茶皂素TS在制备防控苹果树真菌病害药物中的应用

摘要

本发明公开了一种茶皂素TS在制备防控Valsa mali菌或Botryosphaeria dothidea菌或Alternaria alternaria f.sp.mali菌诱导苹果树真菌病害的药物中的应用，所述茶皂素TS对Valsa mali菌的最小抑菌浓度为0.001％，对Botryosphaeria dothidea菌的最小抑菌浓度为0.01％，对Alternaria alternaria f.sp.mali菌的最小抑菌浓度为0.1％。本发明采用茶皂素TS抑制Valsa mali菌、Botryosphaeria dothidea菌和Alternaria alternaria f.sp.mali菌起到了良好的效果，此外，茶皂素TS还可通过诱导几丁质酶和β‑1,3‑葡聚糖酶的活性来增强苹果叶片的抗病反应。

说明书

技术领域

本发明涉及苹果树真菌病害药物的制备，具体地，涉及一种茶皂素TS在制备防控苹果树真菌病害药物中的应用。

背景技术

次级代谢产物是植物体内一类非常重要的有机化合物，且在植物应对复杂环境中发挥重要作用。植物体内的次级代谢产物主要包括三大类，即酚类、萜类和含氮化合物。目前，诸多研究表明次级代谢产物在植物与生物、非生物因素之间的相互作用中发挥广泛作用，特别是在保护植物免受捕食者和微生物侵害方面。基于其在植物保护方面的特性，多种植物源的次级代谢产物已被开发成植物杀虫剂或杀菌剂。茶树是一种富含次级代谢产物的经济作物，且茶饮品也是因其富含茶多酚、儿茶素、氨基酸等次级代谢产物而被认为是有益健康的功能饮料。茶皂素(Tea Saponin,TS)是茶树中重要的次级代谢产物之一，广泛存在于山茶属植物的根、茎、叶、花和种子中。TS主要从山茶属的种子中提取，在实际生产中，从种子中提取山茶油后的副产品—油茶籽粕—是茶皂素TS提取的主要来源。茶皂素(TS)在抗菌性方面虽然应用广泛，但效果却因菌而异。例如0.1％浓度的TS对茶灰枯病菌(Pestalotiopsis theae)的抑制率为49.28％；0.737％浓度的TS对桃褐腐病菌(moniliniafructicola)的抑制率只有46.6％：10％的高TS浓度对茶轮斑病菌和茶白星病菌的抑制也只有74.58％和88.06％。

苹果是世界上种植最广泛的水果之一，因其优异的营养价值和独特的口感而广受欢迎。作为多年生木本植物，在苹果树体的生长过程中极易感染多种病原，包括真菌、细菌和病毒。其中，病原真菌Valsa mali诱导苹果腐烂病的发生，其病害症状主要发生在主干、枝条和果实，发生腐烂病的部位主要表现溃疡性伤口，影响树势和产量，严重的可导致树体死亡。病原真菌Botryosphaeria dothidea诱导苹果轮纹病的发生，病害症状主要发生在树干和果实，受感染的果实症状表现为柔软、凹陷的损伤，并有交替的棕褐色和棕色环，严重影响果实品质和商品价值。感染轮纹病的枝干表现溃疡、损伤坏死等症状，抑制树体生长，甚至导致树枝死亡。Alternaria alternaria f.sp.mali是斑点落叶病的主要致病因子，该病害的特点是在叶片上诱导形成小的圆形棕色或黑色坏死斑，并逐渐扩大，边缘呈棕紫色，该病害导致叶片光合作用减弱、甚至落叶，最终影响果实产量和品质。这三种病害是目前苹果生产栽培中危害最严重的三大病害，特别是在果实中直接产生病症的腐烂病和轮纹病，对苹果产量和品质造成严重影响，是抑制苹果产业绿色、健康发展的重要因素。

在当前苹果生产中，化学药剂依然是防控苹果真菌病害的主要药剂。然而，化学药剂的过度和长期使用不仅严重影响果实的食品安全，且对果园生态环境也产生巨大的破坏作用，间接的影响果实产量和品质。因此，环境友好型的植物源杀菌剂的开发和利用越来越受重视。鉴于茶皂素TS在抗真菌方面的功能，本研究针对在苹果生产中引起重要病害的Valsa mali菌或Botryosphaeria dothidea菌或Alternaria alternaria f.sp.mali菌，探究茶皂素TS在对上述三种病原真菌的体外和体内抑制作用。

发明内容

针对上述由Valsa mali菌、Botryosphaeria dothidea菌、Alternariaalternaria f.sp.mali菌诱导的苹果真菌病害少有使用植物源杀菌剂的问题，本发明提供了一种茶皂素TS在制备防控Valsa mali菌或Botryosphaeria dothidea菌或Alternariaalternaria f.sp.mali菌诱导苹果真菌病害的药物中的应用，单独使用茶皂素即可抑制上述真菌的生长并取得良好的效果。

为了实现上述目的，本发明提供一种茶皂素TS在制备防控Valsa mali菌或Botryosphaeria dothidea菌或Alternaria alternaria f.sp.mali菌诱导苹果真菌病害的药物中的应用。

具体地，所述茶皂素TS对Valsa mali菌的最小抑菌浓度为0.001％；和/或

所述茶皂素TS对Botryosphaeria dothidea菌的最小抑菌浓度为0.01％；和/或

所述茶皂素TS对Alternaria alternaria f.sp.mali菌的最小抑菌浓度为0.1％。

通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：

本发明采用茶皂素TS抑制Valsa mali菌、Botryosphaeria dothidea菌和Alternaria alternaria f.sp.mali菌起到了良好的效果。此外，茶皂素TS还可诱导增强苹果叶片本身的抗病反应。

附图说明

图1是茶皂素TS对Valsa mali菌体外试验结果；

图2是茶皂素TS对Botryosphaeria dothidea菌体外试验结果；

图3是茶皂素TS对Alternaria alternaria f.sp.mali菌体外试验结果；

图4是茶皂素TS对Valsa mali菌体内试验结果；

图5是茶皂素TS对Botryosphaeria dothidea菌体内试验结果；

图6是茶皂素TS对Alternaria alternaria f.sp.mali菌体内试验结果；

图7是用茶皂素TS处理苹果叶片时活性氧含量和酶活性的测定结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中，茶皂素TS购自上海源叶生物科技有限公司；苹果植株来自山东泰安的一家苗圃工厂。

Botryosphaeria dothidea菌以及Alternaria alternaria f.sp.mali菌于申请人实验室中长期保存，Valsa mali菌来自西北农林科技大学，三种菌均在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上在28℃恒温培养箱中培养。

所有数据均采用windows数据处理系统(DPS)统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)。平均分离度采用Duncan多重范围检验(P<0.05)。

实施例1茶皂素TS的体外抗真菌试验

以无菌蒸馏水为对照，测试系列浓度梯度的茶皂素TS对Valsa mali菌、Botryosphaeria dothidea菌和Alternaria alternaria f.sp.mali菌的菌丝生长抑制作用。从培养Valsa mali菌2天的培养基、培养Botryosphaeria dothidea菌5天的培养基和培养Alternaria alternaria f.sp.mali菌9天的培养基的菌丝边缘一周用接种环切下一个直径约为0.55cm的菌丝块，并将其放置在直径为9cm的PDA培养皿的中心。接种后在28℃下培养，观察实验组和对照组之间的差异。

抗真菌指数的计算如下：抑制率(％)＝(Da-Db)/(Da-0.55)*100，其中Da是添加了茶皂素TS的PDA培养基上菌斑生长的直径(cm)，Db是未添加茶皂素TS的PDA培养基的菌斑生长的半径(cm)。平均抑制率(％)是不同时间抑制率的平均值。结果如图1-图3所示。

如图1所示，在添加茶皂素TS的PDA平板上，Valsa mali菌的生长受到抑制。在对照PDA平板中，菌丝生长迅速，Valsa mali菌长满对照PDA板需要3天时间。当培养基中TS含量为0.0001％时，对苹果Valsa mali菌菌丝生长无明显抑制作用。当TS浓度大于0.001％时，Valsa mali菌的生长受到明显抑制。TS在0.001％、0.01％、0.05％时的抗真菌率分别为80.5％、90.0％、100％。

同样，如图2所示，在添加茶皂素TS的PDA培养板上，Botryosphaeria dothidea菌的生长也受到了抑制。在对照PDA培养基上，菌丝生长迅速，Botryosphaeria dothidea菌长满对照PDA培养基需要7天。当培养基中含有0.001％的TS时，Botryosphaeria dothidea菌的菌丝生长没有受到明显抑制。当TS浓度大于0.01％时，Botryosphaeria dothidea菌的生长受到明显抑制。TS在0.01％、0.03％、0.05％时的抗真菌率分别为55.9％、84.4％、96.5％。

相比之下，如图3所示，在对照PDA平板上，菌丝生长迅速，Alternaria alternariaf.sp.mali菌长满对照PDA板需要12天。当培养基中含有0.01％的TS时，Alternariaalternaria f.sp.mali菌的菌丝生长没有受到明显抑制，抑菌率仅为13.3％。当TS浓度在0.05％～1％范围内时，抑制率在31.9％～34.9％之间。

实施例2茶皂素TS的体内抗真菌试验

用不同浓度梯度的茶皂素TS进行体内抗真菌作用试验。选择一年生枝条上完全展开的叶子，用无菌水清洗并风干。用无菌棉蘸无菌水包裹叶柄基部，以备后期使用。在将一系列浓度的茶皂素TS喷洒到叶片上并干燥后，用接种针在主叶脉两侧人为戳一小伤口。将直径为0.55cm的菌块覆盖在叶片伤口上。人工伤口的目的是促进病原真菌的侵染。

对照叶片(CK)用无菌蒸馏水处理。叶片在28℃下贮藏。叶片感染后，根据坏死病变面积与总叶面积的比例，将病害等级分类如下：I级，<1％；II级，1-10％；III级，11-25％；IV级，26-40％；V级，41-65％；VI级，>66％。体内抗真菌活性结果如图4-图6所示。

如图4所示，与体外抗真菌实验结果一致，TS能显著抑制Valsa mali菌对叶片的侵染。接种Valsa mali菌后，喷洒无菌水的苹果离体叶片坏死严重。相比之下，低浓度0.1％的TS即可显著减少叶片感染面积，降低病害等级。此外，随着TS浓度的增加，感染面积和疾病等级均减小。5％浓度的TS可大大抑制疾病的发生，对照组的坏死面积比5％TS处理组大8倍，5％TS处理的叶片病害等级为轻度Ⅱ级。

此外，病原体感染导致活性氧氧化迸发，引起超敏反应，进而导致广泛的细胞坏死。H

如图5所示，接种Botryosphaeria dothidea菌后第6天，对照中的叶片出现严重损伤，占总叶面积的35％-42％。TS处理显著减少了接种Botryosphaeria dothidea菌的苹果叶片的损伤面积。随着TS浓度的增加，坏死面积变小，5％TS处理的坏死面积仅为对照组的3％。对照组叶片的病害等级为IV级或以上，而5％TS处理的叶片的病害级别低于II级。

TS处理后，过氧化氢和超氧阴离子等活性氧物质的含量显著降低，避免了ROS爆发引起的细胞死亡。不仅如此，随着TS浓度的增加，几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性显著增加。

如图6所示，与对照组相比，喷施5％浓度的TS后，叶片坏死面积为对照组的50％。尽管施用了5％的TS，但疾病等级仍进展到III级。活性氧含量虽然随着TS浓度的增加而降低，但变化范围很小。但是，在Alternaria alternaria f.sp.mali菌存在的情况下，TS仍可诱导几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性，表明TS处理仍在一定程度上提高了叶片的防御反应。

实施例3活性氧含量和酶活性的测定

使用过氧化氢(H

为了确定TS对苹果叶片的影响，在不接种病原菌的情况下，用0％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％浓度的TS喷洒苹果离体叶片，测试了TS对活性氧含量和防御酶活性的影响，结果如图7所示。结果表明，由于苹果的离体叶片没有被病原菌感染，因此其体内活性氧的含量没有激增。但在一系列浓度下喷洒TS后，离体苹果叶片中活性氧的含量仍然随着TS浓度的增加而降低，这可能是由于TS的抗氧化特性的影响。此外，几丁质酶和葡聚糖酶的活性随着TS浓度的增加而显著增加，进一步证明TS能诱导苹果树本身几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，进而增强苹果树本身的抗病反应。

以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。