一种递送核酸药物的新型脂质纳米粒以及制备方法

摘要

本发明提出了一种递送核酸药物的新型脂质纳米粒以及制备方法，脂质纳米粒包含：1mg siRNA、3.5 mg聚山梨酸酯、75 mg氢化饱和大豆磷脂、15mg阳离子磷脂、6.7mg胆固醇、1.3mg胆固醇硫酸脂钠、15mg蔗糖、0.315mg DSPE‑PEG2000、3.125 mg磷酸二氢钠二水合物、4.25 mg磷酸氢二钠十二水合物、2.6mg维生素E、2ml份注射用水。本新型脂质纳米粒通过调节阳离子脂质成分、普通脂质成分的配比，提升其转染效率；本新型脂质纳米粒具备长循环隐身特性，通过调整培化脂质成分与其他磷脂成分的配比，达成在静脉内长循环，不易被体内免疫细胞捕获，具备体内半衰期延长的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药技术领域，尤其涉及一种递送核酸药物的新型脂质纳米粒以及制备方法。

背景技术

RNA 干扰技术（ RNA interference , RNAi ）近年来发展迅速，在多种疾病的治疗中都得到应用，其中就包括癌症治疗上的应用。与现有肿瘤治疗技术中的小分子靶向药物相比，基于 RNA 干扰技术的靶基因 siRNA 对靶点的选择性会更好，能够特异性结合靶基因并下调靶基因表达，且不会影响细胞中其它正常基因的表达，毒副作用小；运用在肿瘤治疗中，就可以通过 siRNA 特异性下调促进肿瘤发生、进展的基因表达，从而达到治疗的目的。

但现有的 RNAi 技术在临床转化时存在明显缺陷，即缺少低毒高效的载体将siRNA 输送病灶部位和细胞内。对于基于 RNAi 技术的癌症治疗，siRNA 在输送过程需要克服一系列生理屏障，例如如何靶向肿瘤细胞、穿透肿瘤组织和细胞膜、从内涵体高效逃逸以及在细胞质内有效释放 siRNA 等：过程复杂、技术难度大、环节多，且成本高昂，并不稳定。虽然能通过传统的病毒载体传递 siRNA 克服各种生理屏障，但其存在制备困难、siRNA 容量小、靶向特异性差、正电荷过大免疫原性强等缺陷，且因其对宿主细胞基因组造成不可逆改变，因而具有极大的生物风险，难以向临床转化实现实际应用。此外，现有技术中往往是利用单一的 siRNA 沉默某个促进肿瘤的表达基因来达到治疗目的，但肿瘤的发生和进展往往是多种基因协同促进。

业界对siRNA核酸类药物基因治疗所使用的安全而有效的基因转移技术进行研究已经有很长时间，并由此研制了各种基因转移工具和基因输送系统。特别是已经研制了基于腺病毒和逆转录酶病毒的载体以及用脂质体、阳离子脂质和阳离子聚合物的非病毒载体作为基因转移工具。然而，将病毒用作使治疗基因转移到靶细胞内的工具时，会产生如下重要问题：细胞毒性和转染效率低等问题，其中纳米粒载体的脂质配比组成、阳离子电荷是重要参数。

同时，纳米脂质体由具有亲水部分和疏水部分的分子以特定的比例在水溶液环境中通过自组装而自发形成以达到最大的热力学稳定性。脂质体内部是疏水的，因此容易捕获水不溶性药物，而胶东表面是亲水的，因此胶东系统促进了水不浴性药物和药物渝送载体等的增行作用。由于纳米脂质体具有尺寸很小、尺寸分布十分均匀以及自缔合结构的特点，因而利于药物制备的质量控制和再现性，所以比其他药物输送系统例如微球体或纳米粒于更具吸引力。

用于生物体的药物输送脂质纳米粒应当是生物相容的。这些生物相容聚合物的代表性例是磷脂、胆固醇以及衍生物等，也就是脂质体的最主要成分 。由美国食品药品监督管理局（FDA）获准体内使用的 磷脂、胆固醇以及衍生物等 已经在蛋白特性改善、聚合物表面修饰和基因输送的广泛应用中长期使用。作为最广泛使用的生物相容聚合物之一的合成磷脂具有极好的水溶性、低毒性和免疫原性。

除脂质体载体的因素外，对于小干扰核酸药物来讲针对单一的某个基因进行沉默或仅杀伤肿瘤可能效果并不明显。比如，泛素化在蛋白质降解、信号传导和细胞稳态等多种生物功能中发挥着重要作用。越来越多的证据表明，泛素化在癌症进展中是必不可少的。泛素结合酶E2S（UBE2S）是泛素化过程中的重要E2酶，在各种恶性肿瘤中表现出致癌活性。

肿瘤的发生发展多与抑癌因子和肿瘤蛋白间的平衡被破坏有关，这一异常与泛素化途径紧密相连。泛素化是指包括泛素分子、泛素活化酶、泛素结合酶、泛素连接酶及蛋白酶体在内的多步级联的蛋白质修饰过程，对于细胞更新胞内蛋白、清除衰老蛋白具有重要意义，是维持真核细胞内稳态的重要机制。泛素结合酶E2是泛素－蛋白酶体系统中不可或缺的部分，可以与泛素激活酶（E1）和泛素连接酶（E3）协同作用，催化泛素与目标蛋白的共价连接，促进体内蛋白的降解。生物体中存在多种E2，它们以各种方式结合泛素及其类似物（UBLS），形成不同的 UB-E2 复合体，并参与多种生理功能。如：

1）子宫内膜癌：

泛素结合酶E2S（UBE2S）的失调有助于肿瘤进展。然而，其在子宫内膜癌（EMC）中的临床意义和生物学功能尚不清楚。表明UBE2S在EMC中上调，并通过激活SOX6 /β-Catenin信号而表现出致癌活性。UBE2S的高表达与两个独立队列的预后不良显著相关，这两组队列共包含 773 名EMC患者。体外研究表明，UBE2S的异位表达促进细胞增殖和迁移，而UBE2S的高低导致相反的表型。UBE2S在EMC细胞中的过表达增强了β-连环蛋白的核易位，随后诱导c-Myc和Cyclin D1的表达。XAV-939对β-连环蛋白的抑制显著减弱UBE2S促进的细胞生长。UBE2S抑制SOX6的表达以触发β-Catenin信号传导。SOX6在表达UBE2S的EMC细胞中的再表达消除了β-连环蛋白的核定位。总的来说，这些数据表明UBE2S可能是一个有希望的预后因素，并作为EMc中的癌基因发挥作用。

2）膀胱癌；

泛素结合酶E2S（UBE2S）是泛素化过程中的重要E2酶，在各种恶性肿瘤中表现出致癌活性。然而，UBE2S是否在膀胱癌（UBC）发展中起作用仍然未知。在目前的研究中，证实UBE2S在UBC中的上调。在体外和体内实验表明，UBE2S敲低导致细胞凋亡，这与UBE2S过表达的表型相反。功能的获得和丧失测定证实，UBE2S通过介导雷帕霉素复合物1（mTORC1）途径的哺乳动物靶标的激活，在UBC中发挥致癌活性。此外，发现这种UBE2S调节的致癌机制是直接靶向结节性硬化症1（TSC1）的结果，TSC1是mTOR信号传导的上游抑制剂，用于无处不在的降解。综上所述，这项研究表明UBE2S是UBC中的致癌物，并通过普遍降解TSC1来促进UBC的进展。因此，这介导了mTOR途径的激活，通过靶向新发现的UBE2S / TSC1 / mTOR轴，提示UBC的潜在治疗方案。

3）肝细胞癌；

泛素偶联酶E2S（UBE2S）在人类癌症的进展中起着关键作用。然而，其在肝细胞癌（HCC）中的临床意义和作用仍然未知。表明UBE2S在HCC中上调，并通过增强p53的泛素化表现出致癌活性。在两个包含845名HCC患者的独立队列中，UBE2S的表达增加与较高的血清AFP水平，较高的病理分级，晚期TNM分期，更大的肿瘤大小，血管侵袭和不利的患者生存率显著相关。Cox回归模型的多变量分析表明UBE2S是总生存期的独立因素。体外实验表明，UBE2S过表达促进，而UBE2S敲低通过调节p53信号通路抑制细胞增殖和迁移。UBE2S的异位表达上调了p53及其下游效应子的表达，如p21和Cyclin D1。从机制上讲，UBE2S增强了p53蛋白的泛素化，以促进其在HCC细胞中的降解。p53的重新表达部分减弱了UBE2S促进的恶性表型。此项研究提供了令人信服的证据，证明UBE2S是一种潜在的预后因素，并作为HCC的癌基因起作用。

4）肺癌；

泛素偶联酶E2S（UBE2S）是泛素化过程中的E2蛋白家族，参与各种癌症的发展。然而，它在肺腺癌中的作用，尚未得到很好的阐明。研究UBE2S在肺腺癌中的表达和功能。在人类癌症组织和肺腺癌细胞中观察到UBE2S在mRNA和蛋白质水平上的上调。较高的UBE2S表达与肺腺癌患者的预后较差相关。UBE2S在A549细胞中的表达被慢病毒介导的shRNA策略有效抑制，UBE2S沉默导致细胞增殖减少，集落形成和凋亡增强。在UBE2S过度表达的H1299细胞中观察到相反的结果。微阵列分析表明，大量基因受到UBE2S的调控，p53信号通路可能对UBE2S在癌症发展中的作用至关重要。总之，UBE2S可能是肺腺癌的潜在靶标。

5）胶质母细胞瘤

胶质母细胞瘤是全球最常见和致命的脑癌。临床上，这种癌症具有异质性分子和临床特征。研究表明，UBE2S在许多癌症中高度表达。但其在胶质瘤中的表达谱以及与临床结果的相关性尚不清楚。研究神经胶质瘤样本的RNA测序数据从中国胶质瘤基因组图谱和癌症基因组图谱中下载。共使用114例胶质瘤组织样本（WHO II-Ⅳ级）进行蛋白表达测定。分析了UBE2S的分子生物学特性及其预后价值。结果表明，高UBE2S表达与更高级别的胶质瘤和PTEN突变有关。此外，UBE2S影响了胶质瘤的恶性程度和放化疗耐药性的发展。它还被发现是LGG患者生存率更差的独立预测因子。此外，还确定了五个UBE2S泛素化位点，发现UBE2S与恶性胶质母细胞瘤中的Akt磷酸化有关。结果还显示，UBE2S表达与1p19q缺失和IDH1突变呈负相关；与表皮生长因子受体扩增和PTEN突变呈正相关。研究表明，UBE2S表达与胶质瘤恶性肿瘤和对放化疗的耐药性密切相关。它也是预后不良的关键生物标志物。

综上所述，UBE2S与子宫内膜癌、膀胱癌、肝细胞癌、肺癌、胶质母细胞瘤存在密切的关系，通过多种途径影响癌症的发生发展。UBE2S可作为这些癌症的临床诊断潜在的新的生物标志物及新的治疗靶点。

siRNA 是 RNA 干扰（ RNA interference , RNAi ）途径的中间产物，也是 RNAi发挥作用的效应分子。自 RNA 干扰技术发现以来， RNAi 已经成为细胞遗传的关键调节器和阐明机体生长、发病机理和衰老的有力工具。是否能有效地将 siRNA 递送到靶细胞部位，与目标 mRNA 结合，成为限制 si RNA 的应用的关键因素。此外，当 siRNA 被细胞摄取后，被递送到溶酶体中被溶酶体降解，极大地减弱了 siRNA 的治疗活性。因此提高 siRNA递送的稳定性也十分重要。只有有效的细胞摄取和内吞活动以及保持双链 siR NA 的完整性才能使 siRNA 最终发挥治疗效果。 siRNA 自身的理化性质如电负性，分子量大，体积大等特点使得它不能通过被动扩散通过阴性的细胞膜。因此，基因治疗的关键在于寻找到需要修饰或者抑制的目的基因和拥有理想的载体。

非病毒载体安全性高，并且易于大量获得，因此在基因治疗中比病毒性载体更受到广大研究者的青睐。非病毒载体在体内穿过血液屏障转运至靶细胞，与靶细胞特异性地结合，进入细胞质，释放出 siRNA ，需克服多重障碍，因此应用载体时既要有利于 siRNA的保护和摄取，使其在胞外较少被降解，又要在到达作用部位后，能高效地导入靶细胞，并在胞质中有效释放。在 siRNA 的传递中，最常使用的是阳离子载体，并且以脂质体和微粒居多。

最常用的阳离子脂质体为聚合物聚乙烯亚胶（ PEI )，在 siRNA 的非病毒载体研究出，但是全阳离子脂质体正电荷过强带来的细胞内毒性，导致过敏、超敏反应，是注射用核酸脂质体主要的临床使用弊端。基于上述原因和已有阳离子脂质体的弊端，因此创新性的开发出了一种新型阳离子脂质配比的新型脂质体。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种递送核酸药物的新型脂质纳米粒以及制备方法。

本发明提供一种递送核酸药物的新型脂质纳米粒包含以下重量份原料：0.5mg-5mg siRNA、1-5 mg聚山梨酸酯、70-80mg氢化饱和大豆磷脂、10-20mg阳离子磷脂、5-8mg胆固醇、1-2mg胆固醇硫酸脂钠、10-20mg蔗糖、0.1-0.5mg DSPE-PEG2000、2-4mg磷酸二氢钠二水合物、2-5 mg磷酸氢二钠十二水合物、1-5mg维生素E、2ml注射用水。

优选的，所述的递送核酸药物的新型脂质纳米粒包含以下重量份原料：1mg-3mgsiRNA2-4 mg份聚山梨酸酯、73-78mg氢化饱和大豆磷脂、12-18mg阳离子磷脂、6-7mg胆固醇、1.2-1.8mg胆固醇硫酸脂钠、13-16mg蔗糖、0.2-0.4mg DSPE-PEG2000、3-3.5mg磷酸二氢钠二水合物、4-4.5 mg磷酸氢二钠十二水合物、3-4mg维生素E、2ml注射用水。

最优选的，所述的递送核酸药物的新型脂质纳米粒包含以下重量份原料：1mgsiRNA、3.5 mg聚山梨酸酯、75 mg氢化饱和大豆磷脂、15mg阳离子磷脂、6.7mg胆固醇、1.3mg胆固醇硫酸脂钠、15mg蔗糖、0.315mg DSPE-PEG2000、3.125 mg磷酸二氢钠二水合物、4.25mg磷酸氢二钠十二水合物、2.6mg维生素E、2ml注射用水。

一种递送核酸药物的新型脂质纳米粒的制备方法：包含用高压均质机高压、微射流工艺制备，或用旋蒸制膜法制备脂质体，或采用微流控芯片技术制得脂质体；将制备的粒径分布较为广泛的脂质体，再次通过高压挤出仪，制备得到形态圆整，粒径分布在75-120nm均一的脂质体。

本发明具有如下有益效果：本新型脂质纳米粒通过调节阳离子脂质成分、普通脂质成分的配比，可显著提升其转染效率；同时，适中的阳离子脂质成分，既降低了全阳离子脂质体正电荷过强带来的细胞内毒性，又保证了向细胞内转染效率。

本新型脂质纳米粒具备长循环隐身特性，通过调整培化脂质成分与其他磷脂成分的配比，可以达成在静脉内长循环。不易被体内免疫细胞捕获，具备体内半衰期延长的特点。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

实施例1-6：本实施例1-6的递送核酸药物的新型脂质纳米粒采用同一制备工艺，不同重量份原料分别制备：具体配比下表1和下表2，主要试剂：HSPC100大豆磷脂（德国lipoid）、阳离子脂质Cholesterol-SO4Na（日油株式会社）、DMG-PEG2000 （日本日油株式会社）、siRNA 合成（上海仪方生物科技有限公司）。

表1

表2

本实施例1-6的递送核酸药物的新型脂质纳米粒采用高压均质机进行制备，具体制备工艺如下：

1.将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于0.1％焦碳酸二乙酯（ DEPC ）溶液中浸泡24h，均质机、搅拌器等均以同法操作以去除 RNA 酶；将 DEPC 水重悬 siRNA ，得至溶解的 siRNA 溶液；称量磷脂溶于乙醇中，配置为磷脂乙醇溶液溶液，备用。

2.将75%体积的注射用水填充到制备容器中。通过引入氮气对其进行脱气并升温至30至35℃的温度。将蔗糖、水合磷酸二氢钠、水合磷酸氢二钠和一起加入大约 15%的注射用水中冲洗。搅拌混合物直至获得视觉上澄清的溶液。将溶液冷却至10至15°C并加入步骤1制备的磷脂乙醇并搅拌直至获得均匀分散体。

3.将已溶解的 siRNA 溶液加入到混合好的脂质乙醇初乳中，形成油水相，均质机以5000rpm的转速持续震荡搅拌10min形成乳白色油包水乳液。

4.在冷却水保护条件下（5-10℃）以高压或者微射流均质机分别在300bar、600bar、1200bar分别均质2遍，得到含SiRNA的纳米脂质体。

5.根据上述步骤制备的脂质体混悬液在无菌灭菌后使用填充/储存罐和填充针之间的 2 个孔径为 0.2 μm 的无菌过滤器。

6.分装为2ml/瓶的注射液；

7.或者将步骤6制备的注射液以真空冷冻干燥，用灭菌的冻干塞将小瓶部分封闭并装入冻干机，并根据 预设48小时的冻干循环进行冻干。

8.完成冻干后，将小瓶自动完全塞入冻干室中。将小瓶卸下并用翻盖盖住。每个小瓶包含大约 128 mg 几乎白色、均匀、多孔的冻干饼，其中含有 1 mg 脂质体溶解形式的siRNa，最大残留水分为 1.87% (w/w)，保质期为 1 年。

9.环境灭菌，收集脂质体冻干粉末、轧盖、包装。

10.使用前以无菌注射用水或者0.9%氯化钠稀释后注射。

实施例7-9：分别通过高压均质机、微射流工艺制备，旋蒸制膜法，微流控芯片技术制备递送核酸药物的新型脂质纳米粒。

微射流工艺制备新型脂质纳米粒具体工艺如下：

1.将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于0.1％焦碳酸二乙酯（ DEPC ）溶液中浸泡24h，均质机、搅拌器等均以同法操作以去除 RNA 酶；将 DEPC 水重悬 siRNA ，得至溶解的 siRNA 溶液；称量磷脂溶于乙醇中，配置为磷脂乙醇溶液溶液，备用。

2.将75%体积的注射用水填充到制备容器中。通过引入氮气对其进行脱气并升温至30至35℃的温度。将蔗糖、水合磷酸二氢钠、水合磷酸氢二钠和一起加入大约 15%的注射用水中冲洗。搅拌混合物直至获得视觉上澄清的溶液。将溶液冷却至10至15°C并加入步骤1制备的磷脂乙醇并搅拌直至获得均匀分散体。

3.将已溶解的 siRNA 溶液加入到混合好的脂质乙醇初乳中，形成油水相，均质机以5000rpm的转速持续震荡搅拌10min形成乳白色油包水乳液。

4.在冷却水保护条件下（5-10℃）以微射流均质机制备分别在300bar、600bar、1200bar分别均质2遍，得到含SiRNA的纳米脂质体。

5.根据上述步骤制备的脂质体混悬液在无菌灭菌后使用填充/储存罐和填充针之间的 2 个孔径为 0.2 μm 的无菌过滤器。

6.分装为2ml/瓶的注射液；

7.或者将步骤6制备的注射液以真空冷冻干燥，用灭菌的冻干塞将小瓶部分封闭并装入冻干机，并根据 预设48小时的冻干循环进行冻干。

8.完成冻干后，将小瓶自动完全塞入冻干室中。将小瓶卸下并用翻盖盖住。每个小瓶包含大约 128 mg 几乎白色、均匀、多孔的冻干饼，其中含有 1 mg 脂质体溶解形式的siRNa，最大残留水分为 1.87% (w/w)，保质期为 1 年。

9.环境灭菌，收集脂质体冻干粉末、轧盖、包装。

10.使用前以无菌注射用水或者0.9%氯化钠稀释后注射。

旋蒸做膜水化法制备脂质体具体工艺如下：

1将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质复为0.1％焦碳酸二乙酯（ DEPC ）溶液中浸泡24h，均质机、搅拌器等均以同法操作以去除 RNA 酶；将DEPC 水重悬 siRNA ，得至容解的 siRNA 溶液；称量磷脂溶于乙醇中，配置为磷脂乙醇溶液溶液，备用。

2.制备脂质体干膜：将处方量阳离子脂质、胆固醇、胆固醇硫酸脂钠、大豆磷脂HSPC-100、DMG-PEG2000、维生素E（α-生育酚），一起溶解在4.5倍重量的无水乙醇中。在旋蒸仪中，35℃减压干燥 9小时，得到疏松、多孔的海绵状干膜（乙醇残留量小于0.3%）

3.将75%的注射用水填充到制备容器中。通过引入氮气对其进行脱气并升温至30至35℃的温度。将处方量蔗糖、水合磷酸二氢钠、水合磷酸氢二钠和36.0g一起加入大约10%的注射用水用于冲洗。搅拌混合物直至获得视觉上澄清的溶液。将溶液冷却至20至25°C并加入到1.1.1制的的干膜中，充分浸润水化（真空度-0.15bar，减压6小时），形成并搅拌初步获得均匀分散体。

4.将已溶解的 SiRNA 溶液加入到混合好的脂质乙醇初乳中中，形成油水相，均质机以5000rpm的转速持续震荡搅拌10min形成乳白色油包水乳液。

5.在冷却水保护条件下（5-10℃）以高压或者微射流均质机分别在300bar、600bar、1200bar分别均质2遍，得到含SiRNA的纳米脂质体。

6.根据上述步骤制备的脂质体混悬液在无菌灭菌后使用填充/储存罐和填充针之间的 2 个孔径为 0.2 μm 的无菌过滤器。

7.分装为2ml/瓶的注射液；

8.或者将6制备的注射液以真空冷冻干燥，用灭菌的冻干塞将小瓶部分封闭并装入冻干机，并根据 预设48小时的冻干循环进行冻干。

9. 完成冻干后，将小瓶自动完全塞入冻干室中。将小瓶卸下并用翻盖盖住。每个小瓶包含大约 128 mg 几乎白色、均匀、多孔的冻干饼，其中含有 1 mg 脂质体溶解形式的siRNA，最大残留水分为 1.87% (w/w)，保质期为 1 年。

10.环境灭菌，收集脂质体冻干粉末、轧盖、包装。

11.使用前以无菌注射用水或者0.9%氯化钠稀释后注射。

微流控芯片法制备脂质体具体工艺如下：

1.将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质复为0.1％焦碳酸二乙酯（ DEPC ）溶液中浸泡24h，均质机、搅拌器等均以同法操作以去除 RNA 酶；将DEPC 水重悬 siRNA ，得至容解的 siRNA 溶液；称量磷脂溶于乙醇中，配置为磷脂乙醇溶液溶液，备用。

2.将75%体积的注射用水填充到制备容器中。通过引入氮气对其进行脱气并升温至30至35℃的温度。将1处方量蔗糖、水合磷酸二氢钠、水合磷酸氢二钠和一起加入大约15%的注射用水中冲洗。搅拌混合物直至获得视觉上澄清的溶液。将溶液冷却至10至15°C备用。

3.分别将油相和水相分别以微流控芯片的两路，按照1:3的流速比例进行混合，设置固定的混合参数，制备脂质体。

4.根据上述步骤制备的脂质体混悬液在无菌灭菌后使用填充/储存罐和填充针之间的 2 个孔径为 0.2 μm 的无菌过滤器。

5.分装为2ml/瓶的注射液；

6.或者将步骤5制备的注射液以真空冷冻干燥，用灭菌的冻干塞将小瓶部分封闭并装入冻干机，并根据 预设48小时的冻干循环进行冻干。

7.完成冻干后，将小瓶自动完全塞入冻干室中。将小瓶卸下并用翻盖盖住。每个小瓶包含大约 128 mg 几乎白色、均匀、多孔的冻干饼，其中含有 1 mg 脂质体溶解形式的siRNA，最大残留水分为 1.87% (w/w)，保质期为 1 年。

8.环境灭菌，收集脂质体冻干粉末、轧盖、包装。

9.使用前以无菌注射用水或者0.9%氯化钠稀释后注射。

实施例7-9的原料配比见表3

表3

将上述不同配方、工艺制备的各项下实施例制备得到的siRNA 纳米颗粒的粗溶液将粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃的 PBS 溶液透析去多余的未包载的药物及副产物、粒径较大或者较小的，获得包封率较高的siRNA 脂质体纳米颗粒。将上述不同实施例制备的纳米溶液转移至超滤膜中，6000rpm离心15min，分离纳米粒子，使用去离子水洗涤两次后收集纳米粒子并将其分散至 PBS 缓冲溶液备用。随后将纳米溶液转移至超滤膜中，离心分离纳米粒子，使用去离子水洗涤两次后，收集纳米粒子并将其分散到ImL pH6.0 PBS 缓冲溶液中备用。使用Nano -ZSZEN3600型粒径仪测定纳米粒子的尺寸、以及ZETA电位。

数据如下4所示：

表4

通过上表数据进行分析：

依据公开文献显示：ZETA处于： + 12-+15 mV表面电位的脂质体血液保留时间长；而大于+ 25 mV脂质体清除率较快。因此不加PEG化磷脂的对比例3预计很快即从血液中代谢，而加入了PEG化磷脂的实施例4-6预计半衰期显著延长，且： DMG -PEG2000培化磷脂占比在0.29-0.36%为最佳组成（脂质比例）。

依据公开文献显示：ZETA＞60mV表面电位的阳离子脂质体会较高比率转载到细胞内，但是毒性较大；ZETA＜4.5mV表面电位的阳离子脂质体比较难以转载药物到细胞内。

因此加入较低、较多用量的阳离子脂质成分的对比例1、对比例2预计转染效果差或者细胞毒性较大，而加入了阳离子磷脂DLin-MC3-DMA的实施例1-3转染效果预计良好，且毒性不大；其最佳配比在11-17%（脂质比例）。

同一原料配比，用3种不同制造工艺制备，电荷差距不明显，说明脂质处方配比起决定因素。

不同阳离子脂质体用量、不同培化脂质用量，导致电荷差异，产生不同电荷、不同粒径，进而电位、转染效率产生差异。

本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。