一种利用血液生化指标预测奶牛酮病脂肪肝综合征的系统及应用

摘要

本发明涉及生物检测技术领域，提供了一种利用血液生化指标预测奶牛酮病脂肪肝综合征的系统及应用。所述血液生化指标包括胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸或去氧胆酸。当奶牛血液中胆酸3.54μg/mL、甘氨胆酸6.802μg/mL、牛磺胆酸4.403μg/mL或去氧胆酸0.392μg/mL时，预测奶牛患酮病脂肪肝综合征。采用本发明的系统可以非侵入性的群体监测奶牛群酮病脂肪肝综合征病发病情况，与现有检测方法相比检测指标简单，临床操作更容易，为疾病的防控提供有效的技术支持，有效减少牧场经济损失。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种利用血液生化指标预测奶牛酮病脂肪肝综合征的系统及应用。

背景技术

随着社会的发展，奶牛养殖业在全世界畜牧养殖业中占据着非常重要的地位，奶牛不仅是供应奶制品的主要来源，而且在促进社会经济发展中发挥着重要的作用。酮病脂肪肝综合征作为导致奶牛死淘率较高的一种营养代谢病受到广泛关注，围产期是奶牛酮病脂肪肝综合征的高发期，该病发生时不仅导致肝功能下降，而且会降低奶牛抵抗力和免疫功能，对繁殖、泌乳及劳动力造成极大损失，严重时奶牛出现胎衣不下，子宫内膜炎和生产瘫痪等症状。由于该病缺乏明显症状，因此往往难以诊断和控制，从而危害奶牛的健康，增加的奶牛死淘率可占年病死率的20％左右，给奶牛产业造成巨大的经济损失。奶牛酮病脂肪肝综合征会导致肝脏甘油三酯含量增加，且血液和尿液非酯化脂肪酸(NEFA)、β羟丁酸(BHBA)浓度增加，但是目前该病主要通过血液NEFA、BHBA、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等综合性指标来检测，存在检测指标复杂，临床操作困难的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用血液生化指标预测奶牛酮病脂肪肝综合征的系统及应用，采用本发明的系统可以非侵入性的群体监测奶牛群酮病脂肪肝综合征病发病情况，与现有检测方法相比检测指标简单，临床操作更容易。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了测定血液生化指标的试剂在制备预测奶牛酮病脂肪肝综合征的试剂中的应用，所述血液生化指标包括胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸或去氧胆酸。

进一步地，当奶牛血液中胆酸>3.54μg/mL、甘氨胆酸>6.802μg/mL、牛磺胆酸>4.403μg/mL或去氧胆酸>0.392μg/mL时，预测奶牛患酮病脂肪肝综合征。

本发明还提供了一种用于预测奶牛酮病脂肪肝综合征的系统，该系统包括：

数据获取模块：用于获取奶牛血液中生化指标的浓度数据，所述生化指标包括：胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸或去氧胆酸；

结果判定模块：用于接收数据获取模块所获取的浓度数据，根据浓度数据对奶牛酮病脂肪肝综合征进行预测。

进一步地，根据浓度数据对奶牛酮病脂肪肝综合征进行预测的方法为：当奶牛血液中胆酸>3.54μg/mL、甘氨胆酸>6.802μg/mL、牛磺胆酸>4.403μg/mL或去氧胆酸>0.392μg/mL时，可预测奶牛患酮病脂肪肝综合征。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明收集泌乳初期奶牛血液通过LC-MS技术检测胆汁酸水平，基于酮病脂肪肝综合征奶牛与健康奶牛血液中胆酸(CA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、去氧胆酸(DCA)含量进行Pearson相关性分析与ROC曲线分析，确定当CA>3.540μg/mL、GCA>6.802μg/mL、TCA>4.403μg/mL或DCA>0.392μg/mL时，可预测奶牛患有酮病脂肪肝综合征。此方法可以非侵入性的群体监测奶牛群酮病脂肪肝综合征病发病情况，为疾病的防控提供有效的技术支持，有效减少牧场经济损失。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例提供了可预测奶牛酮病脂肪肝综合征的血液生化指标，具体步骤如下：

1.实验动物选取

实验于黑龙江省某大型集约化奶牛养殖场进行，随机选取胎次(2～3)、体况(2.75～3.75)相近的产后3～14天荷斯坦奶牛30头，根据血β-羟丁酸(BHBA)、Y值(Y＝-0.51-0.003NEFA+2.84GLU-0.0528AST)浓度将其分为酮病脂肪肝综合征组(BHBA>1.4mmol/L，Y<1)及健康组(BHBA<1.2mmol/L，Y>1，无其他任何症状)，其中健康组10头，酮病脂肪肝综合征组11头。

2.血液样本采集

实验牛于清晨采食前经尾静脉采集血液样本10mL，血液样品室温下静置30min，待其自然凝固后3000r/min离心10min，于-20℃保存待检。采用LC-MS法检测血浆胆汁酸水平，检测过程中所用试剂与仪器如表1、表2、表3、表4所示。

表1代谢物提取试剂

表2代谢物提取仪器及设备

表3代谢组学检测仪器

表4胆汁酸标准品物质信息

3.检测方法

取上述4种胆汁酸标准品各5μL，量取各母液适量制成混合标准品，用甲醇逐一稀释，制成工作标准溶液。胆汁酸的各浓度点及具体计算方式见表5。

精确移取100μL样本于2mL EP管中，加入600μL甲醇(-20℃)，涡旋振荡60s，12000rpm，4℃离心10min，取400μL上清液浓缩干燥，取200μL30％甲醇复溶样本，涡旋震荡30s，取上清液50μL加入200μL30％甲醇，涡旋震荡30s，加到检测瓶中进行检测。采用ACQUITY

表5胆汁酸标准曲线浓度(ng/mL)

计算公式:含量＝C*0.7*5/2/取样量(含量单位：μg/mL；C单位：ng/mL；取样量单位：μL)

对各工作标准溶液分别进行LC-MS检测，以工作标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察线性范围及绘制标准曲线。得到的各胆汁酸线性回归方程如表6所示，相关系数r>0.99。

表6奶牛血液胆汁酸线性回归方程

4.实验结果

采用独立样本T检验分析组间差异性，血液胆汁酸成分结果如表7所示，酮病脂肪肝综合征奶牛血液中GCA、DCA显著高于健康组(P<0.05)，CA、TCA极显著高于健康组(P<0.01)。

表7健康奶牛与酮病脂肪肝综合征奶牛血液胆汁酸指标差异性比较

附注：*(p<0.05)表示差异显著，**(p<0.01)表示差异极显著。

健康奶牛和酮病脂肪肝综合征奶牛血液Y值及BHBA结果如表8所示。

表8健康奶牛与酮病脂肪肝综合征奶牛Y值及BHBA

采用Pearson直线相关性分析各指标与酮病脂肪肝综合征相关性，结果如表9所示，血液CA、GCA、TCA、DCA均与酮病脂肪肝综合征诊断标准(Y值)水平呈极显著负相关(P<0.01)，血液CA、GCA、TCA、DCA均与酮病脂肪肝综合征诊断标准(BHBA)水平呈极显著正相关(P<0.01)。

表9酮病脂肪肝综合征奶牛显著相关性指标

附注：*(p<0.05)表示差异显著，**(p<0.01)表示差异极显著。

利用ROC曲线分析血液胆汁酸CA、GCA、TCA或DCA指标对奶牛酮病脂肪肝综合征的预警作用，结果如表10所示，血液CA、GCA、TCA和DCA曲线下面积分别为0.889、0.917、0.875和0.933。表明血液中CA、GCA、TCA或DCA对奶牛酮病脂肪肝综合征具有较好的预警作用。当血液CA>3.540μg/mL时预测奶牛患酮病脂肪肝综合征的敏感度100％，特异性66.7％；当GCA>6.802μg/mL时预测奶牛患酮病脂肪肝综合征的敏感度100％，特异性75％；当TCA>4.403μg/mL时预测奶牛患酮病脂肪肝综合征的敏感度100％，特异性75％；当DCA>0.392μg/mL时预测奶牛患有酮病脂肪肝综合征的敏感度100％，特异性80％。

表10血液CA、GCA、TCA、DCA预测参数

实验例

于黑龙江省九三农垦奶牛养殖专业合作社随机选取产后3-14天的荷斯坦奶牛10头，尾静脉采集血液通过LC-MS技术检测胆汁酸水平。依据CA>3.540μg/mL、GCA>6.802μg/mL、TCA>4.403μg/mL或DCA>0.392μg/mL标准，预测奶牛酮病脂肪肝综合征，依据奶牛酮病脂肪肝综合征金标准(BHBA>1.4mmol/L，Y<1)评价预测效果。

结果如表11所示，实际发生酮病脂肪肝综合征奶牛5头，依据CA>3.540μg/mL指标检出5头，依据血液GCA>6.802μg/mL指标检出5头，依据TCA>4.403μg/mL指标检出5头，DCA>0.392μg/mL标检出4头。

表11血液胆汁酸检测酮病脂肪肝综合征实施案例

附注：+表示奶牛检测为酮病脂肪肝综合征，-表示奶牛检测为健康。

为了使鉴定结果更加准确，利用中生北控生物科技股份有限公司的生化检测试剂盒，在迈瑞BS-350S全自动生化分析仪上分别检测了奶牛血液GLU(健康组GLU>2.8；患病组GLU<2.8)、AST(健康组AST<100；患病组AST>100)、NEFA(健康组NEFA<0.8；患病组NEFA>0.8)和BHBA含量并计算出Y值，如表12所示。由表11和表12对比可知，采用本发明的血液生化指标可以很好的预测奶牛是否患酮病脂肪肝综合征。

表12血液GLU、AST、NEFA和BHBA含量及Y值检测酮病脂肪肝综合征实施案例

由以上实施例可知，本发明提供了一种利用血液生化指标预测奶牛酮病脂肪肝综合征的系统及应用，采用本发明的系统可以非侵入性的群体监测奶牛群酮病脂肪肝综合征病发病情况，与现有检测方法相比检测指标简单，临床操作更容易。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。