一种血清蛋白在新型冠状病毒肺炎筛查和诊断中的应用

摘要

本公开涉及基于PLGLB1蛋白进行新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统和方法、检测PLGLB1蛋白的物料在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中的用途、检测PLGLB1蛋白的装置在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统中的用途、稳定同位素标记的肽段在制备基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中的用途。本公开首次发现，PLGLB1蛋白可作为新型冠状病毒肺炎患者的全病程血清诊断标志物，且具有更高的检测灵敏度和稳定性。

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请要求对2021年8月11日提交的中国专利申请号202110921349.9的优先权，其全部内容通过这些参考文献并入本文，用于所有目的。

技术领域

本公开涉及生物医学领域，具体地，涉及基于PLGLB1蛋白进行新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统和方法、检测PLGLB1蛋白的物料在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中的用途、检测PLGLB1蛋白的装置在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统中的用途、稳定同位素标记的肽段在制备基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中的用途。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是一种由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引发的传染病，世界卫生组织于2020年3月11日宣布其为大流行病。目前新型冠状病毒肺炎已成为的全球性威胁。

检测COVID-19患者对于控制流行病非常重要。当前临床诊断COVID-19主要基于病原学检测和血清学检查，其中病原学检查采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法在鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便、尿液等标本中检测新型冠状病毒核酸，但是不正确的采样操作、样品采集区域或采集时间的病毒载量低、运输过程不规范以及病毒突变通常会导致假阴性结果。而血清学检查是对新型冠状病毒特异性IgM抗体、IgG抗体的检测，但发病1周内阳性率均较低，且会因体内存在干扰物质或者标本原因而导致假阳性结果。因此仍然迫切需要新的COVID-19检测方法。

发明内容

本公开的目的是提供一种新的COVID-19检测方法。

本公开的发明人通过基于质谱的大规模比较蛋白质组学技术，在COVID-19患者的血清样本中发现了一个高度灵敏和高度特异的生物标志物，即PLGLB1蛋白，由此得到了本公开的技术方案。

第一方面，本公开提供了一种基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统，该系统包括检测PLGLB1蛋白的装置，所述检测PLGLB1蛋白的装置包括质谱，所述质谱配置为能够使用串联质谱标签(Tandemmass tagging，TMT)方法和/或靶向定量方法进行蛋白质定性和定量检测的质谱。

可选地，其中，该系统还包括计算装置、用于输入PLGLB1蛋白的表达量的输入装置和用于输出正常人和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者的判别的输出装置；其中，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：若不具有发热和/或咳嗽症状的待测人的血液的样本中PLGLB1蛋白的相对含量大于或等于0.67，则判定该不具有发热/咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；和/或，若具有发热和/或咳嗽症状的待测人血清中PLGLB1蛋白的相对含量大于等于0.77，则判定该有发热和/或咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；其中，所述相对含量的定义为PLGLB1蛋白在某样本中的丰度除以该蛋白的平均丰度后所得到的比值；所述平均丰度是指串联质谱标签(Tandem masstagging，TMT)方法混合样品中的丰度。

第二方面，本公开提供了一种基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的方法，该方法包括如下步骤：S1、获取待测人的血液的样本；S2、基于质谱，使用串联质谱标签(Tandem mass tagging，TMT)方法和/或靶向定量方法，所述靶向定量方法为平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring，PRM)、多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)或选择性反应检测(selective reaction monitoring，SRM)方法，对待测人的血液的样本中的PLGLB1蛋白进行蛋白质定性和定量检测；S3、进行以下判别：若不具有发热和/或咳嗽症状的待测人的血液的样本中PLGLB1蛋白的相对含量大于或等于0.67，则判定该不具有发热/咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；和/或，若具有发热和/或咳嗽症状的待测人血清中PLGLB1蛋白的相对含量大于等于0.77，则判定该有发热和/或咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；其中，所述相对含量的定义为PLGLB1蛋白在某样本中的丰度除以该蛋白的平均丰度后所得到的比值；所述平均丰度是指串联质谱标签(Tandem mass tagging，TMT)方法混合样品中的丰度。

第三方面，本公开提供了检测PLGLB1蛋白的物料在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中的用途。

可选地，其中，所述检测PLGLB1蛋白的物料是能够检测来自于人的血液的样本中的PLGLB1蛋白的物料；优选地，其中，所述试剂盒中含有胶体金试纸条、ELISA试剂、化学发光试剂中的至少一种，所述检测PLGLB1蛋白的物料为抗PLGLB1蛋白或肽段的抗体、特异性结合PLGLB1蛋白或肽段的核酸适配体、特异性结合PLGLB1蛋白或肽段的肽核酸、其它可特异性结合PLGLB1蛋白或肽段的物质、以及PLGLB1蛋白或肽段标准品中的至少一种。

第四方面，本公开提供了检测PLGLB1蛋白的装置在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统中的用途。

可选地，所述检测PLGLB1蛋白的装置是能够定性和定量检测来自于人的血液的样本中的PLGLB1蛋白的装置。如质谱、分光光度计、化学发光仪等信号读取装置。

可选地，所述检测PLGLB1蛋白的装置包括质谱，所述质谱配置为能够使用TMT方法和/或PRM/MRM/SRM方法进行蛋白质定性和定量检测的质谱。

可选地，其中，所述PLGLB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，使用串联质谱标签(Tandem mass tagging，TMT)方法时，所检测的肽段为PLGLB1蛋白的肽段；使用PRM/MRM/SRM方法进行蛋白质定性和定量检测时，所检测的匹配肽段包括PLGLB1蛋白特有肽段，所述PLGLB1的蛋白特有肽段的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

第五方面，本公开提供了稳定同位素标记在制备基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中标准品肽段中的用途，其中，所述稳定同位素标记包括：精氨酸R带有C13标记和/或N15标记，和/或，赖氨酸K带有C13标记和/或N15标记；所述标准品肽段的氨基酸序列是PLGLB1蛋白的氨基酸序列的片段。

通过上述技术方案，本公开区分不具有发热和/或咳嗽症状的正常人与早期新型冠状病毒肺炎患者时，受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线分析结果表明曲线下面积(Area under roc curve,AUC)达到0.99，灵敏度为99％、特异度为100％；区分具有发热和/或咳嗽症状的患者与早期新型冠状病毒肺炎患者时，AUC达到0.99，灵敏度为99％、特异度为100％。

值得注意的是，在新型冠状病毒肺炎患者血清样本收集同一天进行的新型冠状病毒核酸检测中，有29.2％的患者是阴性(剔除出院前核酸连续转阴后的检测结果和采样当天没有进行核酸检测的)，而且在核酸检测连续转阴之前，大多数患者都有核酸检测结果时阴时阳、出现波动的情况，而PLGLB1蛋白在病程的多个阶段(包括急性期、进展期和恢复期)的血清样本中，均能保持极高的检测灵敏度。该结果表明，相对于新型冠状病毒核酸检测，PLGLB1蛋白对新型冠状病毒肺炎患者具有更高的检测灵敏度和稳定度。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1为正常组、发热/咳嗽患者组和早期新型冠状病毒肺炎患者组血清中PLGLB1蛋白相对定量水平散点图。

图2为正常组和早期新型冠状病毒肺炎患者组(A)以及发热/咳嗽患者组和早期新型冠状病毒肺炎患者组(B)血清中PLGLB1蛋白相对定量水平的ROC曲线分析结果。

图3为正常组、发热/咳嗽患者组和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者组血清中PLGLB1蛋白相对定量水平散点图。

图4为正常组和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者组(A)以及发热/咳嗽患者组和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者组(B)血清中PLGLB1蛋白相对定量水平的ROC曲线分析结果。

图5为SEQ ID NO:2所示肽段的标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

第一方面，本公开提供了一种基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统，该系统包括检测PLGLB1蛋白的装置，所述检测PLGLB1蛋白的装置包括质谱，所述质谱配置为能够使用串联质谱标签(Tandemmass tagging，TMT)方法和/或靶向定量方法进行蛋白质定性和定量检测的质谱。

本公开中，PLGLB1是指纤溶酶原样蛋白B(Plasminogen-like protein B,PLGLB1或PLGLB2，后面简称PLGLB1)，其NCBI GENE ID为5343，UniProt号码为Q02325，氨基酸序列为：

MEHKEVVLLLLLFLKSGQGEPLDDYVNTQGPSLFSVTKKQLGAGSREECAAKCEEDKEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDAVLFEK(SEQ ID NO:1)。

可选地，其中，该系统还包括计算装置、用于输入PLGLB1蛋白的表达量的输入装置和用于输出正常人和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者的判别的输出装置；其中，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：若不具有发热和/或咳嗽症状的待测人的血液的样本中PLGLB1蛋白的相对含量大于或等于0.67，则判定该不具有发热/咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；和/或，若具有发热和/或咳嗽症状的待测人血清中PLGLB1蛋白的相对含量大于等于0.77，则判定该有发热和/或咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；其中，所述相对含量的定义为PLGLB1蛋白在某样本中的丰度除以该蛋白的平均丰度后所得到的比值；所述平均丰度是指串联质谱标签(Tandem masstagging，TMT)方法混合样品中的丰度。

第二方面，本公开提供了一种基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的方法，该方法包括如下步骤：S1、获取待测人的血液的样本；S2、基于质谱，使用串联质谱标签(Tandem mass tagging，TMT)方法和/或靶向定量方法，所述靶向定量方法为平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring，PRM)、多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)或选择性反应检测(selective reaction monitoring，SRM)方法，对待测人的血液的样本中的PLGLB1蛋白进行蛋白质定性和定量检测；S3、进行以下判别：若不具有发热和/或咳嗽症状的待测人的血液的样本中PLGLB1蛋白的相对含量大于或等于0.67，则判定该不具有发热/咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；和/或，若具有发热和/或咳嗽症状的待测人血清中PLGLB1蛋白的相对含量大于等于0.77，则判定该有发热和/或咳嗽症状待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者；其中，所述相对含量的定义为PLGLB1蛋白在某样本中的丰度除以该蛋白的平均丰度后得到的比值；所述平均丰度是指串联质谱标签(Tandem mass tagging，TMT)方法混合样品中的丰度。

第三方面，本公开提供了检测PLGLB1蛋白的物料在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中的用途。

可选地，其中，所述检测PLGLB1蛋白的物料是能够检测来自于人的血液的样本中的PLGLB1蛋白的物料；优选地，其中，所述试剂盒中含有胶体金试纸条、ELISA试剂、化学发光试剂等中的至少一种，所述检测PLGLB1蛋白的物料为抗PLGLB1蛋白或肽段的抗体、特异性结合PLGLB1蛋白或肽段的核酸适配体、特异性结合PLGLB1蛋白或肽段的肽核酸、其它可特异性结合PLGLB1蛋白或肽段的物质、以及PLGLB1蛋白或肽段标准品中的至少一种。

第四方面，本公开提供了检测PLGLB1蛋白的装置在制备用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的系统中的用途。

可选地，所述检测PLGLB1蛋白的装置是能够定性和定量检测来自于人的血液的样本中的PLGLB1蛋白的装置。如质谱、分光光度计、化学发光仪等信号读取装置。

可选地，所述检测PLGLB1蛋白的装置包括质谱，所述质谱配置为能够使用串联质谱标签(Tandem mass tagging，TMT)方法和/或PRM/MRM/SRM方法进行蛋白质定性和定量检测的质谱。

可选地，其中，所述PLGLB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，使用串联质谱标签(Tandem mass tagging，TMT)方法时，所检测的肽段为PLGLB1蛋白的肽段；使用PRM/MRM/SRM方法进行蛋白质定性和定量检测时，所检测的匹配肽段包括PLGLB1蛋白特有肽段，所述PLGLB1的蛋白特有肽段的氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。PLGLB1蛋白的肽段具体可以为PLGLB1蛋白经过蛋白酶酶切后产生的肽段，所述蛋白酶包括胰蛋白酶和/或胃蛋白酶等。

本公开中，所述PLGLB1蛋白特有肽段的氨基酸序列为EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)或QLGAGSREECAAK(SEQ ID NO:3)。

第五方面，本公开提供了稳定同位素标记在制备基于质谱且用于新型冠状病毒肺炎筛查和诊断的试剂盒中标准品肽段中的用途，其中，所述稳定同位素标记包括：精氨酸R带有C13标记和/或N15标记，和/或，赖氨酸K带有C13标记和/或N15标记；所述标准品肽段的氨基酸序列是PLGLB1蛋白的氨基酸序列的片段。

以下，通过实施例进一步详细说明本公开的技术方案，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的名词解释：

受试者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲线反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标。分别计算各个试验的ROC曲线下的面积(AUC)进行比较，面积大者，试验的诊断价值大。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度100％。

实施例1

本实施例用于说明血清样本的采集。正常组：正常人(N)14例；发热/咳嗽患者组：有发热和/或咳嗽症状的非新型冠状病毒肺炎患者13例；新型冠状病毒肺炎患者组：新型冠状病毒肺炎患者79例(其中每位患者收集了疾病早期的血清样本共79份，加上不同病程阶段采集的所有血清样本共计181例)。

其中，正常人血清来自正常体检者；发热/咳嗽患者和新型冠状病毒肺炎患者均为临床确诊病人的血清样本，其中，发热是指体温高于37.5℃，新型冠状病毒肺炎的诊断标准参照国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(2020年试行第5版)》。

实施例2

本实施例用于说明血清样本的蛋白质组检测。

一、对上述血清样本进行TMT蛋白质组学检测：

1、蛋白质酶解：血清样本56℃灭菌30分钟后，每例样本取5μl加入到50μl裂解缓冲液(8M尿素，50mM Tris-Cl，pH 7.4)中，32℃变性30分钟。样品中加入10mM二硫苏糖醇于37℃下还原1小时，然后加入40mM碘乙酰胺于室温暗处避光烷基化30分钟。用50mM碳酸氢铵稀释4倍后，加入胰蛋白酶(Promega，蛋白质量的1/50)反应12小时，再次加入等量的胰蛋白酶反应4小时。肽段样本加入0.1％的三氟乙酸后，用自制的C18柱(Agela Technologies)进行脱盐并干燥。

2、TMT标记：每个样品中加入200μl 200mM TEAB溶解肽段，取出25ug肽段并用TMTpro 16plex标记试剂(Thermo Fisher Scientific)进行标记，所有样本等量混合的样本作为内标。每个TMT中所有样品合并后真空干燥。

3、液相色谱分离和质谱数据采集：高效液相色谱为L-3000HPLC(RIGOL)，色谱柱为XBridge Peptide BEH C18(5μm，25cm×4.6mm)(Waters)，TMT标记的肽段在乙腈和水(pH用氨水调节至10)的流动相中进行梯度分离(5％至35％乙腈，1ml/min的流速)。将分离的肽合并成40个组分并干燥。在2％乙腈/0.1％甲酸溶液中复溶样品，通过Q Exactive HF质谱仪(Thermo Fisher Scientific)和nano-HPLC色谱仪(UltiMate 3000LC)对其进行DDA模式的质谱分析。液质联用参数如下：流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为80％乙腈和0.1％甲酸的水溶液，液相梯度为42min(流动相B从4％到40％)，流速为700nl/min(分析柱1.9μm，

4、质谱数据分析：使用Proteome Discoverer软件(版本2.4.1.15，Thermo FisherScientific)对质谱原始数据进行搜库分析，所用数据库为人库(UniProtKB，2020年8月8日下载，包含20289个蛋白序列)和SARS-CoV-2病毒库(NCBI，NC_045512.2版)。搜库参数如下：母离子质量容差为20ppm；子离子质量容差为0.02Da；固定修饰为半胱氨酸的氨基甲酰甲基化；可变修饰为赖氨酸和肽段N末端的TMTpro，蛋氨酸的氧化和肽段N末端的乙酰化；最多允许两个漏切位点；蛋白质和肽段水平FDR为1％。将同一TMT批次中每个样品的蛋白质强度除以内标进行归一化。

5、用SPSS 16.0软件对疾病组和对照组间PLGLB1蛋白相对定量水平进行Mann-Whitney U test和ROC曲线分析。

二、对1例新型冠状病毒肺炎患者和1例正常人血清样本进行平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring，PRM)

1、蛋白质酶解：血清样本56℃灭菌30分钟后，每例样本取5μl加入到50μl裂解缓冲液(8M尿素，50mM Tris-Cl，pH 7.4)中，32℃变性30分钟。样品中加入10mM二硫苏糖醇于37℃下还原1小时，然后加入40mM碘乙酰胺于室温暗处避光烷基化30分钟。用50mM碳酸氢铵稀释4倍后，加入胰蛋白酶(Promega，蛋白质量的1/50)反应12小时，再次加入等量的胰蛋白酶反应4小时。肽段样本加入0.1％的三氟乙酸后，用自制的C18柱(Agela Technologies)进行脱盐并干燥。

2、PRM相对定量的质谱数据采集：取酶切后的肽段样本加入等量稳定同位素标记的标准品肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)和QLGAGSREECAAK(SEQ ID NO:3)(精氨酸R和赖氨酸K为C13N15标记的重标氨基酸)，通过Q Exactive HF质谱仪(Thermo FisherScientific)和nano-HPLC色谱仪(UltiMate 3000LC)对其进行PRM模式的质谱分析。

3、建立肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)的定量标准曲线：取等量上述正常人血清酶切后的肽段样本分别加入不同量的稳定同位素标记的标准品肽段EQQCVIMAENR(SEQ IDNO:2)，通过Q Exactive HF质谱仪(Thermo Fisher Scientific)和nano-HPLC色谱仪(UltiMate 3000LC)对其进行PRM模式的质谱分析。

4、质谱数据分析：使用Skyline软件(MacCoss Lab)对前述实验产出的质谱PRM原始数据进行分析，得到样本中肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)和QLGAGSREECAAK(SEQ IDNO:3)的定量丰度结果，以及肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)的标准曲线。

三、结果

TMT蛋白质组学鉴定到了PLGLB1蛋白的两个肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)和QLGAGSREECAAK(SEQ ID NO:3)，蛋白质水平分析结果显示14正常人血清中PLGLB1蛋白相对定量丰度的平均值±标准差为0.50±0.10，发热/咳嗽患者组为0.50±0.12，早期新型冠状病毒肺炎患者组为1.09±0.16，不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者组为1.13±0.18。对各组样本中PLGLB1蛋白相对丰度进行统计学分析(Mann-Whitney U test)，发现相比于正常组和发热/咳嗽患者组，血清PLGLB1蛋白在早期新型冠状病毒肺炎患者组和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者组中均显著上调(p<0.0001)(图1和图3)。

以正常组为对照组，早期新型冠状病毒肺炎患者组为疾病组，对血清中PLGLB1蛋白水平进行ROC曲线分析，判断早期新型冠状病毒肺炎患者的曲线下面积AUC＝0.99(如图2中A所示)，灵敏度为99％、特异度为100％，尤其值得注意的是，最容易与正常人混淆的无症状感染者也被全部正确判断；以发热/咳嗽患者组为对照组，早期新型冠状病毒肺炎患者组为疾病组，判断早期新型冠状病毒肺炎患者的AUC＝0.99(如图2中B所示)，灵敏度为99％、特异度为100％。

以正常组为对照组，不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者组为疾病组，对血清中PLGLB1蛋白水平进行ROC曲线分析，判断新型冠状病毒肺炎患者的曲线下面积AUC＝0.99(如图4中A所示)，灵敏度为99％、特异度为100％，尤其值得注意的是，最容易与正常人混淆的无症状感染者也被全部正确判断；以发热/咳嗽患者组为对照组，不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者组为疾病组，判断新型冠状病毒肺炎患者的AUC＝0.99(如图4中B所示)，灵敏度为98％、特异度为100％。

进行正常人和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者的判别时，若待测人血清中PLGLB1蛋白的相对含量大于等于0.67，则该待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者。进行发热/咳嗽患者和所有病程新型冠状病毒肺炎患者的判别时，若待测人血清中PLGLB1蛋白的相对含量大于等于0.77，则该待测人为或候选为新型冠状病毒肺炎患者。

上述判别所用的相对含量阈值为ROC曲线的最大约登指数对应的阈值，以正常人和不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者的判别诊断为例，约登指数及对应阈值详见表1。表1示出了不同病程阶段新型冠状病毒肺炎患者相对正常组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数。

表1

其中，在检测的181份来自不同病程的新型冠状病毒肺炎患者血清中，有52份在血清样本收集同一天进行了新型冠状病毒核酸检测，剔除在出院前核酸连续转阴后检测的样本28份，剩余的24份样本中仍有7份(29％)的新型冠状病毒核酸检测结果是阴性，而同期血清样本中PLGLB1蛋白的检测灵敏度为95.8％，特异度为100％。在核酸检测连续转阴之前，大多数患者都有核酸检测结果时阴时阳、出现波动的情况，而PLGLB1蛋白不管在病程哪个阶段的血清样本中，均能保持极高的检测灵敏度。该结果表明，相对于新型冠状病毒核酸检测，PLGLB1蛋白对新型冠状病毒肺炎患者具有更高的检测灵敏度和稳定度。

对PLGLB1蛋白在1例新型冠状病毒肺炎患者和1例正常人血清中进行PRM验证，肽段定量结果见表2。表2示出了PRM定量结果。结果表明PLGLB1在该例新型冠状病毒肺炎患者血清中丰度高于其在正常人血清中的丰度，表明TMT结果可靠，且该蛋白可通过PRM靶向检测方法进行检测。

表2

对上述两个肽段中信号强度最大的肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)，利用其稳定同位素标记的标准品肽段建立的定量标准曲线。以该肽段log2(质量)为横坐标、以log2(峰面积)为纵坐标建立的标准曲线如图5所示。将该肽段在1例新型冠状病毒肺炎患者和1例正常人血清中的PRM定量结果代入标准曲线，计算结果表明1例新型冠状病毒肺炎患者血清中肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)的浓度为0.64μg/ml，对应PLGLB1蛋白的浓度为0.47μmol/L；1例正常人血清中肽段EQQCVIMAENR(SEQ ID NO:2)的浓度为0.20μg/ml，对应PLGLB1蛋白的浓度为0.14μmol/L。

由上述结果可知，血清中PLGLB1蛋白可用作正常人与新型冠状病毒肺炎患者、以及发热/咳嗽患者与新型冠状病毒肺炎患者进行判别诊断的候选标志物，而且PLGLB1蛋白可作为新型冠状病毒肺炎患者的全病程血清诊断标志物，且相对新型冠状病毒核酸检测具有更好的灵敏度和稳定性。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。