生成。具体效果详见图2。

C.抑制艰难梭菌毒素B的生成

将所选菌株和艰难梭菌培养24h并PBS缓冲液洗涤沉淀后，以1∶1的比例接种至液体BHIS培养基中共培养(37℃，厌氧)。共培养24h后取无细胞上清液使用ELISA法对毒素B进行定量。

除三株双歧杆菌和副干酪乳杆菌外均可显著抑制艰难梭菌毒素B的生成与分泌。具体效果详见图3。

D.益生特性

a.溶血试验

所选菌株均接种于添加了5％绵羊血的BHI琼脂平板上，并厌氧培养在37摄氏度下48小时，观察菌落周围是否存在溶血现象。

十株菌均无溶血现象出现。

b.抗生素耐药性

根据美国临床和实验室标准协会的试验标准，抗生素耐药性采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行评价。选用的抗生素为常用的广谱抗生素以及可用于肠道准备的抗生素，包括了：红霉素、链霉素、氯霉素、新霉素、氨苄西林、头孢拉定以及万古霉素。

所选菌株对绝大多数的抗生素都敏感，没有耐药性，安全性较高。

c.胃肠道环境模拟

取100μL所选菌株的24h培养物接种至新鲜配置的用HCl调节成不同pH值(2.0，2.5，3.0)或含有不同量的胆盐(0.1％，0.3％，0.5％(w/v))的液体培养基中，并将未调节pH或未添加胆盐的培养基作为对照组。培养24h后使用酶标仪测量OD

所选菌株均可以在给定条件下具有一定的存活率。具体如图4所示。

d.抗氧化特性

DPPH自由基清除实验。将1.2mL用甲醇配制的0.2M DPPH溶液与0.3mL所选菌株的无细胞上清液混匀，避光反应25min后，8000rpm离心1min，测定OD

羟基自由基清除实验。取1.4mL新鲜配制的包含水杨酸钠(5mM)，FeSO

超氧阴离子自由基清除实验。比色皿中依此加入0.25mL的无细胞上清液，0.25mL的邻苯三酚溶液(0.05M)，以及1.5mL的Tris-HCl(0.1M，pH 8.0)。反应5min后测定OD

以上三个实验的对照组均以无菌培养基替代无细胞上清液，且重复三次，自由基清除率＝(OD

所选菌株除地衣芽孢杆菌均具有不错的自由基清除能力，而地衣芽孢杆菌则仅具有一定的超氧阴离子自由基清除能力。具体如图5所示。

实施例3：

A.合成微生物群可以在体外抑制艰难梭菌生物膜的形成

在添加了0.1M葡萄糖的BHIS培养基中，将合成微生物群或者其培养后的无细胞上清液与艰难梭菌混合培养，于24孔板中培养(37℃，厌氧)，并于24h及72h后测定生物膜的生成量。首先将被无菌PBS缓冲液清洗两次的孔板干燥10min，然后用1mL 0.2％的结晶紫对生物膜染色，孵育30min(37℃，厌氧)。接着在PBS缓冲液清洗两次后，加入1mL甲醇并室温孵育30min。十倍稀释所用甲醇后，测量OD

所构建的合成微生物群无论是活菌共培养还是培养产物均可以明显地抑制艰难梭菌的生物膜形成，并且培养产物相较于活菌可以更加显著地抑制。具体如图6所示。合成微生物群在图中采用“B10”表示，下同。

B.合成微生物群可以在线虫模型抵御艰难梭菌的侵袭

在添加5-氟脱氧尿苷的线虫生长培养基上转移20条野生型N2线虫，事先培养24h合成微生物群和艰难梭菌。实验包括三组，其一喂养大肠杆菌OP50，其二喂养艰难梭菌，其三喂养艰难梭菌和合成微生物群，每日统计死亡数(20℃，有氧)。

合成微生物群可以显著地保护线虫免受艰难梭菌的毒害作用，并适当延长寿命。具体如图7所示。

实施例4：

A.合成微生物群改善小鼠CDI造成的临床症状

在实验期间基于评分标准对小鼠进行临床症状评分，并每日统计死亡数；再处死后测量小鼠结直肠的长度。

合成微生物群可以显著地降低小鼠的临床症状评分，有效地使小鼠存活并缓解结直肠的缩短。具体如图8所示。

B.合成微生物群减轻小鼠盲肠和血清中的炎症反应

在处死小鼠后收集盲肠以及血清样本，盲肠在H&E染色后观察组织损伤状况并基于评分标准进行评分；同时使用ELISA法测定小鼠血清中的炎症因子浓度，包括：白介素1α、白介素6、白介素17A以及肿瘤坏死因子α。

合成微生物群的治疗可以显著地减轻小鼠盲肠内的炎症情况，使得组织损伤评分下降，并且所测的四种炎症相关细胞因子均明显地下降至空白组水平。具体如图9所示。

综上，所构建的合成微生物群可以有效地抑制艰难梭菌并在小鼠体内产生治疗效果。所有数据统计学差异采用Student’s t-test或ANOVA进行分析，使用软件为MicrosoftExcel和GraphPad Prism 9。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001均视为具有统计学意义。