一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法

摘要

本发明公开了一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，包括S1猪睾丸的消毒、S2睾丸组织分离、S3第一次酶消化、S4第一次物理分离、S5第二次酶消化、S6第二次物理分离、S7细胞鉴定等步骤，从而实现猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法的整个过程。本发明一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，操作简单方便，分离出来的猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞均一度较高，无需其他纯化措施后续培养稳定性好，分离效率高；同时在细胞污染、分离纯化和鉴定、细胞质数量及量、分离法成本等方面均能够得到有效控制，有利于推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分离培养技术领域，具体为一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法。

背景技术

细胞是动物机体的基本的结构和功能单位。细胞的分离是所有相关生物领域研究的必要步骤。同样，细胞决定了所有研究领域的命运。随着技术的进步和所有相关领域的发展，掌握多样的细胞分离技术、降低劳动力成本、劳动时间、试剂成本和提高自动化程度显得至关重要。

从睾丸组织中分离细胞多采用多种分离法(酶消化法、机械法、酶消化和机械法结合，有的通过酶消化和过筛、有的用酶消化和梯度液)。各种分离法中的酶、浓度、筛子规格、还有消化及处理时间均有一定的差异。我们经过多年相关雄性分离培养支持细胞和间质细胞的研究积累，目前已经能够单独分离均一度达于90％以上的支持细胞和间质细胞。

体外培养支持细胞和间质细胞已成为研究睾丸机能、生殖毒理的重要细胞模型。同时对猪睾丸分离两种生殖细胞的技术目前还未见报道。多数的研究报道中都得经过低渗处理法Tris-HCL、差速贴壁法、消化法、反复抽吸生殖细胞、荧光激活细胞分选、密度梯度离心不连续梯度换培养液的饥饿方法等，多种纯化才能获得较高的均一度，但是细胞污染、分离纯化、鉴定方面、分离效率、细胞质数量及量、分离法成本、操作难易程度等方面任然存在着问题。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，以解决以上缺陷。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，包括以下步骤：

S1、猪睾丸的消毒：

A、将取自农场的未成熟猪的睾丸置于50mL离心管中，并用30mL碘伏颠倒震荡清洗每个睾丸；再用30mL 75％的乙醇清洗睾丸，摇动1-2min；最后用含2％P/S青链霉素的PBS溶液清洗睾丸，摇动1-2min；

B、重复上述步骤三次；

S2、睾丸组织分离：

用大镊子将消毒后的睾丸固定在细胞培养皿中，并手术剔除附和精囊，再重复S1中A步骤一次进行清洗消毒；然后用小镊子将睾丸固定在100mm培养皿内，在白膜上水平切开，用两个小镊子剥除白膜，再用含2％双抗的PBS润湿睾丸组织；将每份0.2～0.5g的睾丸组织置于1个60mm的培养皿中，并加入共计1mL的组织消化液a，用眼科剪尽量充分的将睾丸组织成匀浆状；

S3、第一次酶消化：

在S2步骤的60mm的每个培养皿里，继续分别加入4mL组织消化液a，利用巴氏吸管将组织匀浆与组织消化液a充分混匀，并转移至15mL离心管中；在34℃，210g离心条件下进行第一次消化，计时45min；将离心后的上层清液转移至离心管一中，对上层清液、下层组织分别进行下一步处理；

S4、第一次物理分离：

A、首先，用100目和200目不锈钢筛依次对S3步骤中离心管一的上层清液中的细胞进行过滤；其次，用含10％ FBS的DMEM/F-12溶液，收集100目和200目筛网上的细胞于15mL离心管中，并用DMEM/F-12溶液离心漂洗3次；然后，在34℃，210g离心条件下离心15min，收集到的细胞群中即包含有睾丸间质细胞；最后，利用含10％FBS的DMEM/F-12溶液重悬上述含有睾丸间质细胞的细胞群，并接入培养皿中，做好标记后进行培养；

B、首先，将40目、100目、200、400目不锈钢筛子依次摆放，并对步骤S3中的下层组织进行依次过筛；其次，用含10％ FBS的DMEM/F-12溶液进行反向冲洗，收集200目和400目筛网上截留的细胞和组织至60mm培养皿中，最后，收集至15mL离心管二中离心去除上层清液；

S5、第二次酶消化：

向S4中B步骤的去除上层清液的每个离心管二中加入组织消化液b，并在34℃，300g条件下边离心边消化，时长1h；再去除离心后的上层清液，在细胞沉淀中立即加入含有FBS的DMEM培养基，重悬细胞终止消化；

S6、第二次物理分离：

对S5步骤中重悬的细胞进行收集，并过500目筛，用含10％FBS的DMEM/F-12溶液反向冲洗，收集到的500目筛网上截留的细胞群即含有睾丸支持细胞；然后用培养基漂洗细胞3次，用含10％FBS的DMEM/F-12溶液重悬上述含睾丸支持细胞的细胞群，并接入培养皿中，做好标记后进行培养；

S7、细胞鉴定：

对S4的A步骤中置于培养皿培养的含睾丸间质细胞的细胞群、以及对S6步骤中置于培养皿培养的含睾丸支持细胞的细胞群分别均进行形态及结构鉴定，从而实现猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法的整个过程。

优选地，所述组织消化液a的配比为：P型胶原酶6mg、Dispase胶原酶5.5mg、HBSS+酚红5mL、PBS缓冲液5mL。

优选地，所述组织消化液b的配比为：0.25％Trypsin，45.00mL(5mL)和DNase I，5.00mg(1.1mg/mL)；DMEM，9mL(90％)；FBS，1mL(10％)。

优选地，所述10％ FBS的DMEM/F-12溶液，即为含10％ FBS的DMEM/F-12培养基，其中按体积百分比计，DMEM/F-12培养基占90％，FBS占10％。

优选地，所述DMEM/F-12培养基为1:1的液体培养基，其生产厂家为Cytiva，货号为SH30023.01。

优选地，步骤S7中的细胞形态及结构鉴定的方法包括显微镜观察鉴定法、HE染色法、油红O染色法、以及免疫荧光染色法。

优选地，所述HE染色法，其具体步骤为：首先，取待染色的细胞，移弃培养基用1000μL的PBS缓冲液漂洗；再使用95％，85％，75％乙醇各处理一次，每次2min；其次，用蒸馏水浸泡2min，苏木素染液染色15min，再蒸馏水洗去浮色；然后，用分化液分化3min；自来水冲洗2次，每次2min；最后，置伊红染液1min，蒸馏水稍洗3s，快脱水。

优选地，所述油红O染色法，其具体步骤为：首先，移除细胞培养基，用PBS洗两次，加油红O染色固定液25min；再弃去固定液，用蒸馏水洗2次；然后，加入60％异丙醇浸洗5min，再弃去60％异丙醇后加入新配制好的油红O染色液浸洗15min，再弃去染色液，水洗4次，直到无多余染液；最后，加入Mayer苏木素染色液，复染细胞核2min，再弃去染液后水洗4次；再入油红O缓冲液1min，弃去，并加入蒸馏水覆盖细胞并在倒置显微镜下观察。

优选地，所述免疫荧光染色法，其具体步骤为：首先，取待染色的细胞，移弃培养基，并用500μL的DPBS+0.3％PVP缓冲液漂洗一遍；加入4℃预冷的4％ PFA固定液500μL，固定15min后吸弃固定液；随后，加入500μL DPBS+0.3％PVP缓冲液漂洗细胞三遍，每次5min；再加入500μL 0.5％ Triton通透液，室温保持30min；再加入500μL DPBS+0.3％PVP缓冲液漂洗细胞三遍，每次5min；然后，加入500μL 2％BSA，室温封闭2h；除去封闭液，用2％ BSA稀释一抗，将稀释后的一抗加入细胞培养皿中，孵育后吸走抗体再重新加入，4℃孵育12～14h；最后，吸净一抗，加入500μL DPBS缓冲液漂洗3×15min；加入200μL二抗工作液，室温孵育1h；除去二抗，细胞用DPBS缓冲液漂洗3×15min，加入200μL DAPI工作液，室温避光孵育10min，并在倒置荧光显微镜下观察并拍摄试验结果

本发明的有益效果在于：

本发明一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，以含有胶原酶P和Collagenase/Dispase两类商品化酶制剂进行第一次酶消化，并在其后物理分离获得睾丸间质细胞；然后以含有胰蛋白酶和DNase I两类商品化酶制剂进行第二次酶消化，并在消化后进行物理分离获得睾丸支持细胞。本发明工艺简单高效，能够对猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞实现同步分离，分离获得的细胞在后续培养中表现较为均匀稳定。而且，通常的间质细胞分离培养过程中，会残留较多的各级生精细胞，因此通常采用Tris-HCl溶液低渗处理法去除残留的生精细胞，而本发明方法进行睾丸间质细胞分离时，不需要Tris-HCl溶液低渗处理就可以获得较纯的间质细胞类群。本发明是一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，操作简单方便，分离出来的猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞均一度较高，后续培养稳定性好，分离效率高；同时在细胞污染、分离纯化和鉴定、细胞质数量及量、分离法成本等方面均能够得到有效控制，有利于产业化推广应用。

附图说明

图1：实施例1中本发明方法的工艺流程图；

图2：实施例2中的常规方法(对照组)的工艺流程图；

图3：实施例2中常规方法(对照组)与实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞、睾丸间质细胞的显微镜下形态学观察对比图；

图4：实施例2中常规方法(对照组)与实施例1中本发明方法处理的精原细胞残留对比图；

图5：实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸间质细胞传代后的形态学观察图；

图6：实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞原代培养中的形态学观察图；

图7：实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸原代间质细胞和支持细胞的油红O染色鉴定结果图；

图8：实施例1中本发明方法分离出的原代培养阶段的猪睾丸支持细胞、间质细胞的HE染色鉴定结果图；

图9：实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞的特异性标记物免疫荧光染色鉴定结果图；

图10：实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸间质细胞的特异性标记物免疫荧光染色鉴定结果图。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

一、实施例1：

如图1所示，一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，包括以下步骤：

S1、猪睾丸的消毒：

A、将取自农场的未成熟猪的睾丸置于50mL离心管中，并用30mL碘伏颠倒震荡清洗每个睾丸；再用30mL 75％的乙醇清洗睾丸，摇动1-2min；最后用含2％P/S青链霉素的PBS溶液清洗睾丸，摇动1-2min；

B、重复上述步骤三次；

S2、睾丸组织分离：

用大镊子将消毒后的睾丸固定在细胞培养皿中，并手术剔除附和精囊，再重复S1中A步骤一次进行清洗消毒；然后用小镊子将睾丸固定在100mm培养皿内，在白膜上水平切开，用两个小镊子剥除白膜，再用含2％双抗的PBS润湿睾丸组织；将每份0.2～0.5g的睾丸组织置于1个60mm的培养皿中，并加入共计1mL的组织消化液a，用眼科剪尽量充分的将睾丸组织成匀浆状；

S3、第一次酶消化：

在S2步骤的60mm的每个培养皿里，继续分别加入4mL组织消化液a，利用巴氏吸管将组织匀浆与组织消化液a充分混匀，并转移至15mL离心管中；在34℃，210g离心条件下进行第一次消化，计时45min；将离心后的上层清液转移至离心管一中，对上层清液、下层组织分别进行下一步处理；

S4、第一次物理分离：

A、首先，用100目和200目不锈钢筛依次对S3步骤中离心管一的上层清液中的细胞进行过滤；其次，用含10％ FBS的DMEM/F-12溶液，收集100目和200目筛网上的细胞于15mL离心管中，并用DMEM/F-12溶液离心漂洗3次；然后，在34℃，210g离心条件下离心15min，收集到的细胞群中即包含有睾丸间质细胞；最后，利用含10％FBS的DMEM/F-12溶液重悬上述含有睾丸间质细胞的细胞群，并接入培养皿中，做好标记后进行培养；

B、首先，将40目、100目、200、400目不锈钢筛子依次摆放，并对步骤S3中的下层组织进行依次过筛；其次，用含10％ FBS的DMEM/F-12溶液进行反向冲洗，收集200目和400目筛网上截留的细胞和组织至60mm培养皿中，最后，收集至15mL离心管二中离心去除上层清液；

S5、第二次酶消化：

向S4中B步骤的去除上层清液的每个离心管二中加入组织消化液b，并在34℃，300g条件下边离心边消化，时长1h；再去除离心后的上层清液，在细胞沉淀中立即加入含有FBS的DMEM培养基，重悬细胞终止消化；

S6、第二次物理分离：

对S5步骤中重悬后悬起的细胞进行收集，并过500目筛，用含10％FBS的DMEM/F-12溶液反向冲洗，收集到的500目筛网上截留的细胞群即含有睾丸支持细胞；然后用培养基漂洗细胞3次，用含10％ FBS的DMEM/F-12溶液重悬上述含睾丸支持细胞的细胞群，并接入培养皿中，做好标记后进行培养；

S7、细胞鉴定：

对S4的A步骤中置于培养皿培养的含睾丸间质细胞的细胞群、以及对S6步骤中置于培养皿培养的含睾丸支持细胞的细胞群分别均进行形态及结构鉴定，从而实现猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法的整个过程。

其中，组织消化液a的配比为：P型胶原酶6mg、Dispase胶原酶5.5mg、HBSS+酚红5mL、PBS缓冲液5mL。组织消化液b的配比为：0.25％Trypsin，(5mL)和DNase I，5.00mg(1.1mg/mL)；DMEM，9mL(90％)；FBS，1mL(10％)。

其中，10％ FBS的DMEM/F-12溶液，即为含10％ FBS的DMEM/F-12培养基，其中按体积百分比计，DMEM/F-12培养基占90％，FBS占10％。DMEM/F-12培养基为1:1的液体培养基＝。

其中，步骤S7中的细胞形态及结构鉴定的方法包括显微镜观察鉴定法、HE染色法、油红O染色法、以及免疫荧光染色法。

二、实施例2：

为常规方法对照组。

一种常规的猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，如图2所示，其分离方法可简要描述为：将睾丸组织正常剪碎，经IV型胶原酶充分消化后置于离心管中进行离心，支持细胞因比重较大沉于管底。因此需经PBS轻微震荡反复漂洗悬起上层细胞，将上层细胞悬液收集于新的离心管中用于分离间质细胞，而经反复漂洗后的下层沉淀为支持细胞。下层再经0.25％胰蛋白酶充分消化后，进行唯一一次过筛(400目)，在滤过液中离心收集细胞为睾丸支持细胞。

三、实施例1与实施例2不同方法分离的猪睾丸支持细胞、睾丸间质细胞的显微镜下形态学观察

以2日龄安庆六白猪睾丸组织为原材料，并分别利用实施例2中常规方法(对照组)、实施例1中本发明方法分离出猪睾丸支持细胞、睾丸间质细胞。

图3为实施例2中常规方法(对照组)与实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞、睾丸间质细胞的显微镜下形态学观察对比图。其中，图3-A为实施例2中常规方法(对照组)分离出的睾丸间质细胞培养12h后的显微形态图(Scale bar＝50μm)；图3-B为实施例1中本发明方法分离出的睾丸间质细胞培养12h后的显微形态图(Scale bar＝100μm)；图3-C为实施例2中常规方法(对照组)分离出的猪睾丸支持细胞培养14h后的显微形态图(Scalebar＝50μm)；图3-D为实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞培养14h后的显微形态图(Scale bar＝100μm)。

如图3所示，结果表明经过12h的贴壁培养，实施例1中本发明方法分离的睾丸间质细胞多数刚完成贴壁，表现为圆形轮廓(见图3-B)，而实施例2中常规方法(对照组)中的睾丸间质细胞呈现出多种不同形态(见图3-A)。相类似的，经过14h的贴壁培养，实施例1中本发明方法分离获得的睾丸支持细胞同样表现为较为均一的集落样、成纤维样细胞群(见图3-D)，而实施例2中常规方法(对照组)分离获得的睾丸支持细胞类群则更为混杂(见图3-C)。这表明利用本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞、睾丸间质细胞群体均一度更高。四、实施例1与实施例2不同方法分离的原代睾丸间质细胞中的精原细胞残留对比。

在原代间质细胞的分离过程中，精原细胞的残留非常常见，因此需要利用Tris-HCl缓冲液的短时浸泡处理，灭活和去除培养物中残留的精原细胞。对此，我们将实施例1中本发明方法、实施例2中常规方法(对照组)分离获得的细胞分别经体外培养，当细胞达到接近连续单层时，在显微镜下进行观察并拍照。

图4为实施例2中常规方法(对照组)与实施例1中本发明方法处理的精原细胞残留对比图(Scale bar＝100μm)。如图所示，结果表明，实施例2中常规方法(对照组)分离的原代猪睾丸间质细胞生长至接近连续单层时呈现成纤维样的形态和排列方式，细胞表面夹杂有贴壁不充分的细胞考虑为残留的精原细胞(见图4-A)；在经过Tris-HCl浸泡处理7min后，可以清除疑似为精原细胞的细胞污染，获得较为均一的细胞类群(见图4-B)。相应的，对利用实施例1中本发明方法获取的细胞进行培养后，镜下观察可见细胞类群较为均匀统一，无明显的精原细胞残留(见图4.C)。因此不需要经过Tris-HCl浸泡处理。

上述结果表明，所建立的实施例1中本发明方法在分离获得猪睾丸间质细胞上可能更具有优势。

五、实施例1中本发明方法分离的猪睾丸间质细胞传代后的形态学观察。

为进一步鉴定实施例1中本发明方法分离所获得细胞类型，需将原代分离的细胞进行进一步的扩增培养。在扩增培养过程中，利用相差显微镜下逐日观察间质细胞在生长中的形态学变化。

图5为实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸间质细胞传代后的形态学观察图(Scale bar＝200μm)。如图5所示，结果表明，与原代细胞分离时相类似的，在接种12h时，细胞呈现为刚贴壁的状态，轮廓圆形(见图5-A)。在接种后24h后，细胞呈现为长纤维样并完成较为牢固的贴壁(见图5-B)。传代后细胞生长较为旺盛，在培养时间达到2天时(见图5-C)和3天时(见图5-D)，细胞轮廓清晰，立体感较强质在，胞质在细胞核附近较为突出。在培养3天后接近连续单层时可见，细胞具有较高的均一性(见图5-D)。

六、实施例1中本发明方法分离的猪睾丸支持细胞原代培养中的形态学观察。

因实施例2中常规方法(对照组)与实施例1中本发明方法获得的睾丸支持细胞在形态上没有差异，且生长过程中均呈现较为一致的变化过程，因此主要对实施例1中本发明方法分离获得的细胞进行了观察。

利用相差显微镜逐日观察细胞形态生长的变化，并拍照记录。图6为实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞原代培养中的形态学观察图，其中A：Scale bar＝100μm，B：200μm，C：50μm，D：200μm。如图6所示，结果表明：猪睾丸支持细胞在贴壁14h时以集落状贴于皿底，细胞间界限不清，也不易观察到细胞核结构，但胞质内包含大量的高折光性液泡，推测其为支持细胞内的典型脂滴结构。经2天的体外培养，集落状生长的细胞胞质逐渐向外伸展，细胞间间隙变得清晰，也较易观察到细胞核结构。经3天体外培养后，细胞逐渐分离扩散生长，脂滴结构变少，折光性变弱。

七、实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸间质细胞、支持细胞的油红O染色鉴定。

为进一步鉴定实施例1中本发明方法分离所获得细胞，我们对原代间质细胞和支持细胞进行了油红O染色。

油红O染色法，其具体步骤为：首先，移除细胞培养基，用PBS洗两次，加油红O染色固定液25min；再弃去固定液，用蒸馏水洗2次；然后，加入60％异丙醇浸洗5min，再弃去60％异丙醇后加入新配制好的油红O染色液浸洗15min，再弃去染色液，水洗4次，直到无多余染液；最后，加入Mayer苏木素染色液，复染细胞核2min，再弃去染液后水洗4次；再入油红O缓冲液1min，弃去，并加入蒸馏水覆盖细胞并在倒置显微镜下观察。

图7为实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸原代间质细胞和支持细胞的油红O染色鉴定结果图(Scale bar＝50μm)。如图7所示，结果表明：猪睾丸原代间质细胞胞质中较为均匀的分布着细密微小脂滴颗粒(见图7-A、图7-B)，而支持细胞则在细胞核附近或细胞质两极中有脂滴出现(见图7-C、图7-D)。相比之下，猪睾丸原代间质细胞中的脂滴更小而密(见图7-A、图7-B)；而支持细胞中的脂滴则相对较大而分散，并存在较的脂滴其直径可接近细胞核小(见图7-C、图7-D)。此外，在相差显微镜下观察到的脂滴呈现更为明亮橘红色(见图7-A、图7-C)；而在非相差显微镜下，脂滴的颜色呈现为深红色至青蓝色(见图7-B、图7-D)。

八、实施例1中本发明方法分离出的原代培养阶段的猪睾丸支持细胞、间质细胞的HE染色鉴定。

为进一步鉴定实施例1中本发明方法分离出分离所获得细胞类型，我们对其原代培养阶段的猪睾丸支持细胞、间质细胞进行了HE染色。

HE染色法，其具体步骤为：首先，取待染色的细胞，充分移弃培养基用1000μL的PBS缓冲液漂洗；再使用95％，85％，75％乙醇各处理一次，每次2min；其次，用蒸馏水浸泡2min，苏木素染液染色15min，再蒸馏水洗去浮色；然后，用分化液分化3min；自来水冲洗2次，每次2min；最后，置伊红染液1min，蒸馏水稍洗3s，快脱水。

图8为实施例1中本发明方法分离出的原代培养阶段的猪睾丸支持细胞、间质细胞的HE染色鉴定结果图(Scale bar＝50μm)。如图8所示，结果表明：猪睾丸原代支持细胞胞质扩展贴于皿底，呈现为多角形态，细胞核内具有多个明显的核仁(见图8-A)。而原代间质细胞则更多表现为圆形形态，且细胞核内未见明显的多核仁现象(见图8-B)。

九、实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞、间质细胞的特异性标记物免疫荧光染色鉴定。

为进一步鉴定分离所获得细胞，对预期猪睾丸支持细胞、间质细胞进行了免疫荧光染色。

免疫荧光染色法，其具体步骤为：首先，取待染色的细胞，充分移弃培养基，并用500μL的DPBS+0.3％PVP缓冲液漂洗一遍；再加入4℃预冷的4％ PFA固定液500μL，固定15min后吸弃固定液；其次，加入500μL DPBS+0.3％PVP缓冲液漂洗细胞三遍，每次5min；再加入500μL 0.5％ Triton通透液，室温保持30min；再加入500μLDPBS+0.3％PVP缓冲液漂洗细胞三遍，每次5min；然后，加入500μL 2％BSA，室温封闭2h；除去封闭液，用2％ BSA稀释一抗，将稀释后的一抗加入细胞培养皿中，孵育后吸走抗体再重新加入，4℃孵育12～14h；最后，吸净一抗，加入500μL DPBS缓冲液漂洗3×

15min；加入200μL二抗工作液，室温孵育1h；除去二抗，细胞用DPBS缓冲液漂洗3×15min，加入200μL DAPI工作液，室温避光孵育10min，并在倒置荧光显微镜下观察并拍摄试验结果。

图9为实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸支持细胞的特异性标记物免疫荧光染色鉴定结果图(Scale bar＝250μm)。

参考以往研究，猪睾丸支持细胞SCs表达AMH，ABP，FASL等特异性功能蛋白。我们对分离后第一次传代(p1)的SCs进行了培养并用于上述蛋白的检测。抗苗勒管激素(AMH)是一种由未成熟支持细胞产生的糖蛋白，能够诱导苗勒管退化，使中肾管在雄激素的作用下向男性生殖道发育。作为标记物AMH属于分泌蛋白标记物也是在人类上未成熟睾丸功能的标志物。AMH在支持细胞中表达定位在细胞外。雄激素结合蛋白(ABP)是由支持细胞产生的糖蛋白(β-球蛋白)。ABP与睾酮、双氢睾酮和17β-雌二醇特异性结合。ABP在小管内保持较高水平的睾酮浓度，并通过负反馈调节FSH分泌。与AMH一样，ABP主要在细胞外表达，但也存在于细胞质膜中。ABP在器官水平上在睾丸支持细胞和大脑中高度表达。FASL高表达定位于细胞膜、细胞膜和细胞核上。通过常规的固定和抗体孵育染色后，可见AMH，ABP，FASL，SCs免疫荧光染色结果表明分离获得细胞符合SCs细胞特异性标记物的表达。

图10为实施例1中本发明方法分离出的猪睾丸间质细胞的特异性标记物免疫荧光染色鉴定结果图(Scale bar＝250μm)。

由以往研究可知，猪睾丸间质细胞LCs表面阳性表达HSD3B1，IGF1，INSL3等表面特异性抗原。我们使用HSD3B1，IGF1，INSL3等一抗在体外培养条件下的LCs细胞进行免疫荧光染色。HSDB3B1是一-种在细胞内质网、线粒体和细胞核中高表达的蛋白质标记物。HSDB3B1在胎儿和成年小鼠LCs中均表达。IGF1是一种在细胞质膜和细胞外高表达的激素标记物，INSL3也是一种激素标记物。INSL3主要在细胞外高表达，在细胞核中轻微表达。试验过程中我们对每种一抗单染，结果如图10所示。LCs免疫荧光染色结果表明分离获得细胞符合LCs细胞特异性标记物的表达。

综上所述，通过对分离获得的支持细胞和间质细胞的形态特征和标记物表达进行了鉴定。结果与之前的研究报道相类似，支持细胞在形态上呈多角细胞，细胞核内含有数量较多的核仁。与先前报道的支持和间质细胞分离相比，HE染色结果显示出更好的细胞形态和结构，表明所分离的细胞具有良好的细胞活力。此外，本发明方法分离获得的支持细胞内存在较为丰富的脂滴结构，且脂滴直径可接近细胞核大小。此外，在相差显微镜下观察到的脂滴呈现更为明亮橘红色；而在非相差显微镜下，脂滴的颜色呈现为深红至青蓝。而在间质细胞中观察到的细密脂滴结构，也与之前报道相符合。

同时，为进一步鉴定分离获得的细胞身份，对AMH、ABP、FASL等蛋白标记物进行了检测。其中，AMH属于分泌蛋白，是未成熟睾丸支持细胞的标记物，在细胞内的含量相对较低。ABP是由支持细胞产生的糖蛋白(β-球蛋白)，可与睾酮、双氢睾酮和17β-雌二醇特异性结合。ABP在曲精小管内可以帮助支持细胞保持较高水平的睾酮浓度，并通过负反馈调节FSH分泌。ABP同样属于分泌蛋白，但在细胞膜中也有较高的含量，ABP因在睾丸组织和大脑中表达量较高，同时可以作为睾丸和脑的标记物。此外，支持细胞的ABP和AMH证明了支持细胞的未成熟状态。在睾丸发育过程中，睾丸组织内的免疫豁免特征对精子发生过程至关重要，其中FASL在支持细胞免疫豁免功能的维持中起关键作用。本研究所分离的支持细胞中FASL表达量较高，也进一步证明了所获得的细胞属于支持细胞。

而且，由于目前关于猪未成熟间质细胞建立体外培养的报道相对较少，本发明中选择了其他物种未成熟间质细胞的标记，对所获得猪基因表达进行研判，包括HSD3B1、IGF1、INSL3。其中，HSD3B1在胎儿和成年小鼠LCs中均有表达能够调控小鼠睾丸间质细胞脂代谢和促进酮合成。HSD3B1蛋白主要分布于细胞内质网、线粒体和细胞核中，与本发明的检测结果吻合。IGF1作为睾丸间质细胞活性的可能调控因子，同样可以作为睾丸间质细胞的标记物。此外，作为一种分泌型蛋白，INSL3在表达后主要分泌到细胞外，此外在细胞核内也有一定的集中分布，INSL3在睾丸下降过程中起到至关重要的作用。上述标记物共同表明，本发明方法所获得的细胞具有睾丸间质细胞的典型特征。

本发明是一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，以含有胶原酶P和Collagenase/Dispase两类商品化酶制剂进行第一次酶消化，并在其后物理分离获得睾丸间质细胞；然后以含有胰蛋白酶和DNase I两类商品化酶制剂进行第二次酶消化，并在消化后进行物理分离获得睾丸支持细胞。本发明工艺简单高效，能够对猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞实现同步分离，分离获得的细胞在后续培养中表现较为均匀稳定，而且无需任何纯化措施。而且，通常的间质细胞分离养过程中，会残留较多的各级生精细胞因此通常采用Tris-HCl溶液低渗处理法去除残留的生精细胞，而本发明方法进行睾丸间质细胞分离时，不需要Tris-HCl溶液低渗处理就可以获得较均一的间质细胞类群。

本发明是一种猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞的同步分离方法，操作简单方便，分离出来的猪睾丸支持细胞和睾丸间质细胞均一度较高，后续培养稳定性好，分离效率高；同时在细胞污染、分离纯化和鉴定、细胞质数量及量、分离法成本等方面均能够得到有效控制，有利于产业化推广应用。

上述是对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非实质改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。