一种青岛百合的种球繁育方法

摘要

本发明公开了一种青岛百合的种球繁育方法，其包括如下步骤：1)剥取百合种球鳞片，进行消毒及预处理；2)将处理的百合鳞片接种于生产培养基上2个月诱导出芽球；3)将芽球剥下，在生产培养基上继代2次，选取直径约1.0‑2.0cm的种球，剥下鳞片横切成3‑4段，在2.0mg/L BA溶液中浸泡10‑20min，取出稍晾干后接种入生产培养基，培养2个月后，长出直径0.3‑0.5cm的小芽球；4)重复3)步骤，可循环生产青岛百合芽球；5)将步骤3)获得的芽球，在生产培养基上连续继代得到成品种球；6)将种球低温冷藏处理60天，打破休眠；7)将种球预处理后，栽种于基质中培养1年，获得商品种球。本发明优点：种球繁殖率高，畸变率小，简单易操作，组培球移栽成活率高，基质栽种效果好，商品种球质量好。

说明书

技术领域

本发明涉及百合组培快繁领域，具体的为一种青岛百合的种球繁育方法。

背景技术

青岛百合是青岛崂山特有的一种野生花卉资源，其花朵呈橙红或黄色，花瓣修长艳丽，是国家二级濒危植物。野生居群呈群落分布，由于人为破坏，面积逐年缩小，多样性面临威胁。通过人工拯救繁殖，有利于百合野生资源的保护，还可作为园林景观花卉加以利用。

野生青岛百合主要依靠种子和鳞茎繁殖，种子实生苗需5～7年才开花，且发芽率低，难以规模化利用。而传统的鳞片扦插繁殖系数低、周期长，长期繁殖造成病毒积累，种性退化，不适宜青岛百合这类数量较少的珍稀野生种。如授权号为CN101711493B的专利直接剥取鳞片繁殖百合种球，其直接将消毒后的鳞片栽种到大田中，栽种当年不采收，让植株在大田中自然越冬和春化，直至来年11月种球成熟后进行采收。

植物组织培养则可以有效解决以上问题。目前，青岛百合组培研究多集中在实验室阶段，多采用细胞分类素类刺激增殖，畸变率高，操作要求高，费时费力不适合工厂化操作的要求。此外，百合组培苗移栽后易腐烂也是制约百合工厂化组培应用的一个难点，在反复实验对比并结合工厂化生产要求的基础上，我们构建了青岛百合的规模化组培生产体系，该体系操作简单，扩繁效率高，移栽成活率高，种球质量好，适于在百合种球生产企业推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青岛百合的种球繁育方法，解决野生青岛百合种质资源保护、商品化生产和利用的问题。

为了实现上述目的，本发明涉及的一种青岛百合的种球繁育方法，包括以下步骤：

(1)外植体消毒及预处理：弃去百合鳞茎球最外层鳞片，将中层和内层鳞片清洗干净、消毒，然后晾干；

(2)小芽球的诱导：将步骤(1)处理好的中层和内层百合鳞片接种入生产培养基，培养2个月后，长出直径0.3-0.5cm的小芽球；

(3)小芽球的转接：将直径0.3-0.5cm的小芽球切下，转入生产培养基，每2个月继代1次，继代2次后，挑选直径1.0-2.0cm的百合球，剥下鳞片横切成3-4段，放入2.0mg/L的BA溶液中浸泡10-20min，取出后在无菌滤纸上稍吹干，接种入生产培养基，培养2个月后，长出直径0.3-0.5cm的小芽球；1个百合球经过步骤(3)的一次繁殖能够得到80-100个芽球。

(4)芽球增殖：重复步骤(3)即可循环生产大量百合小芽球；

(5)成品种球的获得：将(4)获得的小种球在生产培养基上每2个月继代1次，继代5次后可获得直径4-5cm的成品种球；

(6)种球的低温冷藏：将步骤(5)得到的成品种球直接移入冷库中，4℃低温冷藏60天；

(7)移栽驯化及商品种球的栽种：冷藏后取出种球洗净培养基，平铺于干热灭菌的水苔基质中，均匀喷洒1g/L的甲基硫菌灵溶液，然后覆盖1-2cm厚水苔，定期喷水，维持基质湿度40％-60％，持续炼苗1个月，使种球逐步适应外界环境。驯化完的种球，放入1g/L甲基硫菌灵溶液中浸泡30min后晾干，然后栽种于种植基质中，1年后即可收获。

上述步骤(2)-(5)中，生产培养基均为MS培养基附加0.2-0.5mg/L IBA、20-50g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉，并调节ph值为5.8，培养条件均为24±1℃，黑暗培养。

优选地，步骤(2)-(5)中，生产培养基均为MS培养基附加0.5mg/L IBA、50g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉，并调节ph值为5.8。

上述步骤(7)中，种植基质为：按重量比，松树锯末70-80份，干鸡粪5-10份，干羊粪5-10份，腐殖酸5-10份，海藻粉1-5份。混合均匀后粉碎成1-2mm的颗粒，然后加水50％充分腐熟发酵，至基质变黑色疏松柔软后，加入2％的石灰氮并混合均均，夏季高温闷晒1周后，打开晾晒5-7天即可使用。

具体地，步骤(1)外植体消毒及预处理，具体步骤为：先将百合种球弃去最外层鳞片，将中层和内层鳞片用洗洁精清洗干净，流水冲洗半小时；将完整鳞片在超净台内75％的酒精消毒1min，无菌水冲洗3次；然后用有效氯2％的次氯酸钠溶液消毒10-15min，每100ml滴加1滴吐温，反复摇晃消毒后用无菌水冲洗7次，彻底清洗掉次氯酸钠溶液残留。将消毒后的鳞片用解剖刀切去鳞片基部接触消毒液的部分1-3mm，再放置于无菌滤纸上在超净台内吹干30min。

优选地，步骤(2)小芽球的诱导：将步骤(1)处理好的中层和内层百合鳞片放入冰箱冷冻24h，然后接种入生产培养基，培养2个月后，长出直径0.3-0.5cm的小芽球。

本发明百合种球繁育过程中，按步骤(3)一个小芽球，经过4个月培养后直径达到1.0-2.0cm，含7-9个鳞片，然后切割并处理，再培养2个月后，可扩繁得到80-100个小芽球，周期一共6个月。一年扩繁倍数可达6400-10000倍。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)利用本发明所述的方法，可以有效的进行青岛百合的工厂化生产，只用一种生产培养基和简单的浸泡处理，即可生产青岛百合商品种球，繁殖速度快，系数高，种球畸变率低，且操作简单成本低廉；(2)由于水苔非常柔软，保水透气性非常好，利用水苔炼苗不易划伤鳞片，更利于其鳞片的蜡质化，从而提高移栽的成活率；(3)种植基质，腐熟后颗粒小，非常松散柔软透气，无需额外施肥，栽种百合种球的效果非常好；(4)与采用生产培养基直接培养相比，通过BA溶液浸泡后单个鳞片长出的小芽球从2个左右增大到4个左右，提高了1倍，大大加快了繁育速率。

附图说明

图1鳞片诱导2个月的芽球照片；

图2新接种芽球(A)和培养4个月后的芽球(B)照片；

图3移栽驯化的成品种球(C)和(D)照片；

图4基质栽种后收获得商品种球(E)照片。

具体实施例

下面结合具体实施例和附图对本发明加以说明。

以扦插的青岛百合种球为材料，去除种球最外层鳞片，取完整中层和内层鳞片，加少许洗洁精浸泡鳞片并流水冲洗30min，用吸水纸吸干水分。以75％酒精消毒1min后无菌水冲洗3次，以有效氯2％的次氯酸钠溶液做梯度消毒1-20min，无菌水冲洗8次，彻底洗净次氯酸钠残留，切成1×1cm小块进行接种。从表1可以看出，百合种球由于接触土壤，含菌较多，较难消毒，且随着次氯酸钠消毒时间的延长，对鳞片的伤害增加，褐化率上升，所以选择10-15分钟可以初步达到消毒要求。

表1次氯酸钠消毒时间对青岛百合消毒效果的影响

将鳞片消毒后，先切除鳞片与消毒液接触的基部部分，然后按以下4种预处理方式，1)切小块1.0×1.0cm后直接接种；2)切小块1.0×1.0cm并置于冰箱24h冷藏后接种；3)消毒后整片直接接种；4)整片以无菌水冲洗并置于冰箱24h冷藏后接种。如表2所示，切小块更容易导致外植体褐化，整块接种的方式褐化率最低。4种处理方式，各接种30个鳞片，共重复3次，对褐化数进行方差分析表明，处理1、2和处理3、4之间差异显著，而处理1和2间，处理3和4间差异不显著，即百合鳞片整块接种能显著降低褐化率，但冷藏处理24h对降低褐化的作用并不显著。切小块可能由于消毒液与鳞片的接触面更多，伤害也更强，导致褐化率升高，而保持整块接种可以有效的降低褐化比率。

表2不同预处理方式对百合鳞片褐化率的影响

注：字母a，b表示显著性差异水平小于0.05；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。

将百合鳞片整块接种入6种诱导培养基，每个配方接种5瓶，每瓶接种6个鳞片。如表3所示，6种培养基均添加蔗糖50g/L,琼脂粉6.5g/L，统计45天后的每瓶出芽数。表明，1/2MS和MS上的鳞片出芽少且瘦小；添加细胞分裂素BA或KT有助于芽的诱导，但长出的芽为细的叶片状丛生芽，需要分割并更换培养基才能发育成小鳞茎球，费时费力；在只添加生长素(NAA和IBA)的5和6号培养基，均可以直接长出小鳞茎状的芽，但NAA更容易使芽发生愈伤化，导致畸变。

进一步，利用培养基3和5，各接种120个鳞片(表4)。约45天后，将诱导的芽从鳞片上切下，统一转接入培养基5，在第45天统计鳞茎球的变异情况，结果如表4所示，来自培养基3的芽经过二次培养后才能形成鳞茎球状的芽，且大小与培养基5直接诱导出的芽相似，即通过培养基3来诱导芽会至少晚1.5个月成球。而且，其形态畸变率8.3％大于培养基5来源的小鳞茎球3.3％，且第3次转接后，依然保持较高的变异率。所以，采用培养基5直接诱导成芽更适合规模化生产的要求。

表3不同培养基配方对青岛百合种球增殖的影响

注：本表为每瓶接种6块鳞片，诱导45d后的每瓶平均出芽数。

表4两种培养方式小鳞茎球形态畸变的比较

以培养基5为基础，配制IBA浓度为0.2、0.5、0.7和1.0mg/L的梯度培养基(表5)。选取直径约1.5cm的百合种球，切除所有的根，然后接种入IBA梯度培养基，每个梯度接种10瓶，每瓶接种9个种球。1.5个月后，统计每瓶的百合种球根长，得到每瓶均值，然后记录每个处理梯度下各10瓶的均值。

利用SPSS 17.0对根长均值进行了单因素方差分析，比较了不同IBA浓度对百合球生根长度的影响，显示IBA浓度＞0.5mg/L后，对根的诱导促进作用并无显著增强，本着节约药品的原则，采用IBA浓度为0.5mg/L为较好的选择。

表5不同IBA浓度对百合种球生根的影响

注：相同字母表示组间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)

以培养基5为基础，配制蔗糖浓度为20、30、40、50、60、70和90g/L的梯度培养基(表6)，共配制7个梯度，每个梯度接种6瓶，每瓶接种9个种球。选择直径1.0cm大小的种球，接种前先称取培养瓶的重量，接种后再称取培养瓶的重量，二者差值即为接种种球的初始重量；培养2个月后，先带瓶称取重量，然后移出百合球，再称取空培养瓶的重量，二者差值即为接种种球的最后重量；用最后重量减去初始重量即为百合种球的生长增加重量。

利用SPSS 17.0单因素方差分析比较了不同蔗糖浓度对百合球增重的影响，显示蔗糖浓度＞50g/L后，对百合球重量的促进作用并无显著增强，高浓度蔗糖对百合种球的生长反而不利，本着节约药品的原则，采用蔗糖浓度为50g/L为较好的选择。

表6不同蔗糖浓度对百合种球增重的影响

注：相同字母表示组间差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)

以实施例3培养基5组培的青岛百合种球(直径约1.5cm)为材料，依据鳞片的大小切成3-4小块，在浓度2mg/L BA溶液中浸泡不同时间，然后接种入种球生产培养基，每个处理梯度各接种6瓶，共60块鳞片，共用掉17个百合种球，即每个梯度约2.43个种球。培养2个月后，统计每个梯度的出芽总数量。结果如表7所示，随着浸泡时间的增长，芽的增值系数呈上升趋势，对各梯度下出小球数量的显著性分析表明，超过10min后，浸泡时间对鳞片的增殖促进作用不在显著增强，第5、6和7处理组间差异不显著，所以，浸泡时间为10-20min即可。以平均1个种球计算，10-30分钟处理，其增殖倍数为88-101倍。

表7不同BA浸泡时间对百合鳞片增殖的影响

鳞片诱导2个月后，选择直径0.3-0.5cm的小芽球切下，转接至生产培养基上继代培养2次，共培养4个月，使小芽球慢慢长大，然后选择直径1.0-2.0cm的百合球，剥下鳞片横切成3-4段，在灭菌的2.0mg/L BA溶液中浸泡10-20min，用滤网过滤出鳞片小块，置无菌滤纸上稍晾干，然后接种入生产培养基，培养2个月后诱导出芽球。重复进行以上操作，即为百合种球的循环生产。在外植体消毒步骤中，为降低褐化率，采用整块接种的方式，而循环生产时，可以将百合鳞片切成小块，是因为没有次氯酸钠的伤害，小鳞片块的褐化率会变得很低。

进一步，循环生产获得的小芽球，待种球积累至一定量后，直接在生产培养基连续继代5次即可获得直径约4-5cm的商品种球。在青岛百合种球的整个生产过程中，均保持黑暗环境，温度维持在24±1℃。

待组培百合种球直径达4-5cm时，即可随瓶移入冷库冷藏60天，冷藏后取出种球洗净培养基，均匀摆放于水苔基质中并覆盖1-2cm厚水苔，定期喷水，维持基质湿度40％-60％，持续炼苗1个月，使种球在基质内逐步适应外界环境。

驯化完的种球，放入1g/L甲基硫菌灵溶液中浸泡30min后晾干，然后栽种于种植基质中。水苔炼苗可以提供一定的酸性环境，降低种球霉变几率，而且水苔质地疏松柔软，透气保湿性好，不会像土壤颗粒或锯末会划伤幼嫩的组培球，从而可以降低染菌率，提高百合种球的成活率。

选择园土、常用育苗基质(草炭：珍珠岩：蛭石＝5:3:1)、步骤(7)中的种植基质土，选用55cm×25cm的种植盆，选取大小相对一致的种球，每盆栽种种球(3×9)27个，每种基质栽种5盆。于当年3月初栽种，当年11月末收获，整个生长期不施加肥料，只浇水。统计成活种球个数和每盆种球重量均值。结果如表8所示，步骤(7)的基质明显优于其它两种基质，非常适合青岛百合种球的种植。

表8不同栽培基质对百合种球成活率和种球大小的影响

通过以上实施例表明，本发明所述的方法系统的解决了青岛百合工厂化生产的问题，方法简单易操作，繁殖系数高。利用水苔驯化炼苗和专用基质种植栽培，对种球伤害小，成活率高，生产的商品种球质量非常好。