柚皮油在制备保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的药物等大健康产品中的应用

摘要

本发明公开了柚皮油在制备保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的药物等大健康产品中的应用。氨水刺激可以抑制大鼠咽部黏膜组织ZO‑1蛋白和KRT‑14蛋白的表达，说明氨水可以损伤大鼠咽部黏膜组织的屏障功能和修复功能，而柚皮油可以抑制氨水刺激诱导的大鼠咽部黏膜组织ZO‑1蛋白和KRT‑14蛋白表达降低，说明柚皮油保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损，能用于制备保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的药物。

说明书

技术领域：

本发明属于医药领域，具体涉及柚皮油在制备保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的药物中的应用。

背景技术：

柚子属亚热带常绿乔木果树芸香科、柑橘属植物。原产东南亚，在中国已有3000多年栽培历史。浙江、江西、广东、广西、福建、湖南、湖北、四川、贵州、云南等省均有栽种。柚皮油是柚子表皮油泡层中含有的一类具有芳香气味，在常温下能挥发的油状液体物质的总称，由萜烯类、醇类、醛类和酯类等组成。提取方法有水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂浸提法、超临界二氧化碳萃取法等。文献及我们的研究均表明，不同产地的柚皮挥发油中均含有蒎烯、月桂烯、柠檬烯、香叶醛、石竹烯等种化合物。不同产地柚的已鉴定物占总挥发油的百分含量及共有成分占总挥发油的百分含量相差不大，挥发油成分及含量存在一定差异，可能与各地气候条件、土壤状况、纬度、海拔高度、日照强度、栽培条件等因素有关，原因有待进一步探讨。柚皮油具有柚子独特的芳香风味，具有祛痰、止咳、平喘、镇痛、抗菌消炎等作用，可作医药、食品、饮料、化妆品的原料。专利CN 114711408 A公开了一种冷冻干燥法制备微胶囊化柚皮油的方法，具体涉及一种冷冻干燥法制备微胶囊化柚皮油的方法，属于食品工艺技术领域。现有技术没有柚皮油在制备保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的药物中的应用的记载。

ZO-1是构成粘膜上皮紧密连接的重要成分之一，其表达下调或活性降低会影响细胞间紧密连接形成，阻碍黏膜发挥其重要的防御屏障功能；细胞角蛋白(Keratin)是上皮细胞主要的结构蛋白和分化的标志物，对细胞形态结构的维持以及损伤组织的修复具有重要作用。

发明内容：

本发明的目的是提供柚皮油在制备保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的产品中的应用。

优选地，所述的产品为药物或大健康产品。

优选地，所述的大健康产品是食品、保健品或饮料。

优选地，所述的食品为普通糖果、凝胶糖果或压片糖果。

优选地，柚皮油在制备抑制外源刺激诱导的大鼠咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白表达降低的药物中的应用。

优选地，所述的外源刺激是氨水刺激。

优选地，所述的药物，其中含有0.1％-99.9％的柚皮油。

优选地，所述的药物的剂型为液体剂型或固体剂型。

优选地，所述的液体剂型为溶液剂、混悬剂、乳剂或气雾剂、爆珠。

优选地，所述的固体剂型为片剂、丸剂、爆珠或缓释制剂。

所述的柚皮油可来源于各种柚子的柚皮，例如化州柚、琯溪蜜柚，沙田柚，水晶柚，泰国红宝石，越南青柚，葡萄柚，取完整未霉变柚子，取柚皮，水蒸汽蒸馏提取挥发油，得到挥发油、或经其他物理方法如压榨、碰撞或CO

本发明的还提供了一种保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的药物，其含有柚皮油作为活性成分。

ZO-1是构成粘膜上皮紧密连接的重要成分之一，其表达下调或活性降低会影响细胞间紧密连接形成，阻碍黏膜发挥其重要的防御屏障功能；细胞角蛋白(Keratin)是上皮细胞主要的结构蛋白和分化的标志物，对细胞形态结构的维持以及损伤组织的修复具有重要作用。氨水刺激可以抑制大鼠咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白的表达，说明氨水可以损伤大鼠咽部黏膜组织的屏障功能和修复功能，而柚皮油可以抑制氨水刺激诱导的大鼠咽部黏膜组织 ZO-1蛋白和KRT-14蛋白表达降低，说明柚皮油保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损，能用于制备保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损的药物。

附图说明:

图1是柚皮油对大鼠咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白表达的影响。

具体实施方式

以下将结合本发明实施例中的附图，进一步对本发明做进一步详细说明，并且所描述的内容，不会限制权利要求书中所描述的本发明。显然，所描述的实施例仅为关键的实施例，并非全部的实施例，内容对本领域的技术人员是易理解的。

柚皮油的提取：取完整未霉变沙田柚，剥取柚皮402千克，水蒸汽蒸馏提取挥发油，得到挥发油2.7千克。

实施例1：

(1)实验方法：

将SD大鼠(SPF级，体质量180～220g，雄性)饲养1周适应环境后，随机分成以下 3组(每组5只)：(1)正常对照组：不接受氨水刺激；(2)氨水刺激组：每天用2.5％氨水雾化喷入大鼠咽部，每天2次，每次用喉头喷雾器喷3揿，每次间隔8小时，连续15天；(3)氨水刺激+柚皮油组：每天用2.5％氨水雾化喷入大鼠咽部，每天2次，每次用喉头喷雾器喷3 揿，每次间隔8小时，连续15天；每次氨水雾化之前1小时，按12mg/kg的剂量给每只动物的口腔滴入柚皮油。最后一次处理后2小时，给大鼠腹腔注射巴比妥钠，处死动物，剪开颈侧皮肤，去除肌肉，露出气管和咽喉，于大鼠环状软骨水平处剪断气管食管，从咽后壁开始向上分离，至腭帆水平切断组织摘取咽壁黏膜及其下组织，置于液氮中保存。

取液氮保存的咽部粘膜组织，加入RIPA裂解液后，冰上匀浆，在4℃、10 000r/min的条件下离心10min，取上清液制备组织蛋白提取液，BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量。在组织蛋白提取液中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液和PBS稀释总蛋白至1μg/μl，煮沸10min，供上样使用。每孔的总蛋白上样量为20μg，80V恒压电泳10min后转为250V恒压电泳25min。甲醇浸泡活化0.2μm PVDF膜后，用半干转转膜液浸泡平衡滤纸和PVDF膜30min，使用Trans-Blot Turbo全能型半干蛋白转印仪2.5A恒流半干转17min。转膜结束后用TBST 洗膜三次，每次5min；用5％脱脂奶粉封闭液封闭2h；再用TBST洗膜三次，每次15min；加入含有对应一抗的孵育液，于4℃孵育过夜，取膜用TBST洗膜三次，每次15min；加入二抗孵育液，室温孵育1h，用TBST洗膜三次，每次15min。以ECL高敏发光液孵育10s，使用Tanon5200天能化学发光成像系统检测闭锁小带蛋白1(Zonula occludens 1，ZO-1)和细胞角蛋白-14(Keratin14，KRT-14)的蛋白表达水平变化情况。

使用ImageJ软件对Western blotting图像进行灰度分析，灰度数据和图表采用GraphPad Prism 8进行分析和绘制，结果以“均值±标准差”表示，采用单因素方差分析处理数据，P<0.05 为检验差异具有统计学意义。

(2)实验结果：

由图1和表1可见，与正常对照组比较，氨水刺激组的ZO-1蛋白和KRT-14蛋白的表达水平显著降低，说明氨水刺激可以抑制大鼠咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白的表达；与氨水刺激组比较，氨水刺激+柚皮油组大鼠的咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白的表达水平显著升高，说明柚皮油可以抑制氨水刺激诱导的大鼠咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白表达降低。

(3)结论：

ZO-1是构成粘膜上皮紧密连接的重要成分之一，其表达下调或活性降低会影响细胞间紧密连接形成，阻碍黏膜发挥其重要的防御屏障功能；细胞角蛋白(Keratin)是上皮细胞主要的结构蛋白和分化的标志物，对细胞形态结构的维持以及损伤组织的修复具有重要作用。氨水刺激可以抑制大鼠咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白的表达，说明氨水可以损伤大鼠咽部黏膜组织的屏障功能和修复功能，而柚皮油可以抑制氨水刺激诱导的大鼠咽部黏膜组织 ZO-1蛋白和KRT-14蛋白表达降低，说明柚皮油保护咽部黏膜上皮屏障和修复功能受损。

表1柚皮油对大鼠咽部黏膜组织ZO-1蛋白和KRT-14蛋白表达的影响(

注：与正常对照组比较，