高特异性肠激酶酶切方法及乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途

摘要

本申请提供一种高特异性肠激酶酶切方法，所述酶切方法包括：在酶切促进剂的存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应，其中所述酶切促进剂选自乙醇、甘油、蔗糖、氯化钠中的一种或两种以上。本申请还提供乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途。本申请提供的肠激酶酶切方法，使得非特异性产物含量相比现有技术大幅降低，从而可以大幅提高产物纯度。同时，可以保持高酶切率，并保持肠激酶酶切特异性和酶切效率的平衡；操作简单、有效降低纯化成本。

说明书

技术领域

本申请属于生物医药领域，具体涉及一种高特异性肠激酶酶切方法及乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途。

背景技术

随着医学的发展，生物大分子，尤其是蛋白/多肽类药物由于其独特的作用机制，越来越受到药品研发企业的关注和青睐。然而，相比于小分子化药，生物药物对于生产工艺的要求更加苛刻。蛋白/多肽的生产或制备过程中，很多时候需要对蛋白质进行切割，以便获得具有活性的蛋白产物，目前通常的技术手段是利用不同蛋白酶对于酶切底物的序列特异性以切割蛋白质。肠激酶(Enterokinase,EK)是一种丝氨酸蛋白酶,由于其对Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(D4K)序列具有较强的特异性(Biochim.Biophys Acta 20(1956)443-434)，并且具有较宽的活性范围(在pH4.5-9.5、温度4℃-45℃之间保有活性)而在生物工程中得到广泛应用，如，Flag标签由于其具有肠激酶切割位点，已作为表达蛋白中重要的组成部分被广泛的应用于蛋白质的生产和纯化过程中。实际应用中通过多种方式提高酶切效果，CN101624588中记载了通过参照牛肠激酶轻链EKL与其抑制剂VD4K-氯甲的复合物的晶体结构(Code no：1EKB，Protein Dtabase Bank)选择具有可能增强EKL与DDDDK结合活性的重组肠激酶(rEK)变体。Oi WahLiew等人(Protein Expr.Purif.41(2005)332-340)描述了在肠激酶切割蛋白质过程，比D4K位点更有效的肽序列LKGDR。虽然现有技术方案与传统肠激酶酶切反应相比，在酶切活性、底物特异性等方面有所提高，但是面对蛋白/多肽生产及纯化过程中的实际需求，仍然存在肠激酶非特异性产物含量高、酶切活性与特异性不平衡、改进手段复杂等技术问题，因此，仍然需要酶切特异性更高、反应完全、工业顺应性好、操作简便且经济的肠激酶酶切工艺。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供一种高特异性肠激酶酶切方法及乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途。

具体来说，本申请涉及如下方面：

1.一种高特异性肠激酶酶切方法，其中，所述酶切方法包括：

在酶切促进剂的存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应，其中所述酶切促进剂选自乙醇、甘油、蔗糖、氯化钠中的一种或两种以上。

2.根据项1所述的酶切方法，其中，所述酶切促进剂为乙醇。

3.根据项2所述的酶切方法，其中，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为1％-50％，优选为5％-40％，进一步优选为10％-30％。

4.根据项1至3任一所述的酶切方法，其中，肠激酶、所述酶切促进剂、以及底物在缓冲液中进行酶切反应。

5.根据项4所述的酶切方法，其中，所述缓冲液的pH为7.1-10，优选为7.4-9.5，进一步优选为7.5-9.0。

6.根据项4所述的酶切方法，其中，所述缓冲液选自磷酸盐类缓冲液、Tris类缓冲液、有机酸类缓冲液、硼酸盐类缓冲液、氨基酸类缓冲液中的一种或两种以上，

优选选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲液、巴比妥钠-HCl缓冲液、NH

进一步优选为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

7.根据项1所述的酶切方法，其中，进行酶切反应的底物浓度为0.5-10mg/ml，优选为1-8mg/ml，进一步优选为1-4mg/ml。

8.根据项1所述的酶切方法，其中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为0.5-10U/mg，优选为1.5-6U/mg，进一步优选为2-5U/mg。

9.根据项1所述的酶切方法，其中，底物为包含DDDDK的氨基酸序列。

10.根据项1所述的酶切方法，其中，酶切反应的反应时间为4-72h。

11.乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途。

12.根据项11所述的用途，其中，在乙醇的存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应。

13.根据项12所述的用途，其中，用于酶切反应的乙醇体积浓度为1％-50％，优选为5％-40％，进一步优选为10％-30％。

14.根据项12所述的用途，其中，肠激酶、乙醇、以及底物在缓冲液中进行酶切反应。

15.根据项14所述的用途，其中，所述缓冲液的pH为7.1-10，优选为7.4-9.5，进一步优选为7.5-9.0。

16.根据项14所述的用途，其中，所述缓冲液选自磷酸盐类缓冲液、Tris类缓冲液、有机酸类缓冲液、硼酸盐类缓冲液、氨基酸类缓冲液中的一种或两种以上，优选选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲液、巴比妥钠-HCl缓冲液、NH

17.根据项12所述的用途，其中，进行酶切反应的底物浓度为0.5-10mg/ml，优选为1-8mg/ml，进一步优选为1-4mg/ml。

18.根据项12所述的用途，其中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为0.5-10U/mg，优选为1.5-6U/mg，进一步优选为2-5U/mg。

19.根据项12所述的用途，其中，底物包含DDDDK的氨基酸序列。

20.根据项12所述的用途，其中，底物酶切反应的反应时间为4-72h。

21.一种生产多肽的方法，其中，所述方法包括项1-10中任一项所述的高特异性肠激酶酶切方法，

优选地，所述方法包括在乙醇存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应。

22.根据项21所述的方法，其中，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为1％-50％，优选为5％-40％，进一步优选为10％-30％。

23.根据项21所述的方法，其中，肠激酶、所述酶切促进剂、以及底物在缓冲液中进行酶切反应。

24.根据项23所述的方法，其中，所述缓冲液的pH为7.1-10，优选为7.4-9.5，进一步优选为7.5-9.0。

25.根据项23所述的方法，其中，

所述缓冲液选自磷酸盐类缓冲液、Tris类缓冲液、有机酸类缓冲液、硼酸盐类缓冲液、氨基酸类缓冲液中的一种或两种以上，优选选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲液、巴比妥钠-HCl缓冲液、NH

26.根据项21所述的方法，其中，进行酶切反应的底物浓度为0.5-10mg/ml，优选为1-8mg/ml，进一步优选为1-4mg/ml。

27.根据项21所述的方法，其中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为0.5-10U/mg，优选为1.5-6U/mg，进一步优选为2-5U/mg。

28.根据项21所述的方法，其中，底物为包含DDDDK的氨基酸序列。

29.根据项21所述的方法，其中，多肽为GLP-1、其类似物或衍生物。

30.根据项21所述的方法，其中，酶切反应的反应时间为4-72h。

31.一种纯化多肽的方法，其中，所述方法包括项1-10中任一项所述的高特异性肠激酶酶切方法，

优选地，所述方法包括在乙醇存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应。

32.根据项31所述的方法，其中，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为1％-50％，，优选为5％-40％，进一步优选为10％-30％。

33.根据项31所述的方法，其中，肠激酶、所述酶切促进剂、以及底物在缓冲液中进行酶切反应。

34.根据项33所述的方法，其中，所述缓冲液的pH为7.1-10，优选7.4-9.0，进一步优选为8.0-9.0。

35.根据项33所述的方法，其中，所述缓冲液

选自磷酸盐类缓冲液、Tris类缓冲液、有机酸类缓冲液、硼酸盐类缓冲液、氨基酸类缓冲液中的一种或两种以上，优选选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲液、巴比妥钠-HCl缓冲液、NH

36.根据项31所述的方法，其中，进行酶切反应的底物浓度为0.5-10mg/ml，优选为1-8mg/ml，进一步优选为1-4mg/ml。

37.根据项31所述的方法，其中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为0.5-10U/mg，优选为1.5-6U/mg，进一步优选为2-5U/mg。

38.根据项31所述的方法，其中，底物为包含DDDDK的氨基酸序列。

38.根据项31所述的方法，其中，多肽为GLP-1、其类似物或衍生物。

40.根据项31所述的方法，其中，酶切反应的反应时间为4-72h。

41.一种酶切组合物，其中，所述酶切组合物是通过项1-10中任一项所述的酶切方法获得的，

优选地，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽，其中所述酶切组合物中目标多肽的质量含量大于等于80％，优选大于等于85％，进一步优选大于等于90％。

42.根据项41所述的酶切组合物，其中，所述酶切组合物还包括SEQ ID NOs:4-7所示多肽的一种或两种以上。

43.根据项41所述的酶切组合物，其中，所述酶切组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％，优选小于等于6％，进一步优选小于等于5％。

44.一种酶切杂质组合物，其中，所述酶切杂质组合物是通过项1-10中任一项所述的酶切方法获得的，

优选地，所述酶切杂质组合物包括SEQ ID NOs:4-7所示多肽的一种或两种以上，其中所述酶切杂质组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总含量小于等于10％，优选小于等于6％，进一步优选小于等于5％。

45.根据项44所述的酶切杂质组合物，其中，所述酶切杂质组合物还包括SEQ IDNO:1所示目标多肽。

46.根据项45所述的酶切杂质组合物，其中，所述酶切杂质组合物中目标多肽的总质量含量大于等于80％，优选大于等于85％，进一步优选大于等于90％。

本申请提供的肠激酶酶切方法，通过酶切体系中添加酶切促进剂，例如乙醇，从而提高了酶切特异性，使得使用本申请方法的非特异性产物含量相比现有技术大幅降低，从而可以大幅提高产物纯度。同时，本发明酶切方法可以保持肠激酶极高的酶切率，确保了肠激酶酶切特异性和酶切效率的平衡；操作简单、有效降低了纯化成本。同时，本申请通过对酶与蛋白质的酶切体系的多种常规参数的进一步研究，意外发现，本申请提供的肠激酶酶切方法受本领域的酶切参数(如酶切比例、pH值、底物蛋白浓度、酶切温度及酶切时间等)常规范围下变化的影响较小，可满足在常规非极端的肠激酶切反应中稳定发挥发明效果，有适用条件宽泛，方法稳定性高，具有极好的工业适用性的特点。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

在多肽重组生产中，使用肠激酶对表达的多肽产物进行酶切的过程中，由于肠激酶的非特异性切割，将面临在酶切后产生大量且多种非特异性切割产物的技术难题，这些非特异性产物的出现极大地影响了生产产品纯度和质量，为后续多肽纯化工艺带来困难，使得相关工艺更为复杂，因此，亟需寻找操作简便、经济、稳定、高效的针对肠激酶非特异性产物的工艺方法，从而在保证高水平酶切活性的前提下，提高酶切特异性，增加目标多肽纯度。

为此，本申请提供一种高特异性肠激酶酶切方法，其包括在酶切促进剂的存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应。其中，所述酶切促进剂选自乙醇、甘油、蔗糖、氯化钠中的一种或两种以上。

肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶，其对于包含DDDDK的氨基酸序列具有切割特异性。本申请的方法适用于各种来源的肠激酶。肠激酶可以通过商购获得，也可以通过本领域已知的方法表达获得。肠激酶包括但不限于天然的动物源肠激酶、重组肠激酶、肠激酶轻链以及上述肠激酶或轻链活性的突变体、片段，和包含上述序列的蛋白产物。所述动物优选为脊椎动物，进一步优选为哺乳动物，更优选为人、牛或猪。

由于肠激酶对于氨基酸序列DDDDK具有切割特异性，因此，本申请的方法可以适用于任何包含氨基酸序列DDDDK的物质，以提高肠激酶对于氨基酸序列DDDDK位点的切割特异性，所述的物质包括但不限于包含有氨基酸序列DDDDK的多肽、蛋白质、多肽复合物、蛋白质复合物、多肽衍生物、蛋白质衍生物、多肽类似物、蛋白质类似物。

在本申请中术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键连接。

其中本申请中所用的“复合物”或“复合的”指，通过并非肽键的键和/或力(例如范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力)而彼此相互作用的两个或多个分子的结合。在一个实施方案中，复合物是异源多聚体。应理解，本申请中所用的术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括这样的复合物，在该蛋白质复合物中具有缀合至蛋白质的非蛋白质实体(例如，包括但不限于化学分子，如毒素或检测剂)。

在本申请中术语“衍生物”是指亲本肽的一个或多个氨基酸残基被化学修饰后产生的肽段，例如，通过烷基化，酰化，酯形成或酰胺形成。

在本申请中术语“类似物”用于指亲本肽的一个或多个氨基酸残基被其他的氨基酸残基所取代，和/或亲本肽的一个或多个氨基酸残基缺失，和/或一个或多个氨基酸残基加入亲本肽，所获得的肽。这种加入可以发生在亲本肽的N-末端和/或C-末端。

在本申请中术语“融合蛋白”或“融合多肽”意在表示这样的多肽，其包含例如为了组成非天然存在的多肽而融合在一起的两个或更多个多肽。所融合的多肽的大小可以变化并且取决于融合多肽的目的。为了提高表达，融合多肽经常地在蛋白质的重组表达过程中使用，以促进可溶性表达产物的维持、以促进融合多肽或其部分向细胞外介质的排出、以保护多肽免于被蛋白酶或肽酶非故意地处理，等等。在这样的融合多肽中，至少两个组成多肽中的一个通常被指定为“目标多肽”或“成熟蛋白质”，即，是有待通过重组表达过程制备的多肽。

在一个具体的实施方式中，底物为Flag标签和多肽或其类似物或衍生物组成的融合蛋白。这些多肽包括但不限于胃泌素抑制肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素(Glucagon)等。

Flag标签可以为任何包含DDDDK的标签或含有DDDDK的标签+连接肽。

在一个具体的实施方式中，Flag标签的序列为KETAAAKFE RQHMDS DDDDK(SEQ IDNO:2)

在一个具体的实施方式中，Flag标签的序列为HHHHHH DDDDK(SEQ ID NO:3)

在一个具体的实施方式中，底物为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和Flag标签的融合蛋白，所述GLP-1意指GLP-1、其类似物或衍生物。

在一个具体的实施方式中，底物为GLP-1多肽类似物Val

在本申请的酶切方法中，酶切促进剂的加入可以改变酶切体系的溶剂环境，从而提高酶切特异性。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度，即用于酶切反应的乙醇体积浓度为1％-50％，例如可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％。

本文中提到乙醇浓度如未特别说明均指乙醇的体积浓度。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度为5％-40％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度为10％-30％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度为10％-20％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度为20％-30％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度为10％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度为20％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在酶切体系中的体积浓度为30％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为甘油。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为甘油，甘油在酶切体系中的体积浓度为1％-50％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为甘油，甘油在酶切体系中的体积浓度为5％-40％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为甘油，甘油在酶切体系中的体积浓度为10％-30％。

在本申请的酶切方法中，肠激酶、所述酶切促进剂、以及底物在缓冲液中进行酶切反应，所述缓冲液的pH为7.1-10，即本申请的酶切体系的pH为7.1-10，例如可以为7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10。本领域技术人员完全可以理解以上针对pH数值范围仅仅为列举，本领域技术人员可以基于应用过程中的实际情况进行调节。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液的pH为7.4-9.5。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液的pH为7.5-9。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液的pH为7.1-9。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液的pH为9-10。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液的pH为8-9。

缓冲溶液是一类能够在外界少量酸或碱或水加入时抵制其影响并且维持原体系pH基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一种或两种化合物溶于溶剂(如纯水)所得的溶液，溶液内所溶解的溶质(化合物)称为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。本申请所述的缓冲液可以采用本领域各种常用的缓冲液，包括但不限于磷酸盐类(H

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.1-10的NH

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.1-10的NaHCO

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.1-10的Tris-HCl缓冲液。其中，在所述缓冲液中，Tris-HCl的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.1-10的Na

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.1-10的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.4-9.5的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.5-9的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH8-9的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.1的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH7.5的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH8的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为pH9的PB缓冲液。其中，在所述缓冲液中，磷酸盐的浓度不作限定。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为20mM，pH7.4的PB缓冲液。

在一个具体的实施方式中，酶切体系所采用的缓冲液为20mM，pH8的PB缓冲液。

本申请酶切方法的反应温度可以是酶发挥活性可接受的任意温度，优选地，所述酶切反应温度可以为0-25℃，例如可以为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃等。本领域技术人员完全可以理解以上针对温度数值范围仅仅为列举，本领域技术人员可以基于应用过程中的实际情况进行调节。

在一个具体的实施方式中，酶切方法的反应温度为4-20℃。

本申请的酶切方法中，反应时间可以根据不同的反应底物进行调整。

在一个具体的实施方式中，酶切反应的反应时间为4-72h，例如可以为4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、50h、52h、54h、56h、58h、60h、62h、64h、68h、70h、72h。

本申请的酶切方法中，反应底物的浓度可以根据需要进行调整。

在一个具体的实施方式中，进行酶切反应的底物浓度为0.5-10mg/ml，例如可以为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml，优选为1-4mg/ml。

在一个具体的实施方式中，进行酶切反应的底物浓度为1-4mg/ml。

在一个具体的实施方式中，进行酶切反应的底物浓度为2-4mg/ml。

在本申请中的酶切比例是指肠激酶酶活与底物质量的比值。

在一个具体的实施方式中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为1-10U/mg，例如可以为1U/mg、2U/mg、3U/mg、4U/mg、5U/mg、6U/mg、7U/mg、8U/mg、9U/mg、10U/mg。

在一个具体的实施方式中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为1-8U/mg。

在一个具体的实施方式中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为1.5-6U/mg。

在一个具体的实施方式中，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为2-5U/mg。

在一个具体的实施方式中，所述酶切方法包括：肠激酶、乙醇、以及底物在缓冲液中进行酶切反应，其中，所述缓冲液的pH为7.1-10，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为1％-50％，进行酶切反应的底物浓度为0.5-10mg/ml，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为0.5-10U/mg。

在一个具体的实施方式中，所述酶切方法包括：肠激酶、乙醇、以及底物在缓冲液中进行酶切反应，其中，所述缓冲液的pH为7.1-10的PB缓冲液，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为10％-30％，进行酶切反应的底物浓度为1-4mg/ml，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为1.5-6U/mg。

在一个具体的实施方式中，所述酶切方法包括：肠激酶、乙醇、以及底物在缓冲液中进行酶切反应，其中，所述缓冲液的pH为8-9的PB缓冲液，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为20％-30％，进行酶切反应的底物浓度为2-4mg/ml，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为2-5U/mg。

在一个具体的实施方式中，所述酶切方法包括：肠激酶、乙醇、以及底物在缓冲液中进行酶切反应，其中，所述缓冲液的pH为7.5-9的PB缓冲液，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为10％-30％，进行酶切反应的底物浓度为1-4mg/ml，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为1.5-6U/mg。

在一个具体的实施方式中，所述酶切方法包括：肠激酶、乙醇、以及底物在缓冲液中进行酶切反应，其中，所述缓冲液的pH为7.5-9的20mM PB缓冲液，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为10％-30％，进行酶切反应的底物浓度为1-4mg/ml，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为1.5-6U/mg。

在一个具体的实施方式中，所述酶切方法包括：肠激酶、乙醇、以及底物在缓冲液中进行酶切反应，其中，所述缓冲液的pH为7.5-9的20mM PB缓冲液，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为10％-30％，进行酶切反应的底物浓度为1-4mg/ml，进行酶切反应的肠激酶酶活与底物的比值为1.5-6U/mg，酶切反应温度为4-20℃，反应时间为4-72h。

本申请还提供乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途。

进一步地，在该用途中，将肠激酶置于含有乙醇的酶切体系中进行反应。

更进一步地，有关酶切体系中的乙醇浓度、所采用的缓冲液、反应温度和时间、底物浓度、肠激酶酶活与底物的比值如上所述。

本申请还提供一种生产多肽的方法，其中，所述方法包括上述任一种的酶切方法。

在一个具体的实施方式中，所述方法包括在乙醇的存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为1％-50％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为10％-30％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为20％-30％。

其中，肠激酶、所述酶切促进剂、以及底物在缓冲液中进行酶切反应。

肠激酶、底物的种类及用量，以及缓冲液的种类和pH如上文所述。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液的pH为7.1-10。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液为pH为7.1-10的PB缓冲液。

在一个具体的实施方式中，组合物的缓冲液为20mM，pH7.4的PB缓冲液。

所生产得到的多肽包括但不限于胃泌素抑制肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素(Glucagon)等、及其类似物和衍生物。

在一个具体的实施方式中，生产得到的多肽为GLP-1、其类似物或衍生物。

在一个具体的实施方式中，生产得到的多肽为GLP-1的类似物。

本申请还提供一种纯化多肽的方法，其中，所述方法包括上述任一种的酶切方法。所述方法包括在酶切促进剂的存在下，利用肠激酶对底物进行酶切反应。该酶切反应可以提高目标多肽的产量，降低杂质多肽的含量，从而达到目标多肽纯化的目的。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为1％-50％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为10％-30％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，用于酶切反应的乙醇的体积浓度为20％-30％。

其中，肠激酶、所述酶切促进剂、以及底物在缓冲液中进行酶切反应。

肠激酶、底物的种类及用量，以及缓冲液的种类和pH如上文所述。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液的pH为7.1-10。

在一个具体的实施方式中，所述缓冲液为pH为7.1-10的PB缓冲液。

在一个具体的实施方式中，组合物的缓冲液为20mM，pH7.4的PB缓冲液。

所纯化得到的多肽包括但不限于胃泌素抑制肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素(Glucagon)等、及其类似物和衍生物。

在一个具体的实施方式中，纯化得到的多肽为GLP-1、其类似物或衍生物。

在一个具体的实施方式中，纯化得到的多肽为GLP-1的类似物。

本申请的生产多肽和纯化多肽的方法具有高的酶切效率，同时降低非特异性酶切产物杂质的含量，从而提供目标多肽的产量。

本申请还提供一种用于高特异性肠激酶酶切的组合物，其包括缓冲液和酶切促进剂，其中所述酶切促进剂选自乙醇、甘油、蔗糖、氯化钠中的一种或两种以上。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在组合物中的体积浓度为1％-50％。在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，乙醇在组合物中的体积浓度为10％-30％。

在一个具体的实施方式中，组合物的缓冲液的pH为7.1-10。

在一个具体的实施方式中，组合物的缓冲液为pH为7.1-10的PB缓冲液。

在一个具体的实施方式中，组合物的缓冲液为20mM，pH7.4的PB缓冲液。

具体地，可以将一定量的肠激酶和底物添加到本申请的用于高特异性肠激酶酶切的组合物中进行酶切反应。肠激酶和底物的种类及用量如上文所述。

本申请还提供一种高特异性肠激酶酶切试剂盒，其包括第一试剂盒和包括肠激酶的第二试剂盒，第一试剂盒包括缓冲液和酶切促进剂，其中所述酶切促进剂选自乙醇、甘油、蔗糖、氯化钠中的一种或两种以上。其中，肠激酶的种类及用量如上所述。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，在试剂盒中的体积浓度为1％-50％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切促进剂为乙醇，在试剂盒中的体积浓度为10％-30％。

在一个具体的实施方式中，试剂盒的缓冲液的pH为7.1-10。

在一个具体的实施方式中，试剂盒的缓冲液为pH为7.1-10的PB缓冲液。

在一个具体的实施方式中，试剂盒的缓冲液为20mM，pH7.4的PB缓冲液。

具体地，在使用本申请的高特异性肠激酶酶切试剂盒时，可以第一试剂盒、第二试剂盒和底物混合进行酶切反应。其中底物的种类及用量如上文所述。

本申请还提供一种酶切组合物，所述酶切组合物通过上述任一种的酶切方法或任一种制备多肽或纯化多肽的方法获得。

所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽。其中所述酶切组合物中目标多肽的质量含量大于等于80％，例如可以为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％等。

SEQ ID NO:1所示的目标多肽即为本申请的化合物1。

SEQ ID NO:1：HVEGTFTSDV SSYLEEQAAR EFIKWLVRGR G

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽，其中所述酶切组合物中目标多肽的质量含量大于等于80％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽，其中所述酶切组合物中目标多肽的质量含量大于等于85％。

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽，其中所述酶切组合物中目标多肽的质量含量大于等于90％。

进一步地，所述酶切组合物还包括SEQ ID NOs:4-7所示多肽的一种或两种以上。

SEQ ID NO:4为：HVEGTFTSDV SSYLEEQAAR

SEQ ID NO:5为：EFIKWLVRGR G

SEQ ID NO:6为：EFIKWLVR

SEQ ID NO:7为：HVEGTFTSDV SSYLEEQAAR EFIKWLVR

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽和SEQ ID NO:4所示的多肽。

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽和SEQ ID NO:5所示的多肽。

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽和SEQ ID NO:6所示的多肽。

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽和SEQ ID NO:7所示的多肽。

在一个具体的实施方式中，所述酶切组合物包括SEQ ID NO:1所示的目标多肽和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的多肽。

在所述酶切组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％，例如可以为10％、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％等。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于6％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于5％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于80％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于85％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于90％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于80％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于6％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于80％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于5％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于85％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于6％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于90％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于5％。

本申请的酶切组合物还可以包含在制备过程中可能产生的其他成分，例如缓冲液中包含的盐成分等。

本申请还提供一种酶切杂质组合物，所述酶切杂质组合物通过上述任一种的酶切方法或任一种制备多肽或纯化多肽的方法获得。

所述酶切杂质组合物包括SEQ ID NOs:4-7所示多肽的一种或两种以上，其中所述酶切杂质组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总含量小于等于10％，例如可以为10％、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％等。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于6％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切组合物中SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于5％。

进一步地，所述酶切杂质组合物还包括SEQ ID NO:1所示目标多肽。

在一个具体的实施方式中，所述酶切杂质组合物中目标多肽的总质量含量大于等于80％，优选大于等于85％，进一步优选大于等于90％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切杂质组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于80％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切杂质组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于85％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切杂质组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于90％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于10％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切杂质组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于80％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于6％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切杂质组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于80％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于5％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切杂质组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于85％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于6％。

在一个具体的实施方式中，在所述酶切杂质组合物中SEQ ID NO:1所示的目标多肽的质量含量大于等于90％，SEQ ID NOs:4-7所示多肽的总质量含量小于等于5％。

在本申请中，使用质谱法和高效液相色谱法对酶切产物进行检测。

其中，质谱法是使待测化合物产生气态离子，再按质荷比(m/z)将离子分离、检测的分析方法，检测限可达10

在由泵维持的约10

GLP-1纯度及酶切率的计算方法

本申请的酶切率为100％减去未被酶切底物的百分比含量，即100％-未被酶切底物含量％。

采用面积归一化法测定蛋白纯度：取一定量待检测的样品，使用高效液相色谱检测样品，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。GLP-1纯度可根据色谱检测结果直接记录数据。

实施例1GLP-1多肽类似物的表达、纯化及酶切杂质测定

菌体构建与表达：采用重组表达方法制备工程菌并以可溶的形式表达融合蛋白M-Flag-Val

已转化的BL21 DE3或Tuner DE3工程菌在含有抗生素的LB培养基中过夜培养，取过夜的菌液接种值更大体积的含有抗生素的LB培养基中37℃摇床继续培养4小时后，使用IPTG对工程菌进行诱导表达，过夜，菌液离心，获得菌体经重悬浮后超声破碎，离心，获得的上清液。

分离与酶切：上清液通过采用离子交换层析以获得表达的M-Flag-Val

采用的层析柱为GE的XK26，层析介质为G25(Cytiva，货号：17003303)，方法为采用相应的置换缓冲液进行平衡后，上样及洗脱，根据紫外及电导的变化收集融合蛋白样品。

进行酶切，将融合蛋白样品用20mmol/L PB(pH7.4)缓冲液稀释至2mg/ml，再加入酶切比例为1.5U/mg左右的重组肠激酶rEK(上海雅心生物技术有限公司，货号为REK08)混合均匀，4℃下酶切反应12h。采用RP-HPLC联合质谱分析确定目标物和杂质类型后续采用RP-HPLC测定即可，根据面积归一法并计算酶切率、GLP-1的纯度及非特异性杂质含量。其中，高效液相色谱条件为流速0.8ml/min，柱温35℃，检测波长215nm及280nm，流动相A为100％ H

表1液相色谱洗脱梯度列表

经分析，酶切后各产物质谱情况如下：

表2质谱结果汇总

如表2所示，通过质谱信息推测对应各化合物结构，其中各化合物以SEQ ID NO:1对应氨基酸及其位置表示，如化合物1是SEQ ID NO:1所示多肽第4位G到第13位Y对应多肽片段。经分析，化合物8对应SEQ ID NO:1所示目标多肽Val

实施例2酶切缓冲体系

根据实施例1所述方法，虽然产生了高达95％以上的酶切率，但非特异性酶切产物总含量高达40％以上，不能满足获得目标GLP-1多肽衍生物的需求。为了获得更理想的酶切效果，在融合蛋白浓度为1.0mg/ml，酶切比例为1-1.5U/mg，4℃下酶切反应12小时的条件下，按照表3所示酶切反应方案进行酶切：

表3

采用实施例1所述高效液相色谱和质谱检测方法对各组实验方案所得酶切产物进行分离和分析，并计算酶切率、目标GLP-1多肽类似物纯度，非特异性产物含量，结果见表4。

表4

如表4所示，化合物4、5、6、9为各组酶切的主要杂质，A4-A8实验方案一定程度上降低了非特异性杂质含量，但仍旧处于较高水平；A9和A10实验方案能够显著降低主要非特异性酶切产物的总含量至5％以下，然而同时酶切率和目标GLP-1多肽类似物含量也明显降低，A1和A3实验方案保持了较好的目标GLP-1多肽类似物含量，同时相对少的非特异性酶切含量，但其酶切率仍在95％以下；A2实验方案在酶切率、非特异性酶切产物含量和目标GLP-1多肽类似物含量方面达到较高平衡，即在PB、NH

实施例3酶切环境研究

鉴于rEK酶切割融合蛋白底物时，会产生较多的非特异性酶切产物，因此尝试添加不同试剂调节溶剂环境来改变rEK对不同酶切位点的选择性，本申请对比了乙醇、甘油、氯化钠以及蔗糖对酶切的影响。为了验证各方案酶切效果，在蛋白浓度为1.0mg/ml，酶切比例为1-4U/mg，不同缓冲液条件下，4℃下进行酶切反应12小时。分别采用按照表5所示酶切反应方案进行酶切：

表5

如实施例1所述高效液相色谱和质谱检测方法对各组实验方案所得酶切产物分离和分析，并计算酶切率、目标GLP-1多肽类似物纯度，非特异性酶切产物含量，结果见表6。

表6

研究结果表明，蔗糖(实验方案B1)和NaCl(实验方案B8-B12)在一定程度上能够保持较高的酶切活性,但不能有效降低非特异性酶切产物含量；值得注意地是，甘油(实验方案B2-B7)和乙醇(实验方案B15)在保持高水平的酶切效率和GLP-1含量的同时，也能明显降低肠激酶非特异性反应，分别能够使非特异性产物总量降低到10％和5％以下，说明两者添加有均利于减少非特异性酶切杂质的产生。更令人意想不到的是，在原本已证明不能降低非特异性酶切的NH

实施例4不同乙醇条件下的酶切效果

本申请比较不同乙醇浓度条件下对酶切的影响。在蛋白浓度为1.0mg/ml，酶切比例为1-4U/mg，乙醇含量分别为10％、20％、30％，温度为4℃条件下，按照表7所示酶切反应方案进行酶切反应，以验证乙醇效果：

表7

采用实施例1所述高效液相色谱和质谱检测方法对各组实验方案所得酶切产物进行分离和分析，并计算酶切率、目标GLP-1多肽类似物纯度，非特异性产物含量，结果见表8。

表8

综合上述表8中实验方案C1-C8结果：无论何种含量的乙醇的添加均可以显著降低非特异性酶切杂质的产生，在保持高酶切率和目标GLP-1多肽衍生物含量的同时，具有极低的非特异性酶切产物含量。

实施例5酶切温度研究

本申请比较了温度在4-25℃范围内，不同温度条件下对酶切的影响。蛋白浓度为1.0mg/ml，含20％乙醇，酶切比例为2U/mg，缓冲液为20mM，pH7.4的PB缓冲液。分别在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃条件下进行12小时的酶切反应。采用实施例1所述高效液相色谱和质谱检测方法对各组实验方案所得酶切产物进行分离和分析，并计算酶切率、目标GLP-1多肽类似物纯度，非特异性产物含量。结果如表9所示。

表9

表9结果表明温度0-25℃条件下，酶切效果均在可接受范围内，尤其是在20℃以下，GLP-1纯度可达90％以上，且非特异性酶切杂质的含量低于5％。

实施例6酶切pH研究

本申请对比了pH6.5-10.0范围内(20mM PB缓冲液)，不同反应的pH值对于酶切的影响。蛋白浓度为1.0mg/ml，含20％乙醇，酶切比例为2U/mg，4℃下，分别在pH为6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10条件下进行12小时酶切反应。采用实施例1所述高效液相色谱和质谱检测方法对各组实验方案所得酶切产物进行分离和分析，并计算酶切率、目标GLP-1多肽类似物纯度，非特异性产物含量。结果如表10所示。

表10

结果表明，随着pH值的增加，酶切率会增加，其中在pH6.5-pH7.0的条件下，酶切率均低于90％；尤其在该酶切反应中，在pH7.0以上且pH9.5以下的条件下进行酶切反应体现了良好的效果。

实施例7酶切的酶切蛋白浓度研究

本申请对比了1-4mg/ml的蛋白浓度对酶切的影响。酶切反应体系含20％乙醇，酶切比例为2U/mg，缓冲液为20mM，pH8.5的PB缓冲液。在酶切体系中分别采用1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的蛋白浓度在10℃下进行12小时的酶切反应。采用实施例1所述高效液相色谱和质谱检测方法对各组实验方案所得酶切产物进行分离和分析，并计算酶切率、目标GLP-1多肽类似物纯度，非特异性产物含量。结果如表11所示。

表11

结果表明，蛋白浓度对酶切的影响不大，酶切浓度1mg/ml以上均可在保持高水平酶切率和目标GLP-1多肽衍生物纯度的前提下，使肠激酶非特异性酶切产物含量降低至5％以下。

实施例8酶切时间研究

本申请考察了酶切时间的影响。反应体系中蛋白浓度为2.0mg/ml，含20％乙醇，酶切比例为2U/mg，缓冲液为20mM，pH8.5的PB缓冲液。反应体系在10℃下进行酶切反应，酶切反应时间分别为2、4、16、24、48、72小时。

表12

如表12所示，当酶切反应进行超过4h以上，酶切率即可达到90％以上，尤其是在8h以上时，酶切率为99％，酶切反应基本完全，且随时间的增加，酶切率基本稳定，同时非特异性酶切产物含量也维持在较低的水平。因此，上述结果表明酶切在4到72h为宜，继续酶切超过3天，GLP-1的纯度会降低，非特异性酶切产物会增加。

实施例9酶切比例研究

本申请比较了酶切比例对于酶切效果的影响。反应体系中蛋白浓度为2.0mg/ml，含20％乙醇，缓冲液为20mM，pH8.5的PB缓冲液。反应体系在10℃下分别采用不同酶切比例进行12小时酶切反应。采用实施例1所述高效液相色谱和质谱检测方法对各组实验方案所得酶切产物进行分离和分析，并计算酶切率、目标GLP-1多肽类似物纯度，非特异性产物含量。结果如表13所示。

表13

结果表明，任意酶切比例，均能有效控制非特异性酶切产物的含量在低水平，尤其是在酶切比例为1.5U/mg以上可以保证酶切率达到90％以上，且非特异性酶切杂质含量低于5％。

实施例10其它标签添加乙醇的影响

本申请比较了乙醇添加对于肠激酶酶切M-Flag2-Val

表14

结果表明，酶切底物为M-Flag2-Val

序列表

SEQ ID NO:1

HVEGTFTSDV SSYLEEQAAR EFIKWLVRGR G

SEQ ID NO:2

KETAAAKFE RQHMDS DDDDK

SEQ ID NO:3

HHHHHH DDDDK

SEQ ID NO:4

HVEGTFTSDV SSYLEEQAAR

SEQ ID NO:5

EFIKWLVRGR G

SEQ ID NO:6

EFIKWLVR

SEQ ID NO:7

HVEGTFTSDV SSYLEEQAAR EFIKWLVR。