一种具有促成骨和免疫调控性能的钛表面改性方法

摘要

本发明针对骨科钛植入体领域应用的需求，公开了一种兼具促成骨和免疫调控性能的钛表面改性方法。所述方法为利用磁控溅射技术在钛表面制备一层三氧化二铋薄膜。经本发明改性得到的钛植入体具有良好的生物相容性。此外，由于铋的释放，有利于骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨基因表达和巨噬细胞(RAW264.7)向抗炎的M2型极化。本发明可被广泛应用于骨科钛植入体的表面改性。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用金属材料表面改性技术领域。涉及一种具有促成骨和免疫调控性能的钛表面改性方法。

背景技术

骨植入体远期无菌性松动是导致术后失败的最主要原因之一。瑞典髋关节登记系统数据显示，初次全髋关节置换术后需要进行返修的患者中约有54.3％是由无菌性松动引起的。若发生无菌性松动，患者需要接受翻修手术，而手术难度大、创伤多、费用高、术后并发症多，且会增加再次翻修的风险，造成恶性循环。目前，临床上使用的骨科植入体主要是具有良好力学性能和生物相容性的钛基金属材料。因此，设计并研发具有良好骨整合性的钛基骨植入，可以降低植入远期发生无菌性松动的风险，从而提高患者的生存质量和治疗满意度，具有重大的临床意义和社会意义。

为解决上述问题，本发明提出在钛基植入体表面构建三氧化二铋涂层，以提高钛基植入体的成骨能力和骨免疫调控能力。

发明内容

本发明为解决现有的医用钛植入体的骨整合性差问题，提供了一种新型的涂层制备方法，以满足临床对降低骨植入体无菌性松动风险的需求。

一种具有促成骨和免疫调控性能的钛表面改性方法，包括以下步骤：以三氧化二铋为靶材，利用磁控溅射技术，用氩气轰击靶材，并通过磁场将三氧化二铋沉积到钛植入体表面。

较佳地，在进行磁控溅射前包括酸处理的前过程，采用稀释的氢氟酸和硝酸混合液清洗钛表面，以除去表面氧化膜和其它杂质。

较佳地，所述磁控溅射过程中，三氧化二铋作为靶材，腔体压力为1-10mTorr，氩气的流速为10-50sccm，电压为10-50V，磁控溅射时间为10-60min。

一种植入体材料，包括钛植入体以及通过上述方法构建的三氧化二铋涂层。

经本发明处理得到的钛植入体表面为三氧化二铋涂层。涂层具有良好的细胞相容性，而且由于铋离子的释放，改性后的材料表面更有利于骨髓干细胞的成骨分化，以及巨噬细胞的M2型极化。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

首先，本发明所涉及的涂层是由磁控溅射一步法完成的，其工艺简单，有利于大规模生产，而且涂层制备只需三氧化二铋靶材，无需额外试剂，不会对环境造成危害。其次，经本发明改性后的钛植入体不会影响其力学性能，而且能够保持良好的细胞相容性。最后，经本发明改性后的钛植入体具有更好的骨诱导效果，而且能够抑制巨噬细胞的M1型极化、促进M2型极化，从而营造一个有利于骨修复的免疫微环境。

附图说明

图1是Ti、Ti-B1、Ti-B2和Ti-B3样品的扫描电镜图；

图2是Ti、Ti-B1、Ti-B2和Ti-B3样品X射线能谱图(EDS)；

图3是Ti、Ti-B1、Ti-B2和Ti-B3样品X射线衍射图谱(XRD)；

图4是骨髓间充质干细胞在Ti、Ti-B1、Ti-B2和Ti-B3样品表面培养3天的死活染色图；

图5是骨髓间充质干细胞在Ti和Ti-B3样品表面培养7天(a)和14天(b)后的成骨相关基因表达情况；RAW264.7在Ti和Ti-B3样品表面培养3天后的促炎M1型基因(c)和抗炎M2型基因(d)的表达情况。

具体实施方式

实施例1

将厚度为1mm，边长为10mm的钛片，用氢氟酸和硝酸的混合酸液清洗干净，超纯水中超声清洗，然后晾干，之后利用三氧化二铋为靶材，进行磁控溅射处理。磁控溅射前，先将腔体压力降为8mTorr；磁控溅射时，氩气流量为20sccm，电压为20V，磁控溅射时间为30min。所得样品标记为Ti-B1。

图1中有经本实施例改性处理得到的钛植入体表面形貌的扫描电镜图。从图中可以看出，Ti-B1样品表面形貌与未改性的钛一致。图2给出了经本实施例处理后样品的EDS图谱。从图中可以看出，Ti-B1样品表面的EDS能谱中有明显的Bi元素和O元素峰。图3给出了经本实施例处理后样品的XRD图谱。从图中可以看出Ti-B1的图谱在27.8°左右出现代表三氧化二铋的特征峰。

实施例2

将厚度为1mm，边长为10mm的钛片，用氢氟酸和硝酸的混合酸液清洗干净，超纯水中超声清洗，然后晾干，之后利用三氧化二铋为靶材，进行磁控溅射处理。磁控溅射前，先将腔体压力降为8mTorr；磁控溅射时，氩气流量为20sccm，电压为25V，磁控溅射时间为30min。所得样品标记为Ti-B2。

图1中有经本实施例改性处理得到的钛植入体表面形貌的扫描电镜图。从图中可以看出，Ti-B2样品表面形貌与未改性的钛一致。图2给出了经本实施例处理后样品的EDS图谱。从图中可以看出，Ti-B2样品表面的EDS能谱中有明显的Bi元素和O元素峰。图3给出了经本实施例处理后样品的XRD图谱。从图中可以看出Ti-B2的图谱在27.8°左右出现代表三氧化二铋的特征峰。

实施例3

将厚度为1mm，边长为10mm的钛片，用氢氟酸和硝酸的混合酸液清洗干净，超纯水中超声清洗，然后晾干，之后利用三氧化二铋为靶材，进行磁控溅射处理。磁控溅射前，先将腔体压力降为8mTorr；磁控溅射时，氩气流量为20sccm，电压为25V，磁控溅射时间为30min。所得样品标记为Ti-B3。

图1中有经本实施例改性处理得到的钛植入体表面形貌的扫描电镜图。从图中可以看出，Ti-B3样品表面形貌与未改性的钛一致。图2给出了经本实施例处理后样品的EDS图谱。从图中可以看出，Ti-B2样品表面的EDS能谱中有明显的Bi元素和O元素峰。图3给出了经本实施例处理后样品的XRD图谱。从图中可以看出Ti-B3的图谱在27.8°左右出现代表三氧化二铋的特征峰。

实施例4

采用BMSCs细胞体外培养和荧光染色实验评估Ti、Ti-B1、Ti-B2和Ti-B3样品对细胞活性的影响。具体方法如下：

1)将经过环氧乙烷灭菌的样品放入24孔培养板中，每孔滴加1mL密度为5×10

2)将细胞培养板放入5％ CO

3)培养3天后，用钙黄绿素和碘化丙锭分别对活细胞和死细胞进行染色，并用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察样品表面细胞的死活情况。

图4是细胞在Ti、Ti-B1、Ti-B2和Ti-B3样品表面培养3天后的死活染色情况。从图中可以看出，所有样品表面均被大量的活细胞覆盖，且样品之间无明显差别。上述结果说明经过三氧化二铋改性处理后的样品具有与纯钛一样好的细胞相容性。

实施例5

采用BMSCs细胞体外培养和实时定量多聚链式反应(qRT-PCR)评估Ti和Ti-B3样品对干细胞成骨分化的影响。具体方法如下：

1)细胞培养：将经过环氧乙烷灭菌的样品放入24孔培养板中，每孔滴加1mL密度为1×10

2)RNA提取：培养7和14天后，吸弃培养基，用Trizol裂解细胞，用Nanodrop分光光度计检测RNA纯度。

2)逆转录：使用cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录反应，所得cDNA保存于-20℃。

3)实时荧光定量检测：然后将cDNA与SYBR Green Mastermix和引物混合，用2

图5a和b分别是Ti和Ti-B3样品表面培养干细胞7和14天后的成骨相关基因表达。从图中可以看出，培养7天，相比于Ti样品组，Ti-B3样品组的OPN基因表达明显升高，OCN基因表达持平，而RUNX-2基因表达略有下降。但是继续培养至14天，Ti-B3样品组的OPN和OCN基因表达明显高于Ti组，而RUNX2基因的表达无显著性差异。

实施例6

采用RAW264.7细胞体外培养和qRT-PCR评估Ti和Ti-B3样品对免疫细胞的影响。具体方法如下：

1)细胞培养：将经过环氧乙烷灭菌的样品放入24孔培养板中，每孔滴加1mL密度为1×10

2)RNA提取：培养3天后，吸弃培养基，用Trizol裂解细胞，用Nanodrop分光光度计检测RNA纯度。

2)逆转录：使用cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录反应，所得cDNA保存于-20℃。

3)实时荧光定量检测：然后将cDNA与SYBR Green Mastermix和引物混合，用2

图5c和d分别是Ti和Ti-B3样品表面培养巨噬细胞3天后的M1型和M2型相关基因表达。从图中可以看出，相比于Ti样品组，Ti-B3样品组M1型基因(iNOS和IL-1)表达下降，而M2型基因(IL-10和CCL22)上升。

综合上述实施例4-6的结果可以看出，经过三氧化二铋改性的钛表面具有良好的细胞相容性，干细胞在材料表面更容易向成骨方向分化，而巨噬细胞在材料表面的M1型极化受到抑制，M2型极化有所增强。本发明在钛表面制备的三氧化二铋涂层有望在骨科医用金属材料表面改性领域得到应用。