公开/公告号CN115704818A
专利类型发明专利
公开/公告日2023-02-17
原文格式PDF
申请/专利权人 成都康弘生物科技有限公司;
申请/专利号CN202110926066.3
申请日2021-08-12
分类号G01N33/531;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/68;G01N33/569;
代理机构
代理人
地址 610036 四川省成都市蜀西路108号
入库时间 2023-06-19 18:35:48
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-02-17
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及生物蛋白的质量控制领域,具体涉及一种Protein A残留量检测样品处理及检测方法。
背景技术
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,分子量42KD,能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段。其可与样品中的抗体分子(人IgG
ELISA是目前应用最广泛的Protein A残留量检测方法。该方法相对简单,精良度好,方便设定控制范围和建立技术规范。目前已经有多种商品化的ELISA试剂盒可以用于Protein A残留量的检测,还可以通过自制多克隆抗体进行检测。虽然目前的检测方法给Protein A残留量的检测原理和方法提供了一种通行的指引,但是很少有人关注到检测样品处理对检测结果的影响。如因Protein A具有能够结合IgG分子的特点,从而阻碍其与相应检测抗体的结合,常常造成检测结果的不准确,因此检测样品的处理成为了Protein A质量控制的难点。
发明内容
本发明为了解决现有技术中Protein A残留量检测的缺陷,提供了一种回收率高、准确度和精密度好的Protein A残留量检测方法,包括:
1)将待测蛋白样品溶液经过还原处理;
2)通过ELISA对步骤1)所述的样品溶液进行Protein A残留量检测。
其中,还原所采用的还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或β-巯基乙醇,优选二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。
其中所述蛋白可以为本领域已知的包含抗体、蛋白或多肽产品,也可以是本领域技术人员根据已知的生物学方法进行构建以及通过CHO细胞生产获得的蛋白。优选的,所述蛋白含有Fc片段的融合蛋白,例如康柏西普或阿柏西普;在一个具体的实施例中,本发明所述的蛋白为康柏西普,具有如SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列。
在一些优选实施例中,本发明所述的蛋白样品溶液的浓度为0.1mg/ml-1.0mg/ml,优选0.2-0.5mg/ml。
在一个具体的实施方案中,本发明所述的检测方法,步骤2)中,首先用Protein A捕获抗体包被微孔板,然后将步骤1)中的待测样品溶液加入微孔板形成抗体-抗原复合物,再将生物素化的Protein A抗体加入抗体-抗原复合物中,形成抗体-抗原-生物素化的抗体复合物,然后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素,形成抗体-抗原-生物素化的抗体-辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素复合物,孵育后加入显色液进行显色,加入终止液终止反应,在450nm进行读数,通过Protein A标准曲线计算待测样品溶液中的Protein A含量。
在一个具体的实施方案中,显色液为3,3,5,5-四甲基联苯胺。
在一个具体的实施方案中,本发明所述的检测方法包括:
1)将浓度为0.2-0.5mg/ml的蛋白样品溶液加入二硫苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐进行还原处理;
2)首先用Protein A捕获抗体包被微孔板,然后将步骤1)中的待测样品溶液加入微孔板形成抗体-抗原复合物,再将生物素化的Protein A抗体加入抗体-抗原复合物中,形成抗体-抗原-生物素化的抗体复合物,然后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素,形成抗体-抗原-生物素化的抗体-辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素复合物,孵育后加入显色液进行显色,加入终止液终止反应,在450nm进行读数,通过Protein A标准曲线计算待测样品溶液中的Protein A含量。
本发明的技术效果在于通过大量的实验摸索提供了一种样品前处理简单、专属性强、准确度高、重复性好的Protein A残留量检测方法,对蛋白的质量控制具有重要意义。
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明,并不能用于限制本发明的保护范围。
本申请所用试剂及仪器:
Protein A ELISA kit(Enzo Life Sciences,Cat:ADI-900-057)
IdeS酶(Promega,Cat:V7511)
RapiGestSF(Waters,Cat:186008090)
二硫苏糖醇(GE,17-1318-01)
磷酸三钠(分析纯)
氯化钠(分析纯)
TritonX-100(Sigma,X100-100ml)仪器设备
酶标仪(Spectraxmaxi3X)
实施例1专属性实验
取康柏西普原液缓冲液(自制,不含康柏西普蛋白,辅料含有柠檬酸、蔗糖、精氨酸),采用Protein A ELISA kit试剂盒(Enzo Life Sciences)样品稀释液(Assay Buffer13)稀释3.3倍(按蛋白浓度10mg/ml进行稀释,记为样品1、2、3)及6.6倍(按蛋白浓度20mg/ml进行稀释,记为样品4、5、6),各做3个平行样品。然后按试剂盒操作步骤进行Protein A残留量检测,其中试剂盒操作步骤为:样品溶液于沸水中煮沸5min后室温冷却5~7min,13800g离心4min,取上清加入试剂盒酶标板(酶标板被Protein A抗体包被),100μl/孔,室温500rpm震荡孵育1h;洗板后加入生物素化的Protein A抗体(作为检测抗体)100μl/孔,室温500rpm震荡孵育1h;洗板后加入辣跟过氧化物酶标记的链酶亲和素100μl/孔,室温500rpm震荡孵育0.5h;洗板后加入TMB(3,3,5,5-四甲基联苯胺)显色液100μl/孔,室温500rpm震荡孵育15min后加终止液(盐酸溶液)100μl/孔,终止反应;450nm读数。根据标准曲线计算Protein A含量,结果如表1。
Protein A标准曲线制备:取Protein A标准品,用试剂盒稀释液(AssayBuffer13)稀释至1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml;然后按照上述试剂盒操作步骤,测定不同浓度下Protein A标准品在450nm的读数,并制定Protein A标准曲线。
表1
实验结果显示,康柏西普蛋白原液缓冲液不同浓度条件下的3个平行样品的检测结果均未检出Protein A,表明蛋白原液缓冲液对方法无明显干扰。
实施例2样品溶液不经前处理直接检测
采用Protein A ELISA Kit(Enzo,ADI-900-057)中样品稀释液(Assay buffer13)将康柏西普原液(10.9mg/ml)稀释至1.0mg/ml,分别取稀释后的原液300μl,加入样品稀释液6μl,分别加入不同浓度Protein A标准品(Protein A Standard,10000pg/ml),37℃孵育50min。再按试剂盒操作步骤进行操作,计算Protein A含量,并按下式计算Protein A加标回收率:
其中:
原液加标检测值为康柏西普原液加入Protein A标准品后经检测计算得到的Protein A含量(浓度);
原液检测值为康柏西普原液(未加入Protein A标准品)经检测计算得到的Protein A含量(浓度);
理论加标量为加入的Protein A标准品浓度。
检测结果如表2。
表2
以上数据可以看出,样品溶液不经过处理,1.0mg/ml康柏西普原液加标回收率非常低,因此需要进行优化。
实施例3样品溶液经酶切处理后进行检测
采用Protein A ELISA Kit(Enzo,ADI-900-057)中样品稀释液(Assay buffer13)将康柏西普原液(10.9mg/ml)分别稀释至0.025mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml,分别取稀释后的原液300μl,分别加入IdeS酶(50U/μl)6μl,分别加入Protein A标准品(Protein AStandard,10000pg/ml)5μl,37℃酶切1h。再按试剂盒操作步骤进行Protein A含量检测(其中煮沸时间为20min),计算Protein A加标回收率。结果如表3。
表3
从上述结果可以看出,将康柏西普原液稀释至低浓度,同时加入IdeS酶进行酶切,且将煮沸时间由5min延长至20min,加标回收率仍低于60%,需进行其他优化进一步提高加标回收率。
实施例4样品溶液经酶切、变性后进行检测
采用Protein A ELISA Kit(Enzo,ADI-900-057)中样品稀释液(Assay buffer13)将康柏西普原液(10.9mg/ml)稀释至0.025mg/ml或0.01mg/ml,分别加入IdeS酶酶切,表面活性剂RapiGest SF(5%)或TritonX-100(5%)至终浓度0.08%,Protein A标准品5μl,37℃酶切20min或60min。再按试剂盒操作步骤进行Protein A含量检测,计算Protein A加标回收率,结果如表4所示。
表4
上述结果表明,添加表面活性剂进行变性处理,进一步破坏康柏西普蛋白结构,Protein A蛋白的加标回收率在60%附近,且添加相同浓度的两种表面活性剂RapiGest SF和TritionX-100加标回收率差异较小。
实施例5样品溶液经还原后进行检测
采用试剂盒样品稀释液(Assay Buffer 13)将康柏西普原液(11.0mg/ml)分别稀释至1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml,分别取稀释后的原液150μl,加入Protein A标准品(Protein A Standard,10000pg/ml)10μl,再加入1M DTT 10μl(DTT终浓度60mM),室温静置10min,或加入1M TCEP-HCl(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)至终浓度18mM,室温静置10min;再用试剂盒样品稀释液(Assay Buffer13)将样品稀释8倍,按试剂盒操作步骤进行Protein A含量检测(其中煮沸时间为10min,加样孵育时间2h),计算Protein A加标回收率,结果如表5所示。
表5
实验结果表明,蛋白样品溶液经过还原处理后进行检测,Protein A回收率均有所提升,高于76%。尤其当蛋白浓度为0.2l-0.5mg/m条件下,Protein A加标回收率为86.8~100.6%,且DTT与TCEP-HCl加标回收率差异较小,均可作为优选还原剂使用。
实施例6重复性和准确度验证
分别取康柏西普原液(11.0mg/ml)加入Protein A标准品(Protein A Standard,10000pg/ml),加入试剂盒样品稀释液(AssayBuffer13)使康柏西普蛋白终浓度为0.2mg/ml,再加入1MDTT 10μl(DTT终浓度60mM),室温静置10min。再用试剂盒样品稀释液(AssayBuffer13)将样品稀释8倍,按试剂盒操作步骤进行Protein A含量检测(其中煮沸时间为10min,加样孵育时间2h),计算Protein A加标回收率,结果如表6。
表6
实验结果显示,不同Protein A加标浓度样品回收率在90%~110%范围内,各浓度3个平行样品RSD在4%~6%范围内。
序列表
<110> 成都康弘生物科技有限公司
<120> 一种Protein A残留量检测方法
<130> KH20210721
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
1 5 10 15
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
20 25 30
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
50 55 60
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
65 70 75 80
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
85 90 95
Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser
100 105 110
Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn
115 120 125
Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His
130 135 140
Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met
145 150 155 160
Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp
165 170 175
Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys
180 185 190
Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly
195 200 205
Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg
210 215 220
Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His
245 250 255
Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr
260 265 270
Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val
275 280 285
Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr
290 295 300
Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
305 310 315 320
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
325 330 335
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
340 345 350
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
355 360 365
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
370 375 380
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
385 390 395 400
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
405 410 415
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
420 425 430
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
435 440 445
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
450 455 460
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
465 470 475 480
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
485 490 495
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
500 505 510
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520 525
机译: 胶带残留量检测装置,胶带残留量检测方法以及成分残留量检测装置
机译: 液体残留量检测装置,燃料电池,液体残留量检测方法以及液体残留量检测程序
机译: 检测墨水残留量的装置,检测墨水残留量的方法,检测墨水残留量的程序以及图像记录器