拟南芥长链非编码RNA-DANA1及其在植物干旱耐受性的应用

摘要

本发明公开了一种拟南芥长链非编码RNA‑DANA1及其在植物干旱耐受性的应用，涉及植物的基因工程领域。其中，所述的DANA1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过克隆拟南芥长链非编码RNA‑DANA1的全长转录本，并构建过表达载体获得DANA1过表达转基因植株，过表达DANA1后植物表现出失水速率减慢，对干旱胁迫比野生型更具耐受性。这表明过表达拟南芥长链非编码RNA‑DANA1可以提高植物的干旱耐受性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术、基因工程手段和遗传学领域，具体涉及确定一种拟南芥长链非编码RNA-DANA1及其在植物干旱耐受性应用。

背景技术

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200nt，不编码蛋白质的一类RNA。近几年来，在植物lncRNA方面的研究表明，lncRNA在植物应对非生物胁迫中占据了重要的位置。比如，拟南芥lncRNA IPS1能与miR399一同调控植物在低磷环境下的生长发育；马铃薯StCDF1与其位点产生的反义lncRNA StFLORE通过影响气孔生长和昼夜开放来调节水分流失，随之调节植物对干旱的响应；水稻lncRNA TCONS_00021861可以通过miR528-3p来调节YUCCA7的表达，从而激活吲哚乙酸的生物合成途径并赋予植物抗旱应激能力；拟南芥SVALKA突变会影响CBF1基因的表达和植物的冷害抗性；拟南芥lncRNA DRIR能够被干旱和盐胁迫诱导表达，使拟南芥对ABA的敏感性增强，过表达DRIR能够提高植物的耐旱性。因此我们深入挖掘拟南芥应对干旱胁迫相关的长链非编码RNA，并研究其在植物干旱耐受性的作用，从而为今后植物lncRNAs的调控机制研究奠定基础。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一个与拟南芥干旱耐受性相关的长链非编码RNA-DANA1，探索其在调控植物干旱耐受性中的作用机制，进而提供该长链非编码RNA调节在改善植物抗逆性上的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种拟南芥干旱耐受性相关的长链非编码RNA，其为RNA-DANA1，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供含有上述拟南芥长链非编码RNA的植物过表达载体。

进一步，本发明还提供包含上述植物表达载体的重组菌。

本发明的第三方面，提供上述拟南芥长链非编码RNA、植物表达载体或重组菌在提高植物干旱耐受性的应用。

本发明的第四方面，提供一种提高植物干旱耐受性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述的基因表达。所述的植物为拟南芥。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次得到一个与植物干旱耐受性相关的长链非编码RNA-DANA1。对DANA1的研究表明，该基因主要在细胞核表达，过表达DANA1能够提高植物对干旱的耐受性。

附图说明

图1为PCR扩增lncRNA-DANA1的琼脂糖凝胶电泳图，其中lncRNA-DANA1的长度为786bp；

图2为过表达载体载体pCAMBIA1300-DANA1的菌落PCR结果，所用DNA marker为

图3为实时荧光定量PCR扩增DANA1基因表达量的柱状图，其中：Col-0：野生型；OE9：过量表达株系9；OE15：过量表达株系15；

图4为转基因拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗的叶片失水率变化情况结果，其中：Col-0：野生型；OE9：过量表达株系9；OE15：过量表达株系15；

图5为转基因拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗在干旱处理后的存活情况；其中，横坐标表示不同的材料，纵坐标表示存活率；Col-0：野生型；OE9：过量表达株系9；OE15：过量表达株系15。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，lncRNA与植物应对多种非生物胁迫过程密切相关。本发明的目的是提供一个提高拟南芥干旱耐受性的长链非编码RNA-DANA1。

本发明运用高通量测序技术(RNA-Seq)，从中筛选到一个与拟南芥耐旱性相关的长链非编码RNA-DANA1，其序列长度为786bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，属于lincRNA。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该核苷酸具有90％以上一致性，且具有相同的功能，则均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

本发明还克隆了lncRNA-DANA1转录本序列，通过EcoR I和BamH I的酶切位点将lncRNA-DANA1连接入表达载体pCAMBIA1300，再经测序鉴定。使用农杆菌GV3101介导转化法浸染拟南芥植株，通过潮霉素筛选，获得稳定遗传的过表达DANA1的转基因植株。结果证实，过表达lncRNA-DANA1后减缓植物叶片的失水速率，提高拟南芥的耐旱性。

综上所述，运用植物过表达载体，使植物耐旱相关的长链非编码RNA-DANA1表达量增加，可以提高植物的耐旱性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：lncRNA-DANA1的克隆

1.材料与试剂

1.1材料

本实验使用的野生型拟南芥是哥伦比亚生态型(Colobia-0，Col-0)

1.2试剂

购于PhytoTech品牌：M524；

购于Takara品牌：PrimeSTAR Max DNA Polymerase(2x)；

购于国药品牌：氯仿，无水乙醇，异丙醇；

购于Ambion品牌：DEPC-Treated Water、TRIzol Reagent；

购于BBI品牌：Sodium chloride、MES monohydrate，琼脂粉；

购于Transgen品牌的试剂盒：TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix，pEASY-Blunt Zero Cloning Kit；

购于Omega品牌的试剂盒：Gel Extraction Kit；

购于CWBIO品牌：2x Es Master Mix(Dye)；

购于OXOID品牌：TRYPTONE、YEAST EXTRACT；

2.实验方法

2.1 lncRNA的转录组测序

采用Trizol法提取2周龄的野生型拟南芥总RNA。链特异性RNA-seq文库的制备和深度测序在上海植物逆境生物学中心(中国上海)进行。这些文库是根据制造商的说明通过应用TruSeq Stranded mRNA(Illumina，San Diego，CA，USA)构建的。使用片段分析仪(Advanced Analytical，IA，USA)评估RNA-seq文库的质量，并将所得文库在IlluminaHiSeq 2500仪器上测序，产生100或125个核苷酸的对端读数。

2.2 lncRNA-DANA1的检测

2.2.1总RNA提取

以2周龄野生型拟南芥幼苗作为对象，总RNA提取参照TriZol使用说明书，具体操作如下：

(1)取约0.1g新鲜的植物材料于1.5mL的RNA-free离心管中，液氮速冻，破碎仪破碎后放于液氮中；

(2)加1mL的TriZol，震荡仪上震荡混匀，并静置7min；

(3)加100μL的氯仿替代物，震荡仪上震荡混匀，并静置7min；

(4)放入已提前预冷的4℃离心机，12000rpm离心15min；

(5)取400μL的上清，并加入等体积的异丙醇，震荡仪上震荡混匀，并静置7min；

(6)放入已提前预冷的4℃离心机，12000rpm离心15min；

(7)将上清倒掉，只留底部沉淀，加入DEPC水配制的RNA-free的75％酒精洗涤两次；

(8)倒掉75％酒精，并用4℃离心机瞬间离心一次，将残留的酒精用RNA-free枪头吸掉；

(9)打开离心管盖，放置2-3min后加20μL的DEPC水，置于冰上溶解。琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，用NanoPhotometer测定所提总RNA的OD260、OD280和OD230，记录RNA浓度，-80℃保存备用。

2.2.2引物设计和扩增

根据lncRNA-DANA1的核苷酸序列，通过Primer5.0软件设计PCR引物，使用高保真酶PrimeSTARMax DNAPolymerase(2x)扩增全长基因组，引物如下：

(1)DANA1-F：5’-GATTTTTTTTGAGATGTCAT-3’

(2)DANA1-R：5’-AAATCAGGAAAAAATAAAGA-3’

反应体系和反应程序如下：

step1：98℃3min

step2：98℃10sec

step3：55℃15sec(根据各引物退火温度更改)

step4：72℃30sec(根据扩增片段长度更改，1kb/30sec)

Repeat step 2-4 35 cycles

step5：72℃10min

step6：12℃保温

待PCR设定程序结束后，取样跑1％琼脂糖凝胶，然后用ChemiDoc

2.2.3反转录反应

以提取的总RNA(3μg)为模板，按照全式金TransScript One-Step cDNASynthesis SuperMix说明书加好反应体系，置于42℃30min，85℃5sec，获得cDNA备用。

2.2.4鉴定核苷酸序列

根据pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书，加入1μL回收产物和pEASY-BluntZero Cloning vector 1μL，轻轻混合，25℃反应5min，置于冰上1min后，直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，平板置于37℃过夜培养，挑取单克隆培养10-12h，进行菌液PCR检测，提取阳性单克隆的质粒，送至北京擎科生物公司测序鉴定，证实该lncRNA-DANA1真实存在。

实施例2：过表达lncRNA-DANA1

1.材料与试剂

1.1材料

拟南芥野生型Col-0

1.2试剂

购于PhytoTech品牌：M524；

购于BBI品牌：Sodium chloride、MES monohydrate，琼脂粉；

购于CWBIO品牌：2x Es Master Mix(Dye)；

购于OXOID品牌：TRYPTONE、YEAST EXTRACT；

购于诺唯赞品牌：ClonExpress II，质粒提取试剂盒；

购于GE Healthcare品牌：SILWET L-77。

2.实验方法

2.1lncRNA-DANA1过表达载体构建

将植物过表达载体pCAMBIA1300用EcoRI和BamHI线性化后，用ClonExpress II重组酶将测序正确的DANA1序列片段连接到该载体上，37℃反应50min，随后转化大肠杆菌，取适量菌液涂布相应抗性的LB平板，平板置于37℃过夜培养，挑取单克隆培养10-12h，进行菌液PCR检测(如图2)，提取阳性单克隆的质粒，送至北京擎科生物公司测序鉴定。质粒提取按照质粒提取试剂盒说明书进行。

2.2 lncRNA-DANA1过表达载体转化农杆菌

将上述提取的pCAMBIA1300-DANA1质粒转化至农杆菌GV3101，每50μL感受态加入1μL质粒，用手轻轻拨打管底混匀，依次按着液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min，随后加入800μL无抗性LB液体培养基，于28℃振荡培养3h步骤进行。取100μL菌液涂布在相应抗性的LB固体平板上，平板倒置于28℃培养48h后挑取单克隆进行PCR扩增鉴定。

2.3农杆菌侵染拟南芥

将拟南芥Col-0种子平铺在1/2MS固体培养基上表面，于设定了22℃的光照培养箱培养一周，光周期设定为16h光照/8h黑暗。一周后将拟南芥幼苗移植至含有蛭石的湿度适中的营养土中，置于培养室中，生长条件和光照培养箱中一致生长约三周后，植株开满花朵。取上述pCAMBIA1300-DANA1农杆菌在带有卡那霉素和利福平两种抗性的LB液体培养基中培养，待培养基由最开始的暗红色转变为橙黄色，高速离心富集农杆菌，而后用重悬液将菌体重悬。将拟南芥Col-0的花朵在重悬液中浸泡，保证花朵基本上有沾有重悬液。利用保鲜膜将侵染后的植株密封，暗培养24h。黑暗处理结束后放回原来的培养室中继续培养。

2.4阳性lncRNA DANA1-OE材料的鉴定

收取转化的种子，置于34℃烘3-4天后，铺在含有潮霉素抗性的1/2MS培养基上进行筛选，将能够健康生长的幼苗种植到土壤中去，此为转基因植株T1代。T1代单株收种，在含有潮霉素的1/2MS平板上对种子继续进行筛选，对出现3：1分离的材料挑取健康生长的幼苗进行种植，此为转基因植株T2代。T2代单株收种后再次在含有潮霉素的1/2MS平板上对种子进行筛选，将没有死亡的单株进行扩繁，获得T3代纯合转基因植株。

实施例3：lncRNA-DANA1 OE植株表型鉴定

1.材料与试剂

1.1材料

拟南芥转基因植株lncRNA-DANA1 OE

1.2试剂

ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购自诺唯赞。

2.实验方法

2.1.引物设计

根据lncRNA-DANA1的核苷酸序列，通过Primer5.0软件设计RT-qPCR引物，产物长度在190bp，使用UBQ3作为内参基因，引物序列如下：

2.2.Quantitative real time PCR

提取上述纯合的lncRNA-DANA1过表达转基因植株幼苗的RNA，并反转录成cDNA(方法同实验例1)，以cDNA为模板使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix在Bio RadCFX96定量PCR仪上进行实时定量PCR反应，检测DANA1的表达水平，以UBQ3为内参基因，验证基因过表达的有效性。在冰上配制如下反应体系：

荧光定量PCR以两步法，RT-qPCR反应条件为：94℃3min，94℃10sec，56℃30sec，第2，3步骤循环50次，最后进行熔解曲线分析，获得Ct值。拟南芥的UBQ3基因表达量作为标准内参，以2^-△△Ct衡量每个样品中的基因表达的相对水平，每个样品三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复。

2.3.实验结果

根据RT-qPCR结果，DANA1 OE幼苗的DANA1的表达量显著增加，表达倍数均上升200倍以上(P＜0.05，two-sample independent t-test)(如图3)。

对获得的成功过表达DANA1转基因植株进行表型分析。首先将土培3周大小的拟南芥幼苗进行叶片的失水速率检测，结果如图4所示，OE9和OE15的叶片失水速率显著低于Col-0，说明DANA1过表达后会降低植物叶片的蒸腾作用。根据土壤干旱抗性实验发现，土培3周大小的拟南芥幼苗进行大约2周左右的干旱处理后进行复水，野生型拟南芥基本全部死亡，而DANA1过表达植株全部存活(如图5)。表明该基因在拟南芥应对干旱胁迫发挥重要功能。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。