一种田菁和甜高粱混合青贮的方法

摘要

本发明公开了一种田菁和甜高粱混合青贮的方法。本发明公开的田菁和甜高粱混合青贮的方法包括：将青贮原料与复合乳酸菌制剂混合进行固体厌氧发酵，收集发酵产物，即得到田菁青贮饲料；青贮原料为由田菁地上部分和甜高粱地上部分组成的混合物；复合乳酸菌制剂的活性成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。本发明的方法可显著延长田菁和甜高粱有氧稳定性，充分分解植物细胞壁，利用更多糖源，维持青贮pH、温度，保持乳酸菌在微生物菌群的相对丰度，减少干物质损失。

说明书

技术领域

本发明涉及农产品加工技术领域中，一种田菁和甜高粱混合青贮的方法。

背景技术

田菁(Sesbania cannabina)是豆科植物。广泛分布于中国、海南、江苏、浙江、江西、福建、广西、云南等南方地区，北方如山东等地也有栽培。常生于水田、水沟等潮湿低地。田菁适应性强，耐盐、耐涝、耐瘠、耐旱，性喜温暖、湿润，是改良盐碱地、土壤修复的先锋作物。

田菁用途很广，是各种土壤类型的优良绿肥作物，其种子胚乳可以生产田菁胶，是20世纪70年代发现的一种新型半乳甘露聚糖胶，可代替进口的瓜尔胶。田菁胶具有良好的水溶性，被广泛应用于油田采油、选矿冶金、采矿爆破、纺织印染、医药农药和日用化工等工业。田菁的茎、叶可作牲畜饲料，但目前研究较少。

一般豆科植物蛋白质含量较高，而可溶性糖类较低,不能满足青贮的基本要求，如何对豆科植物青贮，是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本方面所要解决的技术问题是如何对豆科植物青贮，尤其是如何对田菁青贮。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备田菁青贮饲料的方法，所述方法包括：将青贮原料与复合乳酸菌制剂混合，得到发酵前混合物，将所述发酵前混合物进行固体厌氧发酵，收集发酵产物，得到田菁青贮饲料；

所述青贮原料为由田菁地上部分和甜高粱地上部分组成的混合物；

所述复合乳酸菌制剂的活性成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。

上述方法中，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)可为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WQ-01；

所述希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)可为希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)60TS-2；

所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)可为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)NX205，所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.16534的菌株。

上述方法所述复合乳酸菌制剂中，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、所述希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)和所述布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)的活菌数之比可为1：1：1。

在本发明的一个实施例中，所述复合乳酸菌制剂由所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、所述希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)与生理盐水。

上述方法中，所述青贮原料中田菁地上部分的质量百分比可为30-70％。

上述方法中，所述田菁地上部分和所述甜高粱地上部分均为2～4cm的小段。

上述方法所述发酵前混合物中，所述青贮原料与所述复合乳酸菌制剂中所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、所述希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)之比可为1：1：1。

上述方法中，所述发酵可在15～25℃(如20-25℃)下进行。所述发酵时间可为14-60天。

所述发酵可在真空、密封、避光条件下进行，具体可在密封的聚乙烯袋中进行。

利用所述制备田菁青贮饲料的方法制备得到的田菁青贮饲料，也属于本发明的保护范围。

所述复合乳酸菌制剂，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了用于制备田菁青贮饲料的组合物，所述组合物由所述复合乳酸菌制剂与所述青贮原料组成。

布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205，也属于本发明的保护范围，布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.16534。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205。

所述制备田菁青贮饲料的方法，或所述田菁青贮饲料，或所述复合乳酸菌制剂或所述组合物，或所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205或所述的菌剂在制备动物饲料中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明利用用于田菁和甜高粱混合青贮的复合乳酸菌制剂(其含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WQ-01、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)60TS-2和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205)对田菁和甜高粱进行青贮发酵，可显著延长田菁和甜高粱有氧稳定性，充分分解植物细胞壁，利用更多糖源，维持青贮pH、温度，保持乳酸菌在微生物菌群的相对丰度，减少干物质损失。

分类命名：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)

菌株编号：NX205

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101

保藏日期：2018-9-26

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16534

附图说明

图1为复合青贮菌剂对田菁和甜高粱混合青贮样品pH值的影响。

图2为复合青贮菌剂对田菁和甜高粱混合青贮样品乳酸含量的影响。

图3为复合青贮菌剂对田菁和甜高粱样品混合青贮乙酸含量的影响。

图4为复合青贮菌剂对田菁和甜高粱混合青贮1,2-丙二醇含量的影响。

图5为复合青贮菌剂对田菁和甜高粱混合青贮样品可培养乳酸菌含量的影响。

图6为复合青贮菌剂对田菁和甜高粱混合青贮样品可培养酵母菌含量的影响。

图7为复合青贮菌剂对田菁和甜高粱混合青贮样品可培养好氧菌含量的影响。

图8种水平田菁和甜高粱混合青贮样品微生物菌群的动态变化。D3、D7、D14、D30、D60分别表示青贮发酵第3天、第7天、第14天、第30天和第60天。

其中，SS100、SS70、SS50、SS30分别表示田菁比例为100％、70％、50％、30％。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、田菁和甜高粱混合青贮饲料的制备

本实施例提供了一种用于田菁和甜高粱混合青贮的复合乳酸菌制剂，包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WQ-01(简称为植物乳杆菌WQ-01)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)60TS-2(简称为希氏乳杆菌60TS-2)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205(简称为布氏乳杆菌NX205)，该复合乳酸菌制剂可显著延长田菁和甜高粱有氧稳定性，充分分解植物细胞壁，利用更多糖源，维持青贮pH、温度，保持乳酸菌在微生物菌群的相对丰度，减少干物质损失。

其中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WQ-01与希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)60TS-2均记载在中国专利申请202010258231.8(申请公布号CN 111534456 A)中。

布氏乳杆菌NX205为骆爱群从宁夏贺兰县甜高粱中分离得到的菌株NX205，其分离鉴定步骤如下：

1)用天平准确称取10.00g甜高粱样品，与90mL无菌水充分混合，摇床150rpm室温震荡30min，用四层纱布过滤得到浸出液，梯度稀释后用灭菌涂布棒均匀涂布于MRS固体培养基上，置于37℃，厌氧培养48h。

2)待MRS固体培养基长出菌落后，用灭菌的接种环挑取白色，光滑形凸起，边缘整齐的菌落，接种到3mL MRS液体培养基中，置于37℃，静置厌氧培养48h。

3)待MRS液体培养基中有菌体长出后，用1mL移液器将菌液转移至用灭过菌的离心管中，12000rpm离心3min后收集菌体，由北京睿博兴科生物技术有限公司提取基因组DNA(细菌基因组DNA快速提取试剂盒，博迈德，货号：DL111-02)作为模板，使用通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)对16S DNA进行PCR扩增，以1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。使用PCR产物纯化回收试剂盒(博迈德，货号：DH102-02)对PCR扩增产物进行纯化回收，再进行测序，菌株NX205的序列为序列表中序列1。

菌株NX205为杆状。使用NCBI对测序后的序列进行比对，菌株NX205鉴定为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，记为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)NX205，该菌株已于2018年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16534。

一、菌株特性及糖利用特性

植物乳杆菌WQ-01、希氏乳杆菌60TS-2和布氏乳杆菌NX205在MRS液体培养基和在MRS固体培养基(MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉)中生长，37℃厌氧培养。菌株特性如表1所述，三者均为革兰氏阳性菌，杆状结构，过氧化氢酶阴性，氧化酶阴性。植物乳杆菌WQ-01为同型发酵菌株，能够在pH3.5～8.5范围内生长，在pH2.0有较弱生长，在15～45℃生长，耐受3.0％和6.5％NaCl浓度；希氏乳杆菌60TS-2为异型发酵菌株，在pH3.5～8.0范围内生长，在pH2.0有较弱生长，在15～40℃生长，在45℃有较弱生长，耐受3.0％和6.5％NaCl浓度；布氏乳杆菌NX205为异型发酵菌株，能够在pH4.0～4.5范围内生长，在pH2.0和pH3.5有较弱生长，在15～40℃生长，在45℃有较弱生长，耐受3.0％NaCl浓度，在6.5％NaCl浓度有微弱生长。

糖利用情况如表2所示，植物乳杆菌WQ-01对核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、N-乙酰-葡萄胺、苦杏仁苷、熊果苷、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉籽糖、拢牛儿糖和L-阿拉伯糖醇有利用能力，在分别以甘油和D-阿拉伯糖醇为唯一碳源的培养基中有微弱生长；希氏乳杆菌60TS-2对L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖和蔗糖有利用能力，在分别以甘露糖、N-乙酰-葡萄胺、纤维二糖、蔗糖为唯一碳源的培养基中有微弱生长；布氏乳杆菌NX205对L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖和松叁糖有利用能力，在分别以半乳糖和果糖为唯一碳源的培养基中有微弱生长。表2中，“对照”表示培养基中不含有碳源。

表1、植物乳杆菌WQ-01、希氏乳杆菌60TS-2和布氏乳杆菌NX205菌株特性

表1中，“W”表示有微弱生长。

表2植物乳杆菌WQ-01、希氏乳杆菌60TS-2和布氏乳杆菌NX205的糖利用

表2中，“W”表示有微弱生长。

二、复合青贮菌剂的制备

利用MRS液体培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号M8540-250g)培养植物乳杆菌WQ-01，收集培养液，离心，收集菌体，利用生理盐水洗三次后，收集菌体即得到植物乳杆菌WQ-01菌剂。

利用MRS液体培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号M8540-250g)培养希氏乳杆菌60TS-2，收集培养液，离心，收集菌体，利用生理盐水洗三次后，收集菌体即得到希氏乳杆菌60TS-2菌剂。

利用MRS液体培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号M8540-250g)培养布氏乳杆菌NX205，收集培养液，离心，收集菌体，利用生理盐水洗三次后，收集菌体即得到布氏乳杆菌NX205菌剂。

将植物乳杆菌WQ-01菌剂、希氏乳杆菌60TS-2菌剂、布氏乳杆菌NX205菌剂按照1:1:1的活菌比混合后，加入生理盐水，得到复合青贮菌剂，所得复合青贮菌剂中植物乳杆菌WQ-01、希氏乳杆菌60TS-2、布氏乳杆菌NX205的活菌含量分别为10

三、田菁和甜高粱混合青贮饲料的制备

收获现蕾期新鲜田菁地上部分和完熟期甜高粱地上部分，分别对田菁地上部分和甜高粱地上部分进行切割，切短长度为2～4cm(凯越机械公司，型号：9ZP-3.6)。

将切割后的田菁和甜高粱分别按照表3进行混合分组，得到新鲜植物样品；然后向每组新鲜植物样品中添加复合青贮菌剂，得到发酵前混合物，该发酵前混合物中植物乳杆菌WQ-01、希氏乳杆菌60TS-2、布氏乳杆菌NX205的活菌含量均为10

将各组的发酵前混合物装入聚乙烯袋中，每袋新鲜植物样品质量总量均为300g，每组4个重复，抽真空后室温(20～25℃)下避光进行青贮发酵，分别在青贮发酵第0天、第3天、第7天、第14天、第30天和第60天进行取样，进行干物质(DM)和青贮发酵产物检测。

表3田菁和甜高粱分组及混合比例

四、样品采集及检测

1.干物质(DM)检测

在青贮发酵第0天、第3天、第7天、第14天、第30天和第60天开袋进行干物质检测：称取100g样品，在恒温干燥器中65℃烘干至恒重(72h)，自然冷却至室温后称重，记录样品重量m，则干物质含量(DM)＝m/100×100％；而后测定样品中粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)和可溶性碳水化合物(WSC)的含量。检测方法依据

2.青贮发酵产物的测定

在青贮发酵第0天、第3天、第7天、第14天、第30天和第60天开袋，进行pH、乳酸、乙酸和1,2-丙二醇检测：取10g青贮材料，加入90mL生理盐水，混合均匀后置于4℃冰箱过夜放置；然后用4层纱布过滤分装置50mL离心管中，进行pH、乳酸、乙酸和1,2-丙二醇的测定。pH值采用pH计测定(pH 213；HANNA；意大利)。乳酸、乙酸和1，2-丙二醇采用配备有UV检测器(210nm)和柱(ICSep COREGEL-87H)的HPLC(1200，Agilent，America)检测，55℃下，流动相为0.005M H

3.可培养微生物菌群检测

在青贮发酵第0天、第3天、第7天、第14天、第30天和第60天开袋，取10g青贮样品加入90mL无菌PBS，振荡30min后，然后将溶液过滤4层纱布，收集滤液(即菌悬液)置于50mL无菌离心管中；对菌悬液进行稀释涂布，分别涂布于MRS、LB和PDA固体培养基中，36h-48h左右进行微生物计数。

4.基于高通量测序的微生物分析方法

在青贮发酵第0天、第3天、第7天、第14天、第30天和第60天开袋，取10.0g样品用于DNA提取，进行SMRT测序，测定16S rDNA全长序列。使用Illumina MiSeq平台，通过配对末端测序(2×300bp)对微生物DNA进行分析。细菌16S rDNA扩增子测序使用V1–V9 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，V1–V9 R(5′-GNTACCTTGTTACGACTT-3′)通用引物。使用QIIME质量控制过程获得高质量的序列，并使用UCHIME算法检测和删除嵌合序列。得到OUT表格，根据物种注释结果，采用最大值排序法，选取每组在各分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species)上最大丰度排名靠前的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各组在不同分类水平上微生物组成以及相对丰度和比例。

五、结果与分析

1.复合青贮菌剂对田菁和甜高粱青贮化学成分的影响：

结果如表4所示，田菁和甜高粱的混合比例以及青贮发酵时间共同影响青贮饲料的DM、CP、NDF、ADF、ADL和WSC。在整个田菁和甜高粱混合青贮过程中各个组合青贮饲料在每个时间点的DM含量保持相对稳定状态。各个组合青贮饲料CP含量和青贮饲料ADL含量随着甜高粱添加量的增加而显著降低(P<0.05)，并且每个组合青贮饲料CP含量和青贮饲料ADL含量随着发酵时间不断减少。各个组合青贮饲料NDF含量和青贮饲料ADF含量跟甜高粱添加量没有显著性关联，各个组合的青贮饲料NDF含量和青贮饲料ADF含量在不同时间点都保持相对稳定。各个组合青贮饲料WSC含量随着甜高粱添加量的增加而显著增加(P<0.05)，并且各个组合青贮饲料WSC含量随着发酵时间不断减少，这也符合青贮规律。

表4田菁和甜高粱混合青贮发酵过程中DM、CP、NDF、ADF、ADL和WSC含量变化

表4中，不同的小写字母表示同一发酵时间下不同样品的营养品质具有显著性差异(p＜0.05),不同的大写字母表示同一样品在不同发酵时间下的营养品质具有显著性差异(p＜0.01)。

2.复合青贮菌剂对田菁和甜高粱青贮发酵产物的影响：

如图1和表5所示，与SS100组合相比，SS70组合、SS50组合和SS30组合的pH值在青贮发酵60天内降落趋势均很明显，说明即使添加乳酸菌，单独田菁青贮发酵的pH值难以降低，而田菁混合加入甜高粱，可以很好的发挥乳酸菌的优势，有效维持田菁和甜高粱混合青贮的pH。

如图2和表5所示，在青贮发酵60天内，与SS100组合相比，SS30组合、SS50组合和SS70组合的乳酸含量在各个时间段均高于SS100组合的乳酸含量，SS30组合的乳酸含量整体是最高的，其次是SS50组合。

如图3和表5所示，SS100组青贮饲料(100％田菁组)在发酵30天内的四个时间点乙酸含量最高，其次是SS30组合。青贮发酵14天内，SS70、SS50和SS30组合青贮饲料乙酸含量微弱变化，保持稳定。青贮发酵14天以后，SS100组合青贮饲料乙酸含量在逐渐降低，SS70、SS50和SS30组合青贮饲料乙酸含量快速增加。

如图4和表5所示，发酵第14天时检测到了1,2-丙二醇的含量，但随着发酵时间的增加，SS100组合青贮饲料的1,2-丙二醇的含量始终为于0，SS70、SS50和SS30组合青贮饲料1,2-丙二醇的含量增长快速，并且甜高粱添加比例高的SS30组合青贮饲料1,2-丙二醇的含量最高。

表5青贮发酵60天复合青贮菌剂对田菁和甜高粱青贮发酵产物的影响

不同的小写字母表示同一发酵时间下不同样品的发酵品质具有显著性差异(p＜0.05),不同的大写字母表示同一样品在不同发酵时间下的发酵品质具有显著性差异(p＜0.01)。

3.复合青贮菌剂对田菁和甜高粱青贮可培养微生物菌群的影响：

如图5所示，四个组合的可培养乳酸菌含量在青贮60天内变化趋势大致相同，其中，SS100组合的可培养乳酸菌的含量在各个时间点一直是最高的。

如图6所示，四个组合的可培养酵母菌含量在青贮60天内变化趋势大致相同，其中，SS100组合的可培养酵母菌含量在各个时间点最高。

如图7所示，四个组合的可培养好氧菌含量在青贮60天内变化趋势大致相同，其中，SS100组合的可培养酵母菌含量在各个时间点最高。

4.复合青贮菌剂对田菁和甜高粱青贮微生物高通量测序菌群的影响：

如图8、表6-8所示，田菁和甜高粱混合青贮饲料细菌群落的物种相对丰度柱形图(种水平)。青贮前，田菁鲜样和甜高粱鲜样菌群相对复杂，田菁鲜样中Bacillus subtilis相对丰度为41.29％，是最大优势菌种，其次是相对丰度为6.06％的Stenotrophomonasmaltophilia。甜高粱鲜样中Bacillus subtilis相对丰度为31.83％，是最大优势菌种。青贮后，复合青贮菌剂中各菌种都在发挥主导优势，只是作用时间不同。发酵前期(第14天前)，同型发酵乳酸菌植物乳杆菌占主导优势，发酵后期(第14天后)，异型发酵乳酸菌希氏乳杆菌和布氏乳杆菌取代同型发酵乳酸菌后占主导优势，以上规律在SS70、SS50和SS30组合青贮饲料中趋势比较明显。而在SS100组合青贮饲料中变化趋势不太明显。而且在SS100组合青贮饲料中青贮发酵60天后，三株乳酸菌添加菌株希氏乳杆菌、布氏乳杆菌、植物乳杆菌相对丰度分别为10.63％、7.29％、11.54％。而SS70、SS50和SS30组合青贮饲料中希氏乳杆菌相对丰度分别为33.13％、28.75％和67.58％，SS70、SS50和SS30组合青贮饲料中布氏乳杆菌相对丰度分别为62.46％、65.93％和29.47％。

表6种水平田菁和甜高粱混合青贮前后微生物菌群的相对丰度

表7种水平田菁和甜高粱混合青贮前后微生物菌群的相对丰度

表8种水平田菁和甜高粱混合青贮前后微生物菌群的相对丰度

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种田菁和甜高粱混合青贮的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> 布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

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<222> (1485)..(1485)

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<400> 1

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