巨细胞病毒的gB与五聚体的融合蛋白和包含该融合蛋白的疫苗

摘要

本发明的目的在于，提供能够预防和治疗CMV感染的有效的疫苗。本发明的融合蛋白为巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白。本发明的用于预防或治疗巨细胞病毒(CMV)感染的疫苗为包含CMV的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白作为抗原的亚单位疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及巨细胞病毒的gB与五聚体的融合蛋白、和包含该融合蛋白的用于预防或治疗巨细胞病毒感染的疫苗。

背景技术

巨细胞病毒(CMV)感染症主要有下述两种：发生于移植、AIDS、先天性免疫缺陷病等处于免疫抑制状态的患者的CMV肺炎、肠炎、视网膜炎等器官损伤；和，孕妇首次感染时使胎儿发病的先天性CMV感染症。其中，先天性CMV感染症是TORCH综合征之一，是引起胎儿畸形或严重的临床症状的重要的先天性感染症。孕妇在首次感染CMV时，约40％通过胎盘而出现胎儿的先天性感染(本说明书中，以相同含义使用“先天性感染”这一术语和“经胎盘感染”这一术语)。另外，也有报道称死产中约15％是由先天性CMV感染所致。每年先天性感染儿童人数在日本为3000人以上，在美国为约4万人，据称有症状者在日本有约1000人、在美国有约8000人，其中约90％有中枢神经系统疾病、听力损伤等后遗症。

日本的CMV抗体携带率高于欧美各国，日本成年人的80％～90％为CMV抗体阳性，几乎所有人在婴幼儿期被感染。然而，作为最近的趋势，显示出年轻人的CMV抗体携带率从90％左右降低至60％左右，先天性CMV感染症的预防对策的必要性进一步增高(非专利文献1)。

美国医学研究所(the Institute of Medicine)认为：在发达国家，先天性CMV感染症作为先天性的中枢神经系统疾病的原因影响已超过唐氏综合症，若以影响到有后遗症的先天性感染儿童的人生的QOL降低和社会经济损失作为质量调整寿命年(QALYs：quality-adjusted life years)进行计算，据分析认为CMV疫苗属于医疗经济效应最高的一类(非专利文献2)。

引起感染症的病原体大致分为：通过传统型疫苗能够获得足够的效果的I类病原体、以及通过传统型疫苗或病原体感染经历无法获得足够的免疫防御的II类病原体，CMV属于后者。作为难以克服II类病原体的理由，已经指出了它们所具有的独特的免疫逃逸机制。人类已经开发出许多针对I类病原体有效的疫苗，并战胜了由它们所引起的感染症的威胁。此外，未来疫苗开发的重点正向II类病原体转移。

为了将先天性CMV感染症所造成的损害减小到最小限度，也进行了通过孕妇筛查来鉴定未感染孕妇、提高日常生活上的防护，但这还不够。进而还有对首次感染孕妇进行鉴定并通过向孕妇给予CMV抗体高效价免疫球蛋白而有效预防胎儿的感染、减轻重症化的报道，但目前对有效性存在质疑(非专利文献3)。另一方面，也有作为低分子药的更昔洛韦(ganciclovir)在市场上销售，但其效果有限，也存在副作用的问题。目前尚不存在疫苗，而且如上所述也没有充分有效的治疗方法，因此对其需求很高。

关于CMV疫苗开发，一直以来多家制药企业、学术界也尝试使用了减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等的研究，但任意情况的T细胞免疫、B细胞免疫的应答均不充分，结果无法获得作为疫苗而耐受实际使用的效果。

其中，Sanofi公司的疫苗是以CMV糖蛋白的gB作为抗原的基因重组亚单位疫苗，在以未感染成年女性为对象的临床试验中显示出约50％左右的感染预防效果。由于效果是有限的，因此开发实际上被中断，但得到了“单独gB抗原可以显示出一定的效果(但不充分)”这一有意义的见解(非专利文献4)。

对于候补CMV疫苗的效果的实验性证明，需要考虑CMV的种属特异性。CMV具有种属特异性，因此使用了人巨细胞病毒(HCMV)的动物实验基本上是不可能的。虽使用小鼠、大鼠、豚鼠、猴子等进行了动物实验，但是使用各种动物种属特异性的CMV而实施了动物实验。对于经胎盘感染，仅豚鼠为通过使母体感染病毒、在不进行特殊处理的情况下也能够确认胎儿感染的动物模型系统，广泛利用了豚鼠的经胎盘感染试验系统(非专利文献5)。

关于gB疫苗对经胎盘感染的效果，报道了：通过向雌豚鼠给予重组豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)的gB蛋白+佐剂而抑制了雌豚鼠的首次感染，另外，胎儿的经胎盘感染也得到抑制(非专利文献6)。

非专利文献7中示出了：使用整合了GPCMV的gB蛋白的腺病毒载体疫苗，在豚鼠的经胎盘感染模型中，gB抑制了胚胎的经胎盘感染。

另一方面，作为CMV的主要抗原，近年来受到广泛关注的是五聚体(Pentamer)抗原。五聚体是CMV的细胞趋向性决定因子，人CMV是由gH、gL、UL128、UL130和UL131(gH/gL/UL128/UL130/UL131)这5个亚单位构成的分子(非专利文献15)。

关于五聚体在经胎盘感染中所起的作用，报道了：缺失了五聚体基因的GPCMV已失去对上皮·内皮细胞的感染性和经胎盘感染能力，通过异位表达所缺失的基因而使这些能力恢复(非专利文献8)。

另外，关于五聚体疫苗的效果，报道了：对向小鼠给予表达五聚体的载体疫苗MVA-PC而诱导的单克隆抗体进行了详细地解析，结果与抗gH抗体相比，抗五聚体抗体在上皮和内皮细胞系中的中和能力明显高，被认为在经胎盘感染中重要的滋养层细胞中的中和能力也是同样的(非专利文献9)。

另一方面，也有相反的报告。非专利文献10中指出：人胎盘中的滋养层祖细胞是CMV的靶标，在CMV感染该细胞时，五聚体的贡献几乎观察不到，而gB的贡献则明确观察到。

另外，非专利文献11中指出：使用离体的胎盘感染试验系统，在GPCMV感染胎盘组织和增殖中五聚体的贡献几乎观察不到。

如此，尽管有零散报道表明五聚体作为疫苗抗原是有用的，但五聚体在经胎盘感染中的作用尚不清楚，现状是关于五聚体疫苗对经胎盘感染的抑制效果这一点仍未定论。

对于五聚体和gB的组合使用的效果，专利文献1中报道了在以猴子为对象的感染防御试验中重组五聚体和重组gB的组合使用是有效的，但对于经胎盘感染的影响没有给出任何启示。另外，虽然显示出五聚体+gB的组合使用组优于五聚体单独组和非免疫组，但由于未设定gB单独组，因此无法准确显示出组合使用的效果。

另外，非专利文献12中，在体外对抗gB单克隆抗体和抗五聚体单克隆抗体的组合使用效果进行验证，尽管认为在中和能力和抑制耐药菌株出现方面组合使用具有优点，但尚未证实组合使用对生物体中的感染防御能力的效果。

进而，专利文献2中给出了用gB+五聚体的2价疫苗进行免疫、从而可以使某些细胞因子的产生高于单独组的数据，但组合使用组在中和能力方面并无优势，而且也没有进行感染实验。另外，专利文献4公开了改变CMV gB蛋白和包含该蛋白的CMV疫苗。

非专利文献15阐明了五聚体的X射线晶体结构。根据该文献，五聚体为采取螺旋状结构的长径约18nm的分子，其末端存在gH，通过gH的一部分与gL缠结的形式而形成了gH/gL结构域。UL128/UL130/UL131采取柔和的弯曲形状，并且与gL的N末端相互作用。UL128/UL130/UL131中，UL131存在于三者的中心。UL130在其C末端侧与UL131的β股一起形成片状结构，其一面被UL131的螺旋结构覆盖。UL128和UL130均在N末端侧分别形成球状结构，这些夹持核心结构且处于正相反的位置。UL128的C末端侧以达5nm的富有柔软性的接头与gL相互作用，以嵌入gL的沟中的形态形成小的螺旋结构。从而，五聚体在内部分子间有多种相互作用。但是，其界面小，因此采取的是非常富有柔软性的结构，公开了通过与Fab结合、从而五聚体得以稳定化。因此，通过导入适宜的位点特异性突变可能能够提高稳定性。

非专利文献13阐明了聚集性因位点特异性突变而改善的gB的胞外结构域(胞外域)的X射线晶体结构。根据该文献，gB的同源三聚体采取钉子样结构，其原聚体由5个结构域构成。结构域I和结构域II位于邻近细胞膜侧的位置，结构域III通过非常长的螺旋结构而形成卷曲螺旋结构。结构域IV位于细胞膜的正相反侧，结构域V以沿着结构域I至结构域III的gB全长的形态存在。N末端位于结构域IV附近，C末端存在于结构域V中。

对CMV gB蛋白的立体结构进行了分析(非专利文献13)，例如已知源自AD169株的gB蛋白(序列号1)具有由序列号1中的第109-319位的氨基酸残基构成的结构域I、由第97-108位的氨基酸残基和第320-414位的氨基酸残基构成的结构域II、由第71-87位的氨基酸残基和第453-525位的氨基酸残基和第614-643位的氨基酸残基构成的结构域III、由第65-70位的氨基酸残基和第526-613位的氨基酸残基构成的结构域IV、以及由第644-675位的氨基酸残基构成的结构域V。

gB中存在5个抗原域(antigenic domain、AD)(AD-1～AD-5)，AD-1的抗原性最高。AD-1位于结构域IV，认为由于结构域IV中N型糖链比较少、抗原呈露出状态，因此抗体容易进入。进而，专利文献4报道了非中和抗体集中于包含结构域IV的区域(头部区域)，报道了去除了头部区域的gB有可能作为疫苗。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2017153954号

专利文献2：特表2017-515503号公报

专利文献3：国际公开第2003004647号

专利文献4：国际公开2020085457号

非专利文献

非专利文献1：Azuma H et al.,“Cytomegalovirus seropositivity inpregnant women in Japan during 1996-2009”J Jpn Soc Perin Neon Med 46(2010)1273-1279

非专利文献2：Kathleen R.Stratton et al.,“Vaccines for the 21stcentrury:a tool for decision making”The National Academies Press,2000

非专利文献3：Revello MG et al.,“Randomized trial of hyperimmuneglobulin to prevent congenital cytomegalovirus”N Engl J Med 370(2014)1316-1326

非专利文献4：Rieder F et al.,“Cytomegalovirus vaccine:phase IIclinical trial results”Clin Microbiol Infect 20Suppl 5(2014)95-102

非专利文献5：Yamada S et al.,“Characterization of the guinea pigcytomegalovirus genome locus that encodes homologs of human cytomegalovirusmajor immediate-early genes,UL128,and UL130”Virology391(2009)99-106

非专利文献6：Schleiss MR et al.,“Glycoprotein B(gB)vaccines adjuvantedwith AS01 or AS02 protect female guinea pigs against cytomegalovirus(CMV)viremia and offspring mortality in a CMV-challenge model”Vaccine 32(2014)2756-2762

非专利文献7：Hashimoto K et al.,“Effects of immunization of pregnantguinea pigs with guinea pig cytomegalovirus glycoprotein B on viral spread inthe placenta”Vaccine 31(2013)3199-3205

非专利文献8：Coleman S et al.,“A Homolog Pentameric Complex DictatesViral Epithelial Tropism,Pathogenicity and Congenital Infection Rate inGuinea Pig Cytomegalovirus”PLoS Pathog 12(2016)e1005755

非专利文献9：Flavia Chiuppesi et al.,“Vaccine-Derived NeutralizingAntibodies to the Human Cytomegalovirus gH/gL Pentamer Potently Block PrimaryCytotrophoblast Infection”J Virol 89(2015)11884-11898

非专利文献10：Martin Zydek et al.,“HCMV Infection of Human TrophoblastProgenitor Cells of the Placenta Is Neutralized by a Human MonoclonalAntibody to Glycoprotein B and Not by Antibodies to the Pentamer Complex”Viruses 6(2014)1346-1364

非专利文献11：Yamada S et al.,“An Ex vivo culture model for placentalcytomegalovirus infection using slices of Guinea pig placental tissue”Placenta37(2016)85-88

非专利文献12：Hetalkumar D et al.,“In Vitro Characterization of HumanCytomegalovirus-Targeting Therapeutic Monoclonal Antibodies LJP538 andLJP539”Antimicrob Agents Chemother 60(2016)4961-4971

非专利文献13：Burke HG et al.,“Crystal Structure of the HumanCytomegalovirus Glycoprotein B”PLoS Pathog 11(2015)e1005227

非专利文献14：Ciferri C et al.,“Structural and biochemical studies ofHCMV gH/gL/gO and Pentamer reveal mutually exclusive cell entry complexes”Proc Natl Acad Sci USA 112(2015)1767-1772

非专利文献15：Chandramouli S et al.,“Structural basis for potentantibody-mediated neutralization of human cytomegalovirus.”Sci Immunol2(2017)eaan1457

发明内容

如上所述，对于CMV感染的预防而言，不存在特别能抑制CMV先天性感染的有效的CMV疫苗。因此，本发明的目的在于，提供能够预防和治疗CMV感染的有效的疫苗。

本发明人们在以前的研究(国际申请PCT/JP2019/047966号、2020年6月18日以WO2020/121983公开)中提出了包含CMV gB抗原和五聚体抗原的、用于预防或治疗CMV的先天性感染的疫苗。本发明人们为了提供更有效的疫苗而进行了深入研究，结果制作出使作为CMV的主要抗原的gB与五聚体以基因工程手段融合而成的蛋白复合体，发现通过制成包含1种蛋白的亚单位疫苗可强烈抑制豚鼠的先天性CMV感染、以及在该融合蛋白形态中五聚体分子的稳定性提高，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的各发明。

[1]巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白。

[2]根据[1]所述的融合蛋白，其中，由3个gB蛋白构成分子构成的gB蛋白的同源三聚体和由5个五聚体构成分子构成的五聚体的异源五聚体通过至少1个gB蛋白构成分子与至少1个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行融合而形成蛋白复合体。

[3]根据[2]所述的融合蛋白，其中，至少2个gB蛋白构成分子与至少2个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行了融合。

[4]根据[2]或[3]所述的融合蛋白，其中，3个gB蛋白构成分子与5个五聚体构成分子中的任意3个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行了融合。

[5]根据[2]～[4]中任一项所述的融合蛋白，其中，3个gB蛋白构成分子与作为五聚体构成分子的gL、UL128和UL130分别以基因工程手段进行了融合。

[6]根据[2]～[4]中任一项所述的融合蛋白，其中，3个gB蛋白构成分子与作为五聚体构成分子的UL128、UL130和UL131分别以基因工程手段进行了融合。

[7]根据[2]～[6]中任一项所述的融合蛋白，其中，通过基因工程手段的融合中，至少1个融合为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合。

[8]根据[3]～[6]中任一项所述的融合蛋白，其中，通过基因工程手段的融合中，至少2个融合为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合。

[9]根据[4]～[6]中任一项所述的融合蛋白，其中，3个通过基因工程手段的融合均为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合。

[10]根据[2]～[9]中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白构成分子与五聚体构成分子之间具有接头和/或标签。

[11]根据[10]所述的融合蛋白，其中，接头为使序列号22中记载的氨基酸序列单元重复1～3次而成的氨基酸序列所构成的接头。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为CMV gB蛋白的胞外域。

[13]根据[12]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为序列号15中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。

[14]根据[12]或[13]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与序列号15中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。

[15]根据[1]～[14]中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为缺失了结构域IV的gB蛋白变体。

[16]根据[15]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为序列号16中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。

[17]根据[15]或[16]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与序列号16中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。

[18]根据[1]～[14]中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与野生型gB蛋白相比导入了减少聚集体的形成、增加同源三聚体结构的比例的改变的gB蛋白变体。

[19]根据[18]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为序列号3中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。

[20]根据[18]或[19]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与序列号3中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。

[21]根据[1]～[14]中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与野生型gB蛋白相比导入了降低头部区域的免疫原性的改变的gB蛋白变体。

[22]根据[21]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为序列号31中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。

[23]根据[21]或[22]所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与序列号31中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。

[24]根据[1]～[23]中任一项所述的融合蛋白，其中，五聚体由人巨细胞病毒(HCMV)的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成。

[25]根据[24]所述的融合蛋白，其中，gH为gH蛋白的胞外域。

[26]根据[24]或[25]所述的融合蛋白，其中，五聚体为：包含

序列号4中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的gH、

序列号5中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的gL、

序列号6中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的UL128、

序列号7中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的UL130、和

序列号8中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的UL131

的人巨细胞病毒(HCMV)的五聚体蛋白。

[27]根据[24]～[26]中任一项所述的融合蛋白，其中，五聚体为：包含

与序列号4中记载的氨基酸序列所构成的gH具有80％以上的序列同一性的gH、

与序列号5中记载的氨基酸序列所构成的gL具有80％以上的序列同一性的gL、

与序列号6中记载的氨基酸序列所构成的UL128具有80％以上的序列同一性的UL128、

与序列号7中记载的氨基酸序列所构成的UL130具有80％以上的序列同一性的UL130、和

与序列号8中记载的氨基酸序列所构成的UL131具有80％以上的序列同一性的UL131

的HCMV的五聚体蛋白。

[28]一种核酸片段，其编码[1]～[27]中任一项所述的融合蛋白。

[29]一种重组表达载体，其包含[28]所述的核酸片段。

[30]一种转化体，其导入了[28]所述的核酸片段或[29]所述的重组表达载体。

[31]一种用于预防或治疗CMV感染的疫苗，其包含[1]～[27]中任一项所述的融合蛋白。

[32]根据[31]所述的疫苗，其中，CMV感染为CMV的先天性感染。

根据本发明，可以提供一种疫苗，其在CMV的先天性感染的防御中以gB与五聚体的融合蛋白为抗原、从而具有超过分别单独给予时的效果的感染抑制效果。由此，可以期待CMV疫苗的实用化。

附图说明

图1为示出实施例1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图2为示出实施例1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图3为示出实施例1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图4为示出实施例2的各gB-五聚体构成蛋白融合体的、使用HCMV-gB免疫血清和五聚体免疫血清的反应性分析结果的图。

图5为示出实施例2的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图6为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的、使用HCMV-gB免疫血清和五聚体免疫血清的反应性分析结果的图。

图7为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的、使用HCMV-gB免疫血清和五聚体免疫血清的反应性分析结果的图。

图8为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的、使用HCMV-gB免疫血清和五聚体免疫血清的反应性分析结果的图。

图9为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的、使用HCMV-gB免疫血清和五聚体免疫血清的反应性分析结果的图。

图10为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图11为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图12为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图13为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图14为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体免疫血清的抗体效价测定结果的图。

图15为示出实施例3-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体免疫血清的中和活性结果的图。

图16为示出实施例3-2-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的、使用Δd4免疫血清的反应性分析结果的图。

图17为示出实施例3-2-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的、使用五聚体(PC)免疫血清的反应性分析结果的图。

图18为示出实施例3-2-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的、使用gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131(Δd4/PC)免疫血清的反应性分析结果的图。

图19为示出实施例3-2-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的、使用盐水免疫血清的反应性分析结果的图。

图20为示出实施例3-2-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图21为示出实施例3-2-1的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的粒径评价结果的图。

图22为示出实施例4的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的粒径分布结果的图。

图23为示出实施例4的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的粒径分布结果的图。

图24为示出实施例5的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的评分的图。

图25为示出实施例6的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图26为示出实施例6的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的经胎盘感染防御试验的结果的图。

图27为示出实施例7的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的经胎盘感染防御试验的结果的图。

图28为示出实施例3-2-2的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的凝胶过滤色谱的结果的图。

图29为示出实施例3-2-2的各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品的粒径评价结果的图。

图30为示出实施例3-2-3的各gB-五聚体构成蛋白融合体免疫血清的抗体效价测定结果的图。

图31为示出实施例3-2-3的各gB-五聚体构成蛋白融合体免疫血清的中和活性结果的图。

图32为示出实施例4的gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131的纯化品的粒径分布结果的图。

具体实施方式

以下对用于实施本发明的方式进行详细说明。但是，本发明不受以下实施方式限定。

〔融合蛋白〕

本发明的融合蛋白为巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白。该融合蛋白是通过至少1个gB蛋白构成分子与至少1个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行融合、从而由3个gB蛋白构成分子构成的gB蛋白的同源三聚体与由5个五聚体构成分子构成的五聚体的异源五聚体形成蛋白复合体而得的。在此，构成分子是指构成gB蛋白的同源三聚体或五聚体的异源五聚体的蛋白，也称为亚单位。该融合蛋白可作为抗原用于对CMV的预防和治疗有用的疫苗的制作中。

融合蛋白优选为通过至少2个gB蛋白构成分子与至少2个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行融合而形成的蛋白复合体、更优选为通过3个gB蛋白构成分子与5个五聚体构成分子中的任意3个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行融合而形成的蛋白复合体。

巨细胞病毒(CMV)包括任意的CMV株，可列举例如人巨细胞病毒(HCMV)、豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)、小鼠巨细胞病毒(MCMV)、大鼠巨细胞病毒(RCMV)和罗猴巨细胞病毒(RhCMV)等。优选HCMV。

本实施方式中的CMV的gB蛋白可以是野生型CMV gB蛋白，也可以是改变型CMV gB蛋白。

野生型CMV gB蛋白是指源自任意的CMV株的gB蛋白，可列举例如具有序列号1中记载的氨基酸序列的源自HCMV AD169株的gB蛋白(GenBank登录号：X17403.1)、具有序列号2中记载的氨基酸序列的源自GPCMV 22122株的gB蛋白(GenBank登录号：AB592928.1)等。

改变型CMV gB蛋白(也称为“gB蛋白变体”、“gB变体”或“变体”。)是指相对于野生型CMV gB蛋白而言置换、缺损(缺失)或添加了至少一个氨基酸残基或连续的氨基酸残基区域的蛋白，也包括通过氨基酸残基的置换或缺损而导入了糖链的蛋白等发生了野生型中不存在的蛋白修饰的蛋白。

gB变体可以具有在野生型CMV gB蛋白的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个以上、例如1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～3个氨基酸残基的氨基酸序列，置换、缺损(缺失)或添加可以同时发生。在此，氨基酸的添加包括在原氨基酸序列中插入和在原氨基酸序列的末端追加这两者。需要说明的是，本说明书中，氨基酸残基在明确为氨基酸残基的情况下有时简称为氨基酸。

作为gB变体，可以为具有不会对原gB蛋白的立体结构和功能造成影响的改变的变体，也可以为性状得到改善的变体。作为性状得到改善的gB变体，可列举例如：导入了用于不形成聚集体或减少聚集体的形成、增加同源三聚体结构的比例的改变的变体；或者，导入了用于提高抗体诱导能力或中和抗体诱导能力的改变、例如专利文献4中记载的降低gB蛋白的头部区域的免疫原性的改变的变体等。“中和抗体诱导能力”是指能够诱导针对抗原蛋白的中和抗体的能力，可以通过将抗原蛋白接种于待检动物中而得到的免疫血清中的中和抗体效价(neutralizing antibody titer)进行评价。“中和抗体”是指能使病毒颗粒的感染性消失的抗体，例如可以通过使待检病毒的蚀斑数量减少50％所需的抗体浓度(NT50)来评价该抗体的中和活性的高低。

另外，本实施方式中的CMV的gB蛋白可以为CMV gB蛋白的全长，也可以为CMV gB蛋白的抗原性片段。

作为gB蛋白的全长，可列举例如上述序列号1中记载的氨基酸序列所构成的HCMVgB蛋白(GenBank登录号：X17403.1)。其中，在序列号1中记载的氨基酸序列中，第1位至第24位的氨基酸序列(序列号19)为信号序列。因此，作为CMV gB蛋白的全长，可以为从序列号1中记载的氨基酸序列除去上述信号序列(序列号19)而成的HCMV gB蛋白。

本发明的融合蛋白可以作为抗原用于对CMV的预防和治疗有用的疫苗的制作中，因此，作为gB蛋白的抗原性片段，只要为有抗原性且能够形成同源三聚体的片段即可，可列举例如CMV的gB蛋白的胞外结构域(胞外域)或胞外域的片段或变体。作为胞外域，可列举例如：源自HCMV AD169株的HCMV(序列号1)中记载的氨基酸序列中的第25位至第706位的氨基酸序列所构成的HCMV gB蛋白的片段，将该片段定义为野生型HCMV gB蛋白的胞外域(序列号15)。另外，为其它CMV gB蛋白的胞外域时，以基于与上述HCMV AD169株来源的HCMV的胞外域(序列号15)的序列比对的相当位置来定义。本实施方式中的gB蛋白的胞外域可以为野生型CMV gB蛋白的胞外域，也可以为改变型CMV gB蛋白的胞外域(gB蛋白的胞外域变体)。

作为gB蛋白的胞外域或其变体，可以为序列号15中记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上、例如1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～3个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的HCMV的gB蛋白的胞外域。

作为gB蛋白的胞外域或其变体，还可以为与序列号15中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上、例如85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或98％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。在此，序列同一性是指对多个序列进行比对时的、(在序列间保持一致的氨基酸残基数)/(氨基酸序列全长)的百分率。例如利用遗传信息处理软件GENETYX对对象序列进行比对并在计算中排除间隙而得出的相似度矩阵％(％IdentityMatrix)相当于序列同一性。

另外，作为gB蛋白的胞外域的变体，例如可以为缺失了结构域IV的变体。例如可以为使序列号15中记载的氨基酸序列的97-468位氨基酸和631-682位氨基酸直接或借助合适的肽接头连接而成者。另外，可以为对该缺失了结构域IV的变体进一步导入了Y131A、I132A、Y133A、W216A、R432T和R434Q的氨基酸置换者，可列举例如将序列号15的97-468位氨基酸和631-682位氨基酸之间用GGGSGSGGG(序列号20)的9个氨基酸连接且进一步导入了Y131A、I132A、Y133A、W216A、R432T和R434Q的氨基酸置换的变体(“gBΔd4”)(序列号16)。

作为缺失了结构域IV的变体，还可以为在序列号16中记载的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上、例如1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～3个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。

作为缺失了结构域IV的变体，还可以是gB蛋白为与序列号16中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上、例如85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或98％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。

作为导入了降低聚集体的形成、增加同源三聚体结构的比例的改变的gB蛋白变体，可列举以序列号15中记载的氨基酸序列所构成的HCMV gB蛋白的胞外域为基础并参考非专利文献13将第132位的氨基酸残基置换为组氨酸残基(His)、将第133位的氨基酸残基置换为精氨酸残基(Arg)、将第215位的氨基酸残基置换为谷氨酸残基(Glu)、将第216位的氨基酸残基置换为丙氨酸残基(Ala)、将第432位的氨基酸残基置换为苏氨酸残基(Thr)、将第434位的氨基酸残基置换为谷氨酰胺残基(Gln)的HCMV gB蛋白胞外域变体(序列号3)。

作为上述gB蛋白变体，还可以为在序列号3中记载的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上、例如1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～3个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。

作为上述gB蛋白变体，还可以为与序列号3中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上、例如85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或98％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。

作为导入了用于提高抗体诱导能力或中和抗体诱导能力的改变的gB蛋白变体，可列举例如导入了降低gB蛋白的头部区域的免疫原性的改变的gB蛋白变体，例如，可列举在序列号15中记载的氨基酸序列中导入与序列号3相同的突变且还缺损了S128-L138、将末端的R127和G139用甘氨酸接头GGG连接、缺损了W216-Y218、导入了4处N型糖链(D77N、I79T/E544N、P546T/L588N、P589G/K609N、R610T、M611T)者(gBVC37、序列号31)(专利文献4)。

作为上述gB蛋白变体，还可以为在序列号31中记载的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上、例如1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～3个氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。

作为上述gB蛋白变体，还可以为与序列号31中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上、例如85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或98％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。

CMV的gB蛋白抗原可以使用CMV通过蛋白质纯化而制作，也可以通过基因工程的方法而制作。制作方法没有特别限定，例如可以通过如下方式得到：将野生型gB蛋白的cDNA作为模板，设计引物，通过PCR得到核酸，与表达启动子功能性连接，根据情况也与标签连接，导入至适合的表达载体中，进行表达，从而得到。制作的CMV gB蛋白抗原可以根据需要进行纯化。纯化方法没有特别限定，可列举利用亲和色谱柱等的纯化。

在改变型gB蛋白抗原为通过突变导入而得的变体的情况下，可以通过如下方式得到：设计用于导入目标突变的引物，通过PCR得到导入了突变的核酸，与表达启动子功能性连接，根据情况也与标签连接，导入至适合的表达载体中，进行表达，从而得到。

另外，在改变型gB蛋白抗原为通过糖链导入(糖链修饰)而得的变体的情况下，为通常的方法即可，没有特别限定，例如，导入N型糖链时，以野生型gB蛋白的cDNA作为模板，以使要导入N型糖链的目标位点的3个连续的氨基酸序列为N-X-S/T(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)的方式设计引物，通过PCR导入突变。将目标改变型gB蛋白的核酸序列、另外必要时将连接有6×His等标签的核酸序列克隆至适合的载体上，进行表达，从而能够得到改变型CMV gB蛋白。然后，利用通常的方法将N型糖链添加至gB变体的目标位点的天冬酰胺。

CMV的五聚体也称为5个不同构成分子(亚单位)所构成的五聚体复合体或异源五聚体或简称为五聚体。可以为野生型CMV五聚体，也可以为改变型CMV五聚体。

野生型CMV五聚体是指源自任意的CMV株的五聚体，可列举例如：由人巨细胞病毒(HCMV)的gH、gL、UL128、UL130和UL131构成的五聚体；由豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)的GP75(gH)、GP115(gL)、GP129(UL128)、GP131(UL130)和GP133(UL131)构成的五聚体等。

HCMV五聚体可列举例如序列号4(gH)、序列号5(gL)、序列号6(UL128)、序列号7(UL130)和序列号8(UL131)中记载的氨基酸序列所构成的源自HCMV Merlin株的五聚体蛋白(GenBank登录号：AY446894.2)(其中，UL128的碱基序列中包含突变，因此以其它CMV株的序列信息为基础进行了修正)等。

GPCMV五聚体例如可列举：序列号10(GP75)、序列号11(GP115)、序列号12(GP129)、序列号13(GP131)和序列号14(GP133)中记载的氨基酸序列所构成的源自GPCMV 22122株的五聚体蛋白(GenBank登录号：AB592928.1)(其中，GP133的碱基序列中包含突变，因此以其它CMV株的序列信息为基础进行了修正)等。

作为改变型CMV五聚体的亚单位(构成分子)，可以为具有不会对原亚单位的立体结构和功能造成影响的改变的变体，也可以为性状得到改善的变体。作为性状得到改善的亚单位的变体，可列举例如：导入了用于不形成聚集体或减少聚集体的形成、从而五聚体的含量增加的改变的变体；导入了用于提高抗体诱导能力或中和抗体诱导能力的改变的变体等。改变型CMV五聚体是指：在构成野生型CMV五聚体的5个亚单位中，至少1个为改变蛋白(亚单位的变体)的五聚体。亚单位的变体是指：相对于对应的野生型亚单位置换、缺损(缺失)或添加1个以上氨基酸残基或连续的氨基酸残基区域的蛋白，也包括通过氨基酸残基的置换、缺损(缺失)或添加而导入了糖链的蛋白等发生了野生型中不存在的蛋白修饰的蛋白。在此，氨基酸的添加包括在原氨基酸序列中插入和在原氨基酸序列的末端追加这两者。

一实施方式的HCMV五聚体可以为：包含

序列号4中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的gH、

序列号5中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的gL、

序列号6中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的UL128、

序列号7中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的UL130、和

序列号8中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的UL131

的HCMV的五聚体蛋白。在此，1个以上氨基酸残基的缺失、置换或添加例如可以为1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～3个氨基酸残基的缺失、置换或添加。

一实施方式的HCMV五聚体可以为：包含

与序列号4中记载的氨基酸序列所构成的gH具有80％以上的序列同一性的gH、

与序列号5中记载的氨基酸序列所构成的gL具有80％以上的序列同一性的gL、

与序列号6中记载的氨基酸序列所构成的UL128具有80％以上的序列同一性的UL128、

与序列号7中记载的氨基酸序列所构成的UL130具有80％以上的序列同一性的UL130、和

与序列号8中记载的氨基酸序列所构成的UL131具有80％以上的序列同一性的UL131

的HCMV的五聚体蛋白。在此，80％以上的序列同一性例如可以为85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或98％以上的序列同一性。

一实施方式的GPCMV五聚体可以为：包含

序列号10中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的GP75、

序列号11中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的GP115、

序列号12中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的GP129、

序列号13中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的GP131、和

序列号14中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的GP133

的GPCMV的五聚体蛋白。在此，1个以上氨基酸残基的缺失、置换或添加例如可以为1～50个、1～40个、1～30个、1～20个、1～15个、1～10个、1～5个、1～3个氨基酸残基的缺失、置换或添加。

一实施方式的GPCMV五聚体可以为：包含

与序列号10中记载的氨基酸序列所构成的GP75具有80％以上的序列同一性的GP75、

与序列号11中记载的氨基酸序列所构成的GP115具有80％以上的序列同一性的GP115、

与序列号12中记载的氨基酸序列所构成的GP129具有80％以上的序列同一性的GP129、

与序列号13中记载的氨基酸序列所构成的GP131具有80％以上的序列同一性的GP131、和

与序列号14中记载的氨基酸序列所构成的GP133具有80％以上的序列同一性的GP133

的GPCMV的五聚体蛋白。在此，80％以上的序列同一性例如可以为85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或98％以上的序列同一性。

各亚单位可以为全长，例如可以仅为胞外域。gH优选为gH蛋白的胞外域。

CMV五聚体抗原可以使用CMV通过蛋白质纯化而制作，也可以通过基因工程的方法而制作。制作方法没有特别限定，例如可以通过如下方式得到：将构成野生型CMV五聚体的5个蛋白质的cDNA作为模板，设计引物，通过PCR得到核酸，与表达启动子功能性连接，根据情况也与标签连接，导入至适合的表达载体中，进行表达，使其折叠，形成五聚体结构，从而得到。CMV五聚体抗原也可以根据需要表达为分泌型蛋白。例如，通过将gH表达为胞外域(序列号4)的片段而不是全长(序列号9)，从而能够表达为分泌型蛋白。制作的CMV五聚体抗原可以根据需要进行纯化。纯化方法没有特别限定，可列举利用亲和色谱柱等的纯化。

改变型CMV五聚体抗原为通过突变导入而得的变体或通过糖链导入(糖链修饰)而得的变体时，可以如上所述地进行制作。

本发明的融合蛋白在局部兼具gB和五聚体的立体结构。gB和五聚体构成分子只要以一分子以上进行连接即可，其组合也可以适宜地进行选择。另外，按照gB和五聚体构成分子以一分子以上进行连接、其它分子不融合的方式表达时，这些也能够与连接状态的分子一起形成复合体，因此也可称为gB-五聚体融合蛋白。gB-五聚体融合蛋白可以以任意组合进行连接。

一实施方式的融合蛋白中，与gB蛋白构成分子以基因工程手段融合的五聚体的亚单位没有特别限定，1个gB蛋白构成分子与五聚体的亚单位中的任意1个以基因工程手段融合即可，与2个或3个gB蛋白构成分子分别以基因工程手段融合的五聚体的亚单位的组合也没有特别限定，例如与同源三聚体的3个gB蛋白构成分子分别融合的五聚体的构成亚单位可以为gL、UL128和UL130，与gB蛋白融合的五聚体的构成亚单位可以为UL128、UL130和UL131。

一实施方式的融合蛋白中，通过基因工程手段的融合可以为从N末端侧起按照gB蛋白、五聚体的顺序结合的融合(即，gB蛋白构成分子的C末端与五聚体的构成分子的N末端连接的融合)，也可以为从N末端侧起按照五聚体、gB蛋白的顺序结合的融合。从N末端侧起按照五聚体、gB蛋白的顺序结合的融合蛋白、即在gB蛋白的N末端侧结合有五聚体者有不易形成聚集体的倾向，因此优选。即，优选在通过基因工程手段的融合中至少1个融合为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合，更优选在通过基因工程手段的融合中至少2个融合为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合，特别优选3个通过基因工程手段的融合均为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合。

融合蛋白中，gB蛋白和五聚体可以直接结合，优选借助适宜的接头和/或标签而结合。认为融合蛋白通过在gB蛋白与五聚体之间具有适宜长度的接头，从而不会相互导致位阻，分别能够形成合适的结构。另外，融合蛋白通过在gB蛋白与五聚体之间具有标签，从而能够通过亲和纯化来进行纯化。另外，融合蛋白不限于在gB蛋白与五聚体之间、在融合蛋白的N末端侧或C末端侧也可以具有接头和/或标签。

作为接头，没有特别限定，本领域技术人员可以适宜地设计。可列举例如以Gly-Gly-Gly-Gly-Ser为单元的5个氨基酸的接头(序列号22)等，可列举例如使序列号22记载的氨基酸序列单元重复1～3次而成的氨基酸序列所构成的接头。

作为标签，没有特别限定，本领域技术人员可以适宜地选择。可列举例如多个组氨酸残基连接而成的His标签(例如，具有序列号30中记载的氨基酸序列的His标签)等。

进而，CMV的gB与五聚体的融合蛋白可以如实施例中记载那样通过将gB和五聚体以基因工程手段融合来制备。

〔核酸片段、重组表达载体、转化体〕

本发明的核酸片段为编码本发明的CMV的gB与五聚体的融合蛋白的核酸片段，本发明的重组表达载体为包含本发明的核酸片段的重组表达载体，本发明的转化体为导入了本发明的核酸片段或本发明的重组表达载体的转化体。

作为编码融合蛋白的核酸片段，只要在宿主中转录、表达该核酸片段时最终能够表达为gB和五聚体结合成的融合蛋白就没有特别限定。例如，可以通过将编码gB蛋白的核酸片段和编码五聚体的各亚单位的核酸片段进行功能性连接来得到。优选在这些核酸片段之间不包含终止密码子等会使转录中途停止的密码子。

编码野生型gB蛋白的核酸片段例如可以如下获得：使用可基于编码具有序列号1或序列号2中记载的氨基酸序列的野生型gB的基因设计的探针DNA，使用针对各种CMV的DNA的DNA印迹杂交的引物组或可基于该基因设计的引物组，以各种CMV的DNA为模板，通过PCR获得。

编码gB蛋白的变体的核酸片段例如可以通过以序列号1所示的碱基序列所构成的DNA为模板、将其供于易错PCR等而获得。或者，也可以通过导入位点特异性突变而得到。

编码gB蛋白的核酸片段可以通过人工合成编码基于序列号1～3、15、16、31等的氨基酸序列设计的氨基酸序列的核酸片段而得到。

编码野生型或改变型的五聚体的各亚单位、例如序列号4～8或序列号10～14的各亚单位的核酸片段也可以同样获得。

获得的上述核酸片段可以如下进行该核酸片段的碱基序列的确定：直接或用合适的限制酶等切割后利用常规方法整合到载体中，将得到的重组表达载体导入宿主细胞后，使用通常所用的碱基序列分析方法等碱基序列分析装置进行分析，从而进行确定。

重组表达载体中可利用的载体没有特别限定，可列举例如使用CAG启动子的pCAGGS载体、使用CMV启动子的pCMV载体等。

转化体可以通过将上述核酸片段或重组表达载体导入宿主细胞而得到。导入利用常规方法进行即可。作为宿主细胞，没有特别限定，可列举例如CHO细胞、HEK293细胞、SP2/0细胞、BHK细胞、NS0细胞等。

将转化体在适宜的培养基中培养，根据需要而诱导表达，从而表达本发明的融合蛋白，将其回收并根据需要进行纯化，由此可以得到本发明的融合蛋白。

〔疫苗〕

本发明的疫苗包含本发明的融合蛋白。一实施方式的疫苗为包含巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白作为抗原的、用于预防或治疗CMV的先天性感染的疫苗。即，本实施方式的疫苗为包含兼具两种抗原蛋白的功能的融合蛋白的亚单位疫苗。

关于本实施方式的疫苗中的蛋白抗原的含量，CMV的gB蛋白抗原和CMV五聚体抗原分别为0.1～1000μg即可，优选为1～100μg。

本实施方式的疫苗的剂形例如可以是液态、粉末状(冷冻干燥粉末、干燥粉末)、胶囊状、片剂、冷冻状态。

本实施方式的CMV疫苗可以包含对于药物而言可接受的载体。作为上述载体，可以没有限制地使用在疫苗制造中通常使用的载体，具体而言，可列举出盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗水性缓冲液和它们的组合。疫苗可以进一步适宜配混乳化剂、保存剂(例如，硫柳汞)、等渗剂、pH调节剂、灭活剂(例如，福尔马林)等。

为了进一步提高本实施方式的疫苗的免疫原性，也可以进一步包含佐剂。作为佐剂，例如可列举出铝佐剂或包含角鲨烯的水包油型乳浊佐剂(AS03、MF59等)、CpG和3-O-脱酰化-4’-单磷酰基脂A(MPL)等Toll样受体的配体、皂苷系佐剂、聚γ-谷氨酸等聚合物系佐剂、壳聚糖和菊糖等多糖类。

本实施方式的疫苗可以通过将作为CMV的gB与五聚体的融合蛋白的抗原和根据需要使用的载体、佐剂等混合而得到。佐剂可以为用时混合的佐剂。

本实施方式的疫苗的给药途径例如可以是经皮给予、舌下给予、滴眼给予、皮内给予、肌肉给予、经口给予、经肠给予、经鼻给予、静脉内给予、皮下给予、腹腔内给予、从口至肺的吸入给予。

本实施方式的疫苗的给予方法可以是例如通过注射器、经皮的贴片、微针、能移植的缓释性装置、带有微针的注射器、无针装置、喷雾进行给予的方法。

根据本实施方式的疫苗，能够预防或治疗CMV的经胎盘感染。经胎盘感染的预防是：通过对母体给予疫苗从而抑制CMV向胎儿的垂直感染；或者是抑制由于先天性感染而产生的各种症状的表现。这些可以通过使用了胎儿的羊水、新生儿的体液的基于核酸扩增法的检测、新生儿的头部超声波检测、头部CT检测、头部MRI检测或听觉筛查等来进行评价。经胎盘感染的治疗是：通过对先天性感染儿给予疫苗，从而抑制由于先天性感染而产生的各种症状的表现、发展。这些可以通过先天性感染儿的听力检查、视力检查、其它身体检查、精神发育检查等来进行评价。本实施方式的疫苗优选以育龄女性或女童为对象进行给予。从群体免疫的观点出发，也考虑以男性、男童、老年人为对象。另外，给药次数为1次至3次，其中，希望隔开2个月至几年的间隔进行多次接种。也可以测定血液中的抗体效价并将抗体为阴性或者抗体效价低的人作为接种对象。

实施例

以下基于实施例等更详细地说明本发明。但是，本发明不受以下实施例限定。

实施例1

＜抗原制备＞

人工合成编码源自AD169株的HCMV gB的胞外域(序列号15)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中(专利文献3)。设计成在C末端添加9个氨基酸的His-tag(序列号30)。将以其为基础且进行了氨基酸置换I132H、Y133R、T215E、W216A、R432T和R434Q者(序列号3)作为gB1-682-fm3Mv9(以下称为“gBv9”)(专利文献4)。表达gBv9时，在N末端插入有HCMV-gB的信号序列(MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVS)(序列号19)。

表达中使用Expi293表达系统(Life Technologies Ltd.)。使表达质粒转染细胞，4～6天回收培养上清。使用Ni NTA Agarose(QIAGEN公司)从包含gBv9的培养上清中进行纯化，相对于PBS+0.5M Arginine进行透析，得到HCMV gB蛋白的胞外域的纯化品。

另外，将gB胞外域(序列号15)的97-468位氨基酸和631-682位氨基酸之间用GGGSGSGGG(序列号20)的9个氨基酸连接，进而导入氨基酸置换Y131A、I132A、Y133A、W216A、R432T和R434Q，将所得者作为“gBΔd4”(序列号16)，以人工合成基因为基础，利用聚合物链反应(PCR)制作编码gBΔd4的DNA片段，将该DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中(与专利文献4的D1D2相同的分子)。表达gBΔd4时，N末端插入有HCMV-gB的信号序列(MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVS)(序列号19)，C末端插入有9个氨基酸的His-tag(序列号30)。表达和纯化通过与gBv9同样的方法进行。

分别人工合成编码UL128(序列号6)的基因、编码UL130(序列号7)的基因、和编码UL131(序列号8)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。

然后，通过PCR制作编码下述融合蛋白的DNA片并克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，所述融合蛋白在除去UL128(序列号6)的信号序列(1-27氨基酸)并于该位置插入人免疫球蛋白轻链信号肽序列(MRLPAQLLGLLMLWVPGSSG)(序列号21)而成的“信号肽置换UL128”或

除去UL130(序列号7)的信号序列(1-25氨基酸)并于该位置插入MRLPAQLLGLLMLWVPGSSG(序列号21)的氨基酸序列而成的“信号肽置换UL130”或

除去UL131(序列号8)的信号序列(1-18氨基酸)并于该位置插入MRLPAQLLGLLMLWVPGSSG(序列号21)的氨基酸序列而成的“信号肽置换UL131”

的C末端侧借助5个氨基酸的接头(GGGGS)(序列号22)添加有gBv9。其中，将信号肽置换UL128和gBv9连接而成者作为N-UL128-gB、将信号肽置换UL130和gBv9连接而成者作为N-UL130-gB、将信号肽置换UL131和gBv9连接而成者作为N-UL131-gB。

另外，通过PCR制作编码下述融合蛋白的DNA片段并克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，所述融合蛋白在gBv9的N末端插入有HCMV-gB的信号序列(MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVS)(序列号19)，从gBv9的C末端侧除去His-tag(序列号30)，借助5个氨基酸的接头(GGGGS)(序列号22)连接

除去了UL128(序列号6)的信号序列(1-27位氨基酸)的信号去除UL128或除去了UL130(序列号7)的信号序列(1-25位氨基酸)的信号去除UL130或除去了UL131(序列号8)信号序列(1-18位氨基酸)的信号去除UL131，

进而在其C末端侧添加有9个氨基酸的His-tag(序列号30)。其中，将信号去除UL128和gBv9连接而成者作为C-UL128-gB、将信号去除UL130和gBv9连接而成者作为C-UL130-gB、将信号去除UL131和gBv9连接而成者作为C-UL131-gB。

然后，通过PCR制作编码gBΔd4(序列号16)的373aa-381aa被去除并于该位置插入信号去除UL128或信号去除UL130或信号去除UL131的融合蛋白的DNA片段，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。需要说明的是，任意情况下均在N末端插入有HCMV-gB的信号序列(MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVS)(序列号19)。其中，将插入了信号去除UL128者作为Δd4-UL128-gB、将插入了信号去除UL130者作为Δd4-UL130-gB、将插入了信号去除UL131者作为Δd4-UL131-gB。

表达和纯化通过与HCMV的gB蛋白时同样的方法进行，得到下述的总计12种gB与五聚体构成蛋白的融合蛋白的纯化品：分别单独表达N-UL128-gB、N-UL130-gB和N-UL131-gB的情况以及共表达N-UL128-gB、N-UL130-gB和N-UL131-gB这3种的情况(N-UL128-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB)；分别单独表达C-UL128-gB、C-UL130-gB和C-UL131-gB的情况以及共表达C-UL128-gB、C-UL130-gB和C-UL131-gB这3种的情况(C-UL128-gB/C-UL130-gB/C-UL131-gB)；分别单独表达Δd4-UL128-gB、Δd4-UL130-gB和Δd4-UL131-gB的情况以及共表达Δd4-UL128-gB、Δd4-UL130-gB和Δd4-UL131-gB这3种的情况(Δd4-UL128-gB/Δd4-UL130-gB/Δd4-UL131-gB)。这里，在不会混淆的情况下，本说明书中有时将gB或其一部分与五聚体构成蛋白或其一部分的融合蛋白、以及在细胞中表达这些融合蛋白而得到的单体或多聚体、以及编码这些融合蛋白的基因或其DNA片段统称为“gB-五聚体构成蛋白融合体”。

＜蛋白纯化品的凝胶过滤色谱＞

利用凝胶过滤色谱评价了获得的纯化品的性状。色谱柱使用Superdex200Increase 5/150GL(GE Healthcare)，上样的是浓度100μg/mL的各纯化品。流速为0.4mL/分钟，流动相使用D-PBS(Wako)，测定波长280nm的吸光度。

＜结果＞

将凝胶过滤色谱的结果示于图1～3。所有表达物中都确认到聚集体。但是，与表达N-UL128-gB、N-UL130-gB、N-UL131-gB和N-UL128-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB的情况相比，表达C-UL128-gB、C-UL130-gB、C-UL131-gB和C-UL128-gB/C-UL130-gB/和C-UL131-gB的情况下、以及表达Δd4-UL128-gB、Δd4-UL130-gB、Δd4-UL131-gB和Δd4-UL128-gB/Δd4-UL130-gB/Δd4-UL131-gB的情况下，确认到聚集体含量增加。该结果表明，将UL128、UL130或UL131与HCMVgB蛋白融合时，融合于HCMV gB蛋白的N末端侧的方式不易形成聚集体，除聚集体以外的含量增加。

实施例2

＜抗原制备＞

通过实施例1的研究确认，将UL128、UL130或UL131融合于gB的N末端侧时聚集体含量下降，因此设计了将UL128、UL130或UL131融合于gB的N末端侧的如下所述的各gB-五聚体构成蛋白融合体。

在UL128(序列号6)中在C162S氨基酸置换的基础上还在C末端侧借助5个氨基酸的接头(GGGGS)(序列号22)添加gBv9，将所得者作为UL128(C162S)-gB。

在UL128(序列号6)中在C162S氨基酸置换的基础上还在C末端侧借助15个氨基酸的接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(序列号23)添加gBΔd4，将所得者作为UL128(C162S)-Δd4。

在UL128(序列号6)、UL130(序列号7)或UL131(序列号8)基因的C末端侧借助15个氨基酸的接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(序列号23)添加gBΔd4，其中，将N末端侧为UL128者作为UL128-Δd4、将N末端侧为UL130者作为UL130-Δd4、将N末端侧为UL131者作为UL131-Δd4。

将gBv9的S128aa-L138aa缺损、末端的R127和G139以甘氨酸接头GGG连接、W216aa-Y218aa缺损、在4处导入了N型糖链(D77N、I79T/E544N、P546T/L588N、P589G/K609N、R610T、M611T)者作为gBVC37(序列号31)(专利文献4)。表达gBVC37时，N末端插入有HCMV-gB的信号序列(MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVS)(序列号19)。

在UL128(序列号6)中在C162S氨基酸置换的基础上在C末端侧借助5个氨基酸的接头(GGGGS)(序列号22)添加gBVC37，将所得者作为UL128(C162S)-VC37。

在UL128(序列号6)、UL130(序列号7)或UL131(序列号8)基因的C末端侧借助5个氨基酸的接头(GGGGS)(序列号22)添加gBVC37，其中，将N末端侧为UL128者作为UL128-VC37、将N末端侧为UL130者作为UL130-VC37、将N末端侧为UL131者作为UL131-VC37。

通过PCR制作编码各gB-五聚体构成蛋白融合体的DNA片段，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，将所得者作为gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒。

另外，分别人工合成编码源自HCMV Merlin株的五聚体的胞外域中的gH(1-715aa、序列号4)的基因、编码源自HCMV Merlin株的五聚体的胞外域中的gL(1-278aa、序列号5)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。在此，设计成在gH的C末端添加9个氨基酸的His-tag(序列号30)(以下称为gH时，是指该添加了His-tag的序列)。

表达时，将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合而进行共表达。组合的表达质粒为下述的总计7种：

N-UL128-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB、

UL128(C162S)-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB、

UL128(C162S)-VC37/UL130-VC37/UL131-VC37、

UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、

UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、

gH/gL/UL128/UL130/UL131(五聚体)、

gBv9。gH/gL/UL128/UL130/UL131相当于HCMV五聚体的胞外域，以下称为“五聚体”。表达通过与HCMV gB蛋白时同样的方法进行，得到各gB-五聚体构成蛋白融合体的培养上清。另外，五聚体的纯化通过与HCMV gB蛋白时同样的方法进行。

＜免疫＞

以gBv9、五聚体为抗原对豚鼠(Hartley)进行免疫。各抗原以5μg/只的方式用生理盐水(大塚制药)来制备，作为佐剂，使用10v/v％的Alum(Invivogen vac-alu250)和50μg/只的CpG ODN1826(Eurofins)。将制备的抗原液以2周间隔对豚鼠(雌3只/组)进行3次肌肉内接种(100μL/单侧足、给予于两足)，末次免疫2周后，在异氟烷吸入麻醉下通过心脏采血而采集全血。得到的血液用加入了促凝剂的分离管分离血清。分离血清后，将3只量的血清合并，得到gBv9免疫血清和五聚体免疫血清。使用其评价gB-五聚体构成蛋白融合体对gBv9免疫血清和五聚体免疫血清的反应性评价。

＜使用血清的反应性分析＞

通过ELISA评价所获得的gB-五聚体构成蛋白融合体的培养上清对各种免疫血清的反应性(结合活性)。将Rabbit anti 6His Ab(BETHYL A190-114)用PBS(SIGMA)稀释成1μg/mL，向MaxiSorp plate(Nunc)中加入100μL，在4℃下孵育过夜，由此进行固相化。固相化后，用PBS洗涤板，以300μL/孔添加1％BSA/PBS液，静置1小时以上而进行封闭。封闭后，弃掉1％BSA/PBS液，将获得的培养上清10倍稀释并以100μL加入到板上的孔中，在室温下进行孵育。1小时后，用PBST洗涤，将各种免疫血清以100μL加入到板上的孔中，在室温下孵育。1小时后，用PBST洗涤，将检测抗体HRP-Rabbit anti Guinea Pig IgG(Invitrogen 614620)以100μL加入到板上的孔中，在室温下孵育。1小时后，用PBST洗涤，将TMB(SIGMA T-4444)以100μL加入到板上的孔中而使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，用酶标仪(Moleculardevices)测定显色值(O.D.450nm/650nm)。

＜蛋白纯化品的凝胶过滤色谱＞

利用凝胶过滤色谱评价了获得的纯化品的性状。色谱柱使用Superdex200Increase 5/150GL(GE Healthcare)，将浓度100μg/mL的各纯化品上样50μL。流速为0.4mL/分钟，电泳缓冲液使用D-PBS(Wako)，测定波长280nm的吸光度。

＜结果＞

将使用HCMV-gB免疫血清(gBv9免疫血清)和五聚体免疫血清的反应性分析结果示于图4。根据图4，UL128(C162S)-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB、UL128(C162S)-VC37/UL130-VC37/UL131-VC37、UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、N-UL128-gB/N-UL130-gB/N-UL131-gB中的任意组合的gB-五聚体构成蛋白融合体对HCMV-gB免疫血清和五聚体免疫血清这两者都具有反应性。另外，对UL128导入点突变C162S时，观察到对五聚体免疫血清的反应性提高。进而，gB-五聚体构成蛋白融合体的gB部分与gBv9相比，将gB部分设为gBVC37或gBΔd4的gB-五聚体构成蛋白融合体与五聚体免疫血清显著反应。

另外，将利用凝胶过滤色谱评价UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4和UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4的纯化品的结果示于图5。图中示出由各峰的位置推断出的各峰的主成分。根据图5，确认这些纯化品的三聚体含量增加。该结果表明，即使在HCMV gB蛋白和五聚体为野生型序列时，g B-五聚体构成蛋白融合体也对HCMV-gB免疫血清和五聚体免疫血清具有反应性，进而，通过在HCMV gB蛋白或五聚体中导入适宜的突变，从而能够以尤其维持了五聚体部分的本来结构的形态表达gB-五聚体构成蛋白融合体。

实施例3-1

＜抗原制备＞

实施例2的研究表明，通过将3种在与HCMV gB蛋白或五聚体相当的区域导入了突变的gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合共表达，从而能够表达保持了gB和五聚体的结构的gB-五聚体构成蛋白融合体。因此，为了将HCMV gB蛋白或五聚体的构成蛋白或gB-五聚体构成蛋白融合体中的3种以上蛋白组合共表达，进一步设计了下述的各gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒。

将gH(序列号4)克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，将所得者作为gH(His-)。另外，将编码在gL(序列号5)中引入了氨基酸置换C144S者的DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，将所得者作为gL(C144S)。

另外，在gL(序列号5)的C末端侧借助15个氨基酸的接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(序列号23)添加gBVC37或gBΔd4。其中，将C末端侧为gBVC37者作为gL-VC37-L15aa、将C末端侧为Δd4者作为gL-Δd4，利用PCR制作编码各gB-五聚体构成蛋白融合体的DNA片段，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。

另外，在UL128(序列号6)或UL130(序列号7)或UL131(序列号8)的C末端侧借助15个氨基酸的接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(序列号23)连接gBVC37。其中，将N末端侧为UL128者作为UL128-VC37-L15aa、将N末端侧为UL130者作为UL130-VC37-L15aa、将N末端侧为UL131者作为UL131-VC37-L15aa，将编码各gB-五聚体构成蛋白融合体的DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。

将上述各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合进行共表达。组合的表达质粒为表1所示的总计31种。表达通过与HCMV gB蛋白时同样的方法进行，得到各gB-五聚体构成蛋白融合体的培养上清。另外，纯化通过与HCMV gB蛋白时同样的方法进行，得到各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品。

【表1】

<使用血清的反应性分析>

通过与实施例2同样的方法评价了所获得的gB-五聚体构成蛋白融合体的培养上清或纯化品对各种免疫血清的反应性(结合活性)。其中，与实施例2不同的是，培养上清使用了100倍稀释品、另外在使用纯化品代替培养上清进行试验时以1μg/mL与固相抗体进行反应。

将评价的结果示于图6～9。由图6～9的结果可确认，首先与UL128(C162S)-VC37/UL130-VC37/UL131-VC37相比，gH(His-)/gL(C144S)/UL128(C162S)-VC37/UL130-VC37/UL131-VC37对五聚体免疫血清的反应性提高，另外与UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4相比，gH(His-)/gL(C144S)/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4对五聚体免疫血清的反应性提高。由此认为，通过包含gH和gL，gB-五聚体构成蛋白融合体容易采取本来的五聚体结构。

另外观察到，与UL128(C162S)-VC37/UL130-VC37/UL131-VC37相比，UL128(C162S)-VC37/UL130/UL131对五聚体血清的反应性低，与UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4相比，UL128(C162S)-Δd4/UL130/UL131对五聚体血清的反应性低，与gH(His-)/gL(C144S)/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4相比，gH(His-)/gL(C144S)/UL128(C162S)-Δd4/UL130/UL131对五聚体血清的反应性低。由此认为，五聚体构成分子中的3个分子以gB-五聚体构成蛋白融合体形式来表达的方式较佳。

另外观察到，与UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4相比，UL128(C162S)-Δd4/UL130/UL131/Δd4、UL128(C162S)/UL130-Δd4/UL131/Δd4、UL128(C162S)/UL130/UL131-Δd4/Δd4的反应性低。由此认为，对于使gB-五聚体构成蛋白融合体中五聚体部分形成天然结构而言，使未与五聚体构成蛋白融合的gB进行共表达的方法无效。

另外观察到，与gH(His-)/gL-VC37-L15aa/UL128-VC37-L15aa/UL130-VC37-L15aa/UL131、gH(His-)/gL-VC37-L15aa/UL128-VC37-L15aa/UL130/UL131-VC37-L15aa、gH(His-)/gL-VC37-L15aa/UL128/UL130-VC37-L15aa/UL131-VC37-L15aa相比，gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130/UL131-Δd4、gH(His-)/gL-Δd4/UL128/UL130-Δd4/UL131-Δd4与gBv9免疫血清、五聚体免疫血清的反应性高，与gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130/UL131-Δd4、gH(His-)/gL-Δd4/UL128/UL130-Δd4/UL131-Δd4相比，gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131与gBv9免疫血清和五聚体免疫血清的反应性高。由此认为，以不使UL128、UL130和UL131中的任意者与gB融合的分子的方式表达gB-五聚体构成蛋白融合体时，通过使gB部分为Δd4型，gB、五聚体表达成接近天然的结构，特别是不使UL131与gB融合的分子的情况下，关于五聚体的结构的该倾向变得更显著。

＜蛋白纯化品的凝胶过滤色谱＞

利用凝胶过滤色谱评价了获得的纯化品的性状。色谱柱使用Superdex200Increase 5/150GL(GE Healthcare)，将浓度100μg/mL的各纯化品上样50μL。流速为0.4mL/分钟，电泳缓冲液使用D-PBS(Wako)，检测波长280nm的吸光度。

将评价的结果示于图10～13。已确认，使五聚体构成蛋白中的1个五聚体构成分子与作为gB的VC37或Δd4融合的gB-五聚体构成蛋白融合体、其它4个五聚体构成蛋白、和未与五聚体构成蛋白融合的VC37或Δd4共表达的情况下，除聚集体以外的含量高(图10)，使五聚体构成蛋白中的1个五聚体构成分子与作为gB的VC37或Δd4融合的gB-五聚体构成蛋白融合体、和其它4个五聚体构成蛋白共表达的情况下(未共表达未与五聚体构成蛋白融合的VC37或Δd4)，聚集体为主峰(图11的(b))。使五聚体构成蛋白中的3个五聚体构成分子与gB融合的情况下，可观察到除聚集体以外的含量高的倾向(图11～13)，gH(His-)/gL-Δd4/UL128/UL130-Δd4/UL131-Δd4(图13的(b))的情况下，聚集体为主峰。

＜抗体效价测定＞

通过与实施例2同样的方法对获得的gB-五聚体构成蛋白融合体进行免疫，获得免疫血清。使用该血清，评价了针对HCMV的gB蛋白、五聚体的结合抗体效价和中和抗体效价。

为了评价结合抗体效价，首先将gBv9或五聚体用PBS(Wako)稀释成1μg/mL，向MaxiSorp plate(Nunc)中加入100μL，在4℃下静置一晚而使抗原固相化。固相化后，用PBS洗涤板，以300μL/孔添加1％BSA/PBS液，静置1小时以上而进行封闭。封闭后，弃掉1％BSA/PBS液，以100μL/孔添加用1％BSA/PBS液阶梯稀释的血清，在室温下静置1小时后，用PBST洗涤。向其中以100μL/孔添加用1％BSA/PBS液稀释5000倍的HRP-Rabbit anti Guinea PigIgG(H+L)(invitrogen：614620)，在室温下静置1小时后，用PBST洗涤。以100μL/孔向其中添加TMB(sigma：T4444)，在室温下静置30分钟后，添加1N硫酸而使反应停止，用酶标仪(Moleculardevices)测定显色值(O.D.450nm/650nm)。

将结果示于图14。根据图14的结果，在免疫了gH(His-)/gL-VC37-L15aa/UL128-VC37-L15aa/UL130-VC37-L15aa/UL131和gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131的豚鼠血清中确认到了gB结合抗体(图14的(a))和五聚体结合抗体(图14的(b))，因此认为，通过将两gB-五聚体构成蛋白融合体作为疫苗抗原进行免疫，由此能够诱导gB抗体和五聚体抗体。

接着，为了评价中和抗体效价，使用MRC-5细胞进行成纤维细胞中和试验，另外使用ARPE-19细胞进行上皮细胞中和试验。成纤维细胞中和试验中，使用利用MRC-5细胞将HCMV AD-169株传代而得的病毒作为试验用的病毒，上皮细胞中和试验中使用利用ARPE-19细胞将HCMV AD-169株传代而得的病毒作为试验用的病毒。

成纤维细胞中和试验中，使用MRC-5按照以下的步骤进行。首先，准备MRC-5悬浮液，以2×10

上皮细胞中和试验中，使用ARPE-19，通过与成纤维细胞中和试验几乎同样的步骤进行。其中，与成纤维细胞中和试验不同的是，作为病毒，使用利用ARPE-19细胞进行传代驯化的HCMV AD-169株、另外将包含终浓度7～8×10

实施例3-2-1

＜抗原制备＞

实施例3-1的研究表明，即使将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒中的5种组合并进行共表达，也能够保持gB、五聚体的结构，因此，为了进一步详查gL的C144和UL128的C162的点突变的影响而设计了下述各gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒。通过PCR制作了编码下述融合蛋白的DNA片段，所述融合蛋白在gL(序列号5)中除了氨基酸置换C144S以外还在C末端侧添加有15个氨基酸的接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(序列号23)、Δd4，将该DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，将所得者作为gL(C144S)-Δd4。表达时，将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合进行共表达。所组合的表达质粒为下述的总计3种：gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL(C144S)-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131。另外，纯化通过与HCMV gB蛋白时同样的方法进行，得到各gB-五聚体构成蛋白融合体的纯化品。

＜免疫＞

通过与实施例2同样的方法，将gBΔd4或五聚体或gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131或盐水免疫于豚鼠(Hartley)，得到gBΔd4免疫血清和五聚体免疫血清和gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清和盐水免疫血清。

＜使用血清的反应性分析＞

对于获得的gB-五聚体构成蛋白融合体，通过与实施例2同样的方法评价对gBΔd4、五聚体(PC)、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131(Δd4/PC)和盐水免疫血清的反应性(结合活性)。将其示于图16～19。该结果表明，gL的C144和UL128的C162的点突变对与血清的反应性没有影响。

＜蛋白纯化品的凝胶过滤色谱＞

通过凝胶过滤色谱评价所获得的gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131和gH(His-)/gL(C144S)-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131的纯化品的性状。色谱柱使用Superdex200 Increase 5/150GL(GE Healthcare)，将浓度100μg/mL的各纯化品上样50μL。流速为0.4mL/分钟，电泳缓冲液使用D-PBS(Wako)，检测波长280nm的吸光度。将结果示于图20。该结果和图12的(d)表明，gL的C144和UL128的C162的点突变导入未改变凝胶过滤色谱的分离图案。

＜蛋白纯化品的粒径评价＞

通过动态光散射评价了所获得的gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL(C144S)-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131融合蛋白的粒径分布。将各重组蛋白用PBS(SIGMA)稀释成0.2或0.3mg/mL，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern)实施粒径分析。测定中使用石英皿，测定条件为温度25.0℃。将其示于图21。需要说明的是，图21的(a)、(b)、(c)的峰示出3次的结果，表中所示的数字为3次的平均值。该结果表明，gL的C144和UL128的C162的点突变导入未影响粒径分布。

实施例3-2-2

＜抗原制备＞

将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合进行共表达。组合的表达质粒为下述的总计2种：gH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4。另外，纯化均通过与HCMV的gB蛋白时同样的方法来进行，得到蛋白纯化品。

＜蛋白纯化品的凝胶过滤色谱＞

利用凝胶过滤色谱评价了获得的纯化品的性状。色谱柱使用Superdex200Increase 5/150GL(GE Healthcare)，将浓度100μg/mL的各纯化品上样50μL。流速为0.4mL/分钟，电泳缓冲液使用D-PBS(Wako)，检测波长280nm的吸光度。将结果示于图28。该结果表明，UL128的C162的点突变导入未改变利用凝胶过滤色谱得到的峰的洗脱位置。

＜蛋白纯化品的粒径评价＞

通过动态光散射评价了所获得的gH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4融合蛋白的粒径分布。将各重组蛋白用PBS(SIGMA)稀释成0.2或0.3mg/mL，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern)实施粒径分析。测定中使用石英皿，测定条件为温度25.0℃。将其示于图29。需要说明的是，图29的峰示出3次的结果，表中所示的数字为3次的平均值。该结果表明，UL128的C162的点突变导入对粒径分布没有影响。

实施例3-2-3

＜抗原制备＞

将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合进行共表达。所组合的表达质粒为下述总计4种：gBv9、五聚体、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131和gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4。另外，纯化均通过与HCMV的gB蛋白同样的方法来进行，得到蛋白纯化品。

＜免疫＞

通过与实施例2同样的方法，将gBv9、五聚体、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4或盐水免疫于豚鼠(Hartley)，得到gBv9免疫血清、五聚体免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4免疫血清和盐水免疫血清。

＜使用血清的结合抗体效价测定＞

对于获得的gB-五聚体构成蛋白融合体，通过与实施例2同样的方法评价对gBv9免疫血清、五聚体免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4免疫血清和盐水免疫血清的反应性(结合活性)。将结合抗体效价的评价结果示于图30。根据该结果，认为通过给予gB-五聚体构成蛋白融合体能够诱导gB抗体和五聚体抗体。

＜使用血清的中和抗体效价测定＞

使用所获得的gBv9免疫血清、五聚体免疫血清、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4免疫血清和盐水免疫血清，通过与实施例3-1同样的方法评价中和抗体效价。其中，与实施例3-1不同的是，使用MRC-5细胞的成纤维细胞中和试验、使用ARPE-19细胞的上皮细胞中和试验中，作为病毒，均使用利用ARPE-19细胞进行传代驯化的HCMV AD-169株。将中和抗体效价的评价结果示于图31。

由图30可确认，在gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131免疫血清、和gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4免疫血清中确认到gB结合抗体(图30的(a))和五聚体结合抗体(图30的(b))，因此可认为两种gB-五聚体构成蛋白融合体可通过作为疫苗抗原进行免疫而诱导抗gB抗体和抗五聚体抗体。图31表明，通过给予gB-五聚体构成蛋白融合体的gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、和gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4，能够诱导抵抗HCMV侵入成纤维细胞和上皮细胞的中和抗体。

实施例4

＜gB-五聚体融合蛋白的稳定性评价＞

将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合进行共表达。所组合的表达质粒为下述总计6种：gBv9、五聚体、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131。另外，纯化均通过与HCMV的gB蛋白时同样的方法进行，得到蛋白纯化品。

通过动态光散射评价所获得的重组gB、重组五聚体、重组gB与重组五聚体的等量混合物、重组gB-五聚体构成蛋白融合体的稳定性。将各重组蛋白用PBS(SIGMA)稀释为0.2mg/mL，在37℃下静置0天、1天、3天、7天而进行加速试验。此时，向静置1天以上的蛋白中添加1/100量的蛋白酶抑制剂(Wako、165-26021)，对于各试验后的蛋白利用ZetasizerNano ZS(Malvern)实施粒径分析。测定中，使用石英皿，测定条件为温度25.0℃。在得到的粒径分布中，将认为是目标物的粒径(＜100nm)的颗粒记作“单颗粒”，将比目标物大且粒径小于1000nm者记作“聚集(小)”，将粒径超过1000nm者记作“聚集(大)”。

将表示各颗粒的分布的图示于图22、23和32。根据该结果，五聚体的情况下观察到聚集(大)的含量经时增加，gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、和gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131基本以单体状态存在。该结果表明，gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4、和gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131与五聚体相比稳定性提高。

实施例5

＜抗原制备＞

作为刺激抗原，通过与实施例4同样的步骤进行gBv9、五聚体、gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4的表达纯化。

＜细胞免疫评价＞

使用人PBMC的细胞免疫评价通过使用Human IFN-γELISpot

将CTL Anti-Aggregate Wash(20×)(CTL)在设于37℃的水浴中放置10分钟而解冻，用RPMI-1640稀释制备CTL Anti-Aggregate Wash(1×)，在37℃的CO

将所需数量的Human IFN-γELISpot

将2个孔的斑点数的平均值作为测定结果。需要说明的是，仅阴性对照情况下将4个孔的斑点数的平均值作为测定结果。斑点数的平均值大于0且小于5时给予“0”的评分，为5以上且小于50时给予“1”的评分，为50以上且小于100时给予“2”的评分，为100以上时给予“3”的评分，对每种抗原，将全部供体的评分相加。对其作图并示于图24。根据该结果认为，与gBv9和五聚体相比，gH(His-)/gL-Δd4/UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131、gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4产生了更多的IFNγ。

实施例6

＜GPCMV-gB的制备＞

为了使用豚鼠经胎盘感染模型系统进行评价，使用对豚鼠显示出感染性的豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)。由于重组GPCMV gB蛋白有时包含聚集体，因此制作了不包含聚集体的、性状得到改善的改变GPCMV gB蛋白。

人工合成了编码在源自GPCMV 22122株的gB的胞外域(1-656aa)添加了信号序列、且导入了氨基酸突变以改善性状的gB(序列号17、1-692aa；GPCMV-gB胞外域变体)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。设计成在gB的C末端添加有9个氨基酸的His-tag(序列号30)。表达时使用Expi293表达系统(Life Technologies Ltd.)。将表达质粒转染至细胞，回收了培养4～6天的上清液。从包含GPCMV gB的培养上清液中，使用Ni NTA Agarose(QIAGEN公司)进行纯化，对PBS+0.5M精氨酸进行透析，得到改变GPCMV gB蛋白的胞外域(以下称为“GPCMV-gB”)的纯化品(国际申请PCT/JP2019/047966号)。

＜GPCMV五聚体的制备＞

接着，制备了源自GPCMV 22122株的五聚体的胞外域。不存在关于GPCMV五聚体的胞外域的可溶性表达的报告例，因此参考HCMV五聚体的胞外域的可溶性表达的报告例(非专利文献14)，如下所述进行设计，构建了表达质粒。

人工合成编码作为HCMV的gH的直系同源物的GPCMV的GP75(序列号10)中的胞外域的1-698aa(序列号18)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。设计成在GP75的C末端添加有9个氨基酸的His-tag(序列号30)。进而，分别人工合成编码作为HCMV的gL的直系同源物的GPCMV的GP115(1-258aa、序列号11)的基因、编码作为HCMV的UL128的直系同源物的GPCMV的GP129(1-179aa、序列号12)的基因、编码作为HCMV的UL130的直系同源物的GPCMV的GP131(1-192aa、序列号13)的基因、编码作为HCMV的UL131的直系同源物的GPCMV的GP133(1-127aa、序列号14)的基因，克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中。使以上5种蛋白共表达。表达和纯化通过与GPCMV-gB时同样的方法进行，得到GPCMV五聚体的胞外域(以下称为“GPCMV五聚体”)纯化品(国际申请PCT/JP2019/047966号)。

＜GPCMV-gB-五聚体融合蛋白的制备和性状分析＞

然后，将用GGGSGSGGG(序列号20)这9个氨基酸连接GPCMV-gB胞外域变体(序列号17)的111-475aa和641-692aa、进而在该C末端添加His-tag序列(序列号30)者作为GPCMV-Δd4(序列号32)，通过PCR制作编码GPCMV-Δd4的DNA片段，将该DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo。另外，设计在编码GP75的胞外域的基因的C末端未添加His-tag者，通过PCR制作编码该蛋白的DNA片段，将该DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，将所得者作为GP75(His-)。

然后，以上述基因为基础，通过PCR制作编码在GP115、GP129、GP131或GP133的C末端侧借助15个氨基酸的接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(序列号23)连接GPCMV-Δd4的融合蛋白的DNA片段，将该DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，将所得者分别作为GP115-Δd4、GP129-Δd4、GP131-Δd4或GP133-Δd4。表达时，将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合进行共表达。所组合的表达质粒为GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133、GP75(His-)/GP115/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4。表达和纯化通过与GPCMV-gB时同样的方法进行。

利用凝胶过滤色谱实施分析(图25的(a)、(b))的结果是，GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133的情况下在与HCMV的gH(His-)/gL-Δd4/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131(实施例3-2-1、图20的(a))同样的位置确认到峰，GP75(His-)/GP115/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4的情况下在与HCMV的gH(His-)/gL/UL128-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4(实施例3-2-2、图28的(b))同样的位置确认到峰。

＜GPCMV-Δd4-ULs的制备和性状分析＞

然后，以上述基因为基础，通过PCR制作编码在GP133的C末端侧借助15个氨基酸的接头(GGGGSGGGGSGGGGS)(序列号23)连接GPCMV-Δd4的融合蛋白的DNA片段，将该DNA片段克隆到pCAGGS1-dhfr-neo中，将所得者作为GP133-Δd4。另外，将以GP129-Δd4为基础且加入了认为可使GP115与GP129的二硫键部位解离的C167S改变者作为GP129(C167S)-Δd4。表达时，将各种gB-五聚体构成蛋白融合体表达质粒组合而进行共表达。所组合的表达质粒为GP129(C167S)-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4。表达和纯化通过与GPCMV-gB同样的方法进行，得到GP129(C167S)-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4(GPCMV-Δd4-ULs)纯化品。

利用凝胶过滤色谱实施分析(图25的(c))的结果是，GP129(C167S)-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4的情况下在与HCMV的UL128(C162S)-Δd4/UL130-Δd4/UL131-Δd4(实施例3-1、图11的(c))同样的位置观察到峰。

＜胎盘感染防御试验＞

对于Hartley豚鼠(雌、5周龄)免疫GPCMV-gB、GPCMV五聚体、GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133和GP129(C167S)-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4(GPCMV-Δd4-ULs)。对于各抗原，以0.0016μg/只的方式用生理盐水(大塚制药)进行制备，作为佐剂，使用10v/v％的Alum(Invivogen vac-alu250)和50μg/只的CpG ODN1826。将制备的抗原液以2周间隔对豚鼠进行2次肌肉内接种(100μL/单侧足、给予后肢两足)，在2次免疫的2周后与Hartley豚鼠(♂、9周龄以上)进行交配，制备妊娠豚鼠。此时PBS给予组也同样地进行交配。免疫组、PBS组(盐水组)均在妊娠4周龄时刻以1×10

【表2】

表2.引物及探针

将每10

实施例7

＜经胎盘感染防御试验＞

通过与实施例6同样的方法表达制备GPCMV-gB、GPCMV五聚体、GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133、GP75(His-)/GP115/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4。

对于Hartley豚鼠(雌、5周龄)，以0.2μg/只的用量通过与实施例6同样的方法免疫GPCMV-gB、GPCMV五聚体、GPCMV-gB与GPCMV五聚体的混合、GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133、GP75(His-)/GP115/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4并进行交配。关于GPCMV-gB与GPCMV五聚体的混合，将各0.1μg混合并设为0.2μg/只。另外，此时PBS给予组也同样地进行交配。免疫组、PBS组(盐水组)均在妊娠4周龄时刻以1×107pfu/只皮下给予野生型GPCMV进行攻击。攻击起3周后用戊巴比妥钠实施安乐死后，进行母体、胎儿的解剖，从母体收集唾液腺和胎盘，从胎儿收集胰腺。分别将母体的唾液腺和胎盘与适量的PBS一起用gentleMACS(Miltenyi Biotec)破碎。胎儿的胰腺与适量的PBS一起用FastPrep24(MPBiomedicals)破碎。对于母体的唾液腺、胎盘、胎儿的胰腺，用MagNA Pure96(Roche)对各自的匀浆液进行DNA提取。从得到的DNA中，通过与实施例6同样的方法进行每105个细胞的病毒拷贝数的定量。此时，定量下限值设为每10

将该结果示于图27。GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133、GP75(His-)/GP115/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4的免疫组中，确认完全防御了胎儿的感染。另外，母体、胎盘中也观察到了明显的感染抑制效果。GP75(His-)/GP115-Δd4/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133、GP75(His-)/GP115/GP129-Δd4/GP131-Δd4/GP133-Δd4对母体和胎儿这两者均显示效果，因此强烈暗示了本发明的疫苗抗原不仅对于预防先天性感染有用，而且对于健康者、移植患者、AIDS患者等的巨细胞病毒感染症的预防也有效。

序列表

<110> KM生物医薬股份公司（KM Biologics Co., Ltd.）

<120> 巨细胞病毒的gB与五聚体的融合蛋白和包含该融合蛋白的疫苗

<130> FP21-0270-00

<150> JP2020-100100

<151> 2020-06-09

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 906

<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

<223> HCMV AD169 gB

<400> 1

Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile

1 5 10 15

Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr

20 25 30

Ser Ser Thr His Asn Gly Ser His Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln

35 40 45

Thr Arg Ser Val Tyr Ser Gln His Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser

50 55 60

His Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp

65 70 75 80

Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met

85 90 95

Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Ile Cys Thr

100 105 110

Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val

115 120 125

Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln

130 135 140

Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser Tyr Ala Tyr Ile Tyr Thr Thr Tyr

145 150 155 160

Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile

165 170 175

His His Ile Asn Lys Phe Ala Gln Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val

180 185 190

Ile Gly Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn

195 200 205

Lys Thr Met Gln Leu Ile Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr

210 215 220

Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Thr Trp

225 230 235 240

Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Leu Thr Ile Thr Thr

245 250 255

Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp

260 265 270

Val Val Tyr Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser

275 280 285

Tyr Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr

290 295 300

Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro Asn Ala Ala Pro Glu Thr His Arg

305 310 315 320

Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile

325 330 335

Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser

340 345 350

Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser

355 360 365

Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met

370 375 380

Ser Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu

385 390 395 400

Gln Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly

405 410 415

Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Ser Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln

420 425 430

Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg

435 440 445

Ser Ser Leu Asn Ile Thr His Arg Thr Arg Arg Ser Thr Ser Asp Asn

450 455 460

Asn Thr Thr His Leu Ser Ser Met Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr

465 470 475 480

Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg

485 490 495

Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr

500 505 510

Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu

515 520 525

Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val

530 535 540

Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val

545 550 555 560

Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg

565 570 575

Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly

580 585 590

Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu

595 600 605

Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala

610 615 620

Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser

625 630 635 640

Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu

645 650 655

Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg

660 665 670

Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser

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<212> PRT

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<220>

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<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

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<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

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<220>

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<400> 8

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<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

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Lys Leu His Lys Thr His Leu Ala Ser Phe Leu Ser Ala Phe Ala Arg

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740

<210> 10

<211> 723

<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

<223> GP75

<400> 10

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515 520 525

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

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<210> 12

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<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

<223> GP129

<400> 12

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1 5 10 15

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<210> 13

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<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

<223> GP131

<400> 13

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1 5 10 15

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180 185 190

<210> 14

<211> 127

<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

<223> GP133

<400> 14

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1 5 10 15

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<210> 15

<211> 682

<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

<223> gB1-682

<400> 15

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1 5 10 15

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Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile His His Ile Asn Lys Phe Ala Gln

145 150 155 160

Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val Ile Gly Gly Thr Val Phe Val Ala

165 170 175

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Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys

580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu

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Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val

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675 680

<210> 16

<211> 433

<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

<223> gB 德尔塔 d4

<400> 433

Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His

1 5 10 15

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65 70 75 80

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Asn Ala Ala Pro Glu Thr His Arg Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala

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Pro

<210> 17

<211> 692

<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

<223> GPCMV gB 胞外域

<400> 17

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1 5 10 15

Trp Arg Gly Thr Trp Thr Ser Ala Leu Thr Ile Leu Tyr Leu Gly Val

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Tyr Cys Glu Ser Thr Thr Val Thr Pro Thr Thr Val Glu Asp Thr Thr

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130 135 140

His Arg Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Arg Glu Phe Val Ala Leu

145 150 155 160

Pro Met Trp Glu Ile Phe Leu Val Asn Ser Arg Gly Gln Cys Tyr Thr

165 170 175

Ser His Gln Arg Val Ile Gly Ala Asp Arg Tyr Ile Ala Tyr His Asn

180 185 190

Asp Asn Glu Val Asn Glu Thr Met Trp Leu Met Arg Asp Asp Met Gly

195 200 205

Asn Asp Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile Thr Val Lys Glu His Ala Arg Thr

210 215 220

Pro Gly Ser Val Ala Phe His Lys Glu Thr Cys Ser Met Asn Cys Ile

225 230 235 240

Val Thr Lys Thr Lys Gly Lys Ser Lys Phe Pro Tyr Asp Met Phe Val

245 250 255

Leu Pro Ser Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Ser

260 265 270

Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gln Arg Glu Lys Phe His Ile Trp Ser

275 280 285

Asn Tyr Ser Ile Leu Lys Asp Phe Gly Ser Arg Ala Leu Glu Ala Arg

290 295 300

Ile Val Pro Lys Met Ala Phe Tyr Glu Arg Glu Asp Val Val Ile Gly

305 310 315 320

Trp Glu Val Asn Asp Gln Ser Asn Val Thr Cys Glu Met Ile Leu Trp

325 330 335

Glu Thr Val Asp Arg Ala Ile Arg Thr Glu Tyr Glu Asn Ala Phe His

340 345 350

Tyr Val Ala Arg Thr Leu Thr Ser Thr Phe Val Glu Asn Lys Tyr Ser

355 360 365

Pro Asp Asn Asn Leu Thr Glu Asp Asp Ile Lys Cys Phe Lys Asn Asp

370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

Arg Lys Arg Ser Leu Pro Asp Glu Ser Thr Gly Asp Ile Ser Tyr Ala

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Leu Gly His Ile Ala Glu Ala Trp Cys Leu Asp Gln Lys Arg Thr Ala

485 490 495

Glu Val Leu His Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ser

500 505 510

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515 520 525

Ser Leu Ala Lys Cys Ile Glu Val Asn Gln Ser Thr Val Leu Ile Lys

530 535 540

Gly Asp Met Arg Lys Phe Ser Asp Asp Gly Lys Leu Glu Gly Cys Tyr

545 550 555 560

Ser Arg Pro Val Val Trp Phe Ser Met Lys Asn Ser Thr Glu Val Arg

565 570 575

Leu Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Thr His Arg

580 585 590

Met Glu Thr Cys Gln Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Phe Val Ala Gly Asp

595 600 605

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Ser Glu Ile Asp Ile Ile Asp Thr Met Ile Ala Leu Lys Thr Glu Pro

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Leu Glu Asn Ile Asp Phe Lys Val Leu Glu Leu Tyr Ser Arg Asp Glu

645 650 655

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660 665 670

Asn Tyr Gln Lys Lys Arg Leu Asp Phe Val Val Glu Arg Val Ile Asn

675 680 685

Pro Ile Pro Pro

690

<210> 18

<211> 698

<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

<223> GP75 胞外域

<400> 18

Met Ser Pro Ala Thr Arg Phe Thr Val Ile Ser Cys Leu Val Val Ser

1 5 10 15

Leu Ile Thr Pro Ser Glu Thr Ser Ser Trp Phe Asp Pro Phe Ile Glu

20 25 30

Trp Ala Arg Ser Ser Pro Asn Met Thr Cys Val Asn Asn Arg Thr Gly

35 40 45

Thr Arg Ser Leu Ala Thr Glu Gly Leu Ile Ser Phe Asn Phe Tyr Glu

50 55 60

Ala Ser Arg Thr Val Arg Thr Tyr Gln Val Pro Lys Cys Ile Phe Met

65 70 75 80

Ser Ser Val Ser Lys Thr Ile Met Gln Gly Val Asp Leu Phe Glu Ser

85 90 95

Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Arg Tyr Tyr Ser Tyr Ile Ile Val Pro Val

100 105 110

His Ala Ser Phe Gln Ile Phe Ile His Asp Leu Arg Thr Asp Leu Ser

115 120 125

Ser Pro Thr Glu Glu Leu Thr Ser Pro Val Asp Lys Thr Leu Pro Asn

130 135 140

Val Thr Ile Trp His Thr Pro Ser Gly Tyr Val Ile Arg Leu Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Thr Pro Arg Phe Glu Glu Cys Thr Leu Phe Pro Asn His Thr

165 170 175

Val Ile Phe Asp Met Thr Val Pro Cys Ser Gln Glu Val Tyr Leu Arg

180 185 190

Gln Thr Gly Lys His Gln Phe Ala Ile Val Leu Thr Phe Thr Pro Ser

195 200 205

Phe Phe Val Leu Asn Ile Gln Thr Ala Gln His Gln His Val Thr Glu

210 215 220

Asn Asp Glu Asp Val Ile Leu Ile Phe Gly Asp Val Arg Ser Ile Asp

225 230 235 240

Val Lys Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Val Leu Thr Leu Arg Gln Ser Tyr

245 250 255

Arg Asp Asp Leu Leu Ile Val Ala Lys Thr Ser Ile Val Asn Ala Thr

260 265 270

Tyr Pro Phe Ile Lys Thr Gln Asp Phe Leu Lys Gly Thr Leu Ser Gly

275 280 285

Asn Tyr Leu Asp Phe Asn His Val Tyr Thr Glu Phe Asn Arg Leu Val

290 295 300

Ile His Asn Leu Val Glu Gly Leu Cys Asp Ala Pro Pro Asp Asp Arg

305 310 315 320

Thr Val Ser Met Val Phe Ser Tyr Ala Val Leu Ala Arg Thr Leu Tyr

325 330 335

His Thr Ser Asn Val Thr Ala Arg Leu Glu Asp Val Ala Leu Arg Tyr

340 345 350

Val Arg Leu Thr Leu Ala Arg Thr Phe Leu Gln Gln Cys Phe Asp Val

355 360 365

Gly Pro Arg Tyr Met Arg Phe Pro Thr Ile Asp Gly Ala Leu Ser Val

370 375 380

Leu Leu Lys Leu Ile Arg Asn Ser Arg Asp Val Asp Gly Gly Leu Lys

385 390 395 400

Leu Ser Leu Thr Phe Ala Leu Ile Phe Gly Asn Asn Thr Asp Met Thr

405 410 415

Lys Glu Arg Asp Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Glu Met Lys Ser Ile His

420 425 430

Arg Ala Gly Leu Val Ser Pro Leu Ser Pro Arg Gln Arg Ser Leu Leu

435 440 445

Tyr Met Met Ala Tyr Val Thr His His Thr Thr Ala Phe Pro Asp Ile

450 455 460

Arg Arg Glu Met Leu Ala Met Gln Thr Ser Leu Cys Ser Pro Gln Glu

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Trp Ala Pro His Val Ser Ser Ala Gly Leu Thr Met Gln

485 490 495

Glu Met Phe Thr Pro Cys Ser Gly Ser Gly Arg Arg Asp Tyr Ser Glu

500 505 510

Ala Arg Ile Ala Glu Ile Val Gln Leu Asn Pro Leu Thr Thr Lys Thr

515 520 525

Pro Ala Asp Leu Tyr Arg Ile Leu Ala His Phe Asp Arg Ser Asn Leu

530 535 540

Thr Asn Phe Pro Ala Leu Ser Cys Ile Ser His Leu Ser Gly Tyr Val

545 550 555 560

Ala Val Thr Leu Arg Asp Val Thr Tyr Val Val Ser Ser Asn Val Met

565 570 575

Leu Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Val Thr Asn Leu Ala Val Asp Lys Thr

580 585 590

Met Ile Val Thr Val Ser Pro Ala Gln His Pro Cys Glu Lys Thr Glu

595 600 605

Val Ala His Ala Thr Arg Ser Ile Pro Ile Val Lys Asn Ile Thr Ile

610 615 620

Gly Asn Asp Cys Glu Tyr Cys Lys Ser Ala Ile Met Glu Tyr Asp Glu

625 630 635 640

Val Asn Gly Leu Ser Asn Ile Val Tyr Leu Ala Asp Thr Ala Asp Leu

645 650 655

Val Leu Val Thr Asn Leu Asp Asn Arg Ile Leu Ala Ser Ser Pro Arg

660 665 670

Thr Arg Tyr Ile Met Met Thr Ala Asn Gly Thr Leu Met Glu Ile Thr

675 680 685

Ser Val Ile Ile Asp Ile Arg Gln Thr Ser

690 695

<210> 19

<211> 24

<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

<223> HCMV gB 信号序列

<400> 19

Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile

1 5 10 15

Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser

20

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 9 个氨基酸的接头

<400> 20

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 免疫球蛋白轻链信号肽序列

<400> 21

Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly

20

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 5 个氨基酸的接头

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 15 个氨基酸的接头

<400> 23

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GPCMV GP83 正向引物

<400> 24

cgacgacgac gatgacgaaa ac 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GPCMV GP83 反向引物

<400> 25

tcctcggtct caacgaaggg tc 22

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GPCMV GP83 FAM 探针

<400> 26

atccgagtta ggcagcg 17

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 豚鼠贝塔肌动蛋白正向引物

<400> 27

tggatcggcg gctcatc 17

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 豚鼠贝塔肌动蛋白反向引物

<400> 28

catcgtactc ctgcttgctg at 22

<210> 29

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 豚鼠贝塔肌动蛋白探针

<400> 29

cactctccac cttcc 15

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> His 标签

<400> 30

Leu Gly Gly His His His His His His

1 5

<210> 31

<211> 671

<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus）

<220>

<223> gBVC37

<400> 31

Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr Ser Ser Thr His Asn Gly Ser His

1 5 10 15

Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln Thr Arg Ser Val Tyr Ser Gln His

20 25 30

Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser His Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr

35 40 45

Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys

50 55 60

Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met Ala Gln Gly Thr Asn Leu Thr Arg

65 70 75 80

Phe Glu Arg Asn Ile Ile Cys Thr Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp

85 90 95

Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His

100 105 110

Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile

130 135 140

His His Ile Asn Lys Phe Ala Gln Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val

145 150 155 160

Ile Gly Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn

165 170 175

Lys Thr Met Gln Leu Ile Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr

180 185 190

Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp His Ser Arg Gly Ser Glu Arg

195 200 205

Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Leu Thr Ile Thr Thr Ala Arg Ser

210 215 220

Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp Val Val Tyr

225 230 235 240

Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser Tyr Phe Gly

245 250 255

Glu Asn Ala Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr Ile Val Ser

260 265 270

Asp Phe Gly Arg Pro Asn Ala Ala Pro Glu Thr His Arg Leu Val Ala

275 280 285

Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile Gln Asp Glu

290 295 300

Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser Glu Arg Thr

305 310 315 320

Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser Ala Lys Met

325 330 335

Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met Ser Asp Ser

340 345 350

Ala Leu Asp Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu Gln Gln Ile

355 360 365

Phe Asn Thr Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly Asn Val Ser

370 375 380

Val Phe Glu Thr Ser Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln Gly Ile Lys

385 390 395 400

Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg Ser Ser Leu

405 410 415

Asn Ile Thr His Thr Thr Gln Arg Ser Thr Ser Asp Asn Asn Thr Thr

420 425 430

His Leu Ser Ser Met Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr Ala Gln Leu

435 440 445

Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg Ala Leu Ala

450 455 460

Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr Leu Glu Val

465 470 475 480

Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu Ser Ala Ile

485 490 495

Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val Leu Gly Leu

500 505 510

Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val Leu Arg Asp

515 520 525

Met Asn Val Lys Asn Ser Thr Gly Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Val Val

530 535 540

Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly Gln Leu Gly

545 550 555 560

Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu Glu Cys Gln

565 570 575

Asn Gly Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Glu Tyr

580 585 590

Val Asp Tyr Leu Phe Asn Thr Thr Ile Asp Leu Ser Ser Ile Ser Thr

595 600 605

Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu Asn Thr Asp

610 615 620

Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg Ser Ser Asn

625 630 635 640

Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Lys Gln

645 650 655

Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Val Val Asp Pro Leu Pro Pro

660 665 670

<210> 32

<211> 435

<212> PRT

<213> 豚鼠巨细胞病毒（Guinea pig cytomegalovirus）

<220>

<223> GPCMV-gB 德尔塔 d4

<400> 32

Glu Glu Gly Ile Met Leu Ile Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Pro Tyr Val

1 5 10 15

Phe Thr Ala Tyr Thr Tyr Gln Lys Glu Leu Leu Phe Gln Arg Ser Tyr

20 25 30

Lys Gly His Arg Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Leu Pro Met Trp Glu Ile Phe Leu Val Asn Ser Arg Gly Gln Cys

50 55 60

Tyr Thr Ser His Gln Arg Val Ile Gly Ala Asp Arg Tyr Ile Ala Tyr

65 70 75 80

His Asn Asp Asn Glu Val Asn Glu Thr Met Trp Leu Met Arg Asp Asp

85 90 95

Met Gly Asn Asp Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile Thr Val Lys Glu His Ala

100 105 110

Arg Thr Pro Gly Ser Val Ala Phe His Lys Glu Thr Cys Ser Met Asn

115 120 125

Cys Ile Val Thr Lys Thr Lys Gly Lys Ser Lys Phe Pro Tyr Asp Met

130 135 140

Phe Val Leu Pro Ser Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Pro Phe Tyr Asn

145 150 155 160

Gly Ser Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Gln Arg Glu Lys Phe His Ile

165 170 175

Trp Ser Asn Tyr Ser Ile Leu Lys Asp Phe Gly Ser Arg Ala Leu Glu

180 185 190

Ala Arg Ile Val Pro Lys Met Ala Phe Tyr Glu Arg Glu Asp Val Val

195 200 205

Ile Gly Trp Glu Val Asn Asp Gln Ser Asn Val Thr Cys Glu Met Ile

210 215 220

Leu Trp Glu Thr Val Asp Arg Ala Ile Arg Thr Glu Tyr Glu Asn Ala

225 230 235 240

Phe His Tyr Val Ala Arg Thr Leu Thr Ser Thr Phe Val Glu Asn Lys

245 250 255

Tyr Ser Pro Asp Asn Asn Leu Thr Glu Asp Asp Ile Lys Cys Phe Lys

260 265 270

Asn Asp Ala Gln Lys Lys Ile Glu Glu Val Phe Leu Arg Asp Tyr Asn

275 280 285

Glu Thr Tyr Asp Met Asp Gly Asn Ala Thr Tyr His Val Thr Thr Gly

290 295 300

Gly Leu Val Ile Val Trp Gln Gly Leu Lys Gln Lys Ser Leu Lys Ala

305 310 315 320

Leu Glu Ile Ala Ala Asn Glu Ser Ala Val Ser Ala Thr Gly Ser Asn

325 330 335

Ser Arg Arg Lys Arg Ser Leu Pro Asp Glu Ser Thr Gly Asp Ile Ser

340 345 350

Tyr Ala Gln Leu Gln Phe Ala Tyr Asp Thr Leu Arg Thr Gly Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Ser Gly Gly Gly Leu Glu Asn Ile Asp Phe Lys Val Leu Glu

370 375 380

Leu Tyr Ser Arg Asp Glu Leu Ala Gln Ala Asn Val Phe Asp Leu Glu

385 390 395 400

Ser Ile Met Arg Glu Tyr Asn Tyr Gln Lys Lys Arg Leu Asp Phe Val

405 410 415

Val Glu Arg Val Ile Asn Pro Ile Pro Pro Leu Gly Gly His His His

420 425 430

His His His

435