一种罗贝考昔含量检测方法

摘要

本发明涉及一种罗贝考昔含量的检测方法，包括提供罗贝考昔的对照品溶液和罗贝考昔的供试品溶液；采用高效液相色谱法进行分析，检测条件包括：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，分别对罗贝考昔的对照品溶液和罗贝考昔的供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱的过程中控制流动相A和流动相B的体积比在10‑90:90‑10的范围内变化；检测波长为275‑285nm。该检测方法可以对罗贝考昔口服膏剂中罗贝考昔的含量进行精确测定，罗贝考昔的峰面积与浓度呈良好的线性关系，并且具有良好的重复性和回收率。

说明书

技术领域

本发明涉及药品检测技术领域，具体涉及一种罗贝考昔含量检测方法。

背景技术

罗贝考昔(Robenacoxib)是一种非甾体抗炎药，其通过抑制前列腺素的合成而具有镇痛和抗炎作用。非甾体抗炎药主要通过抑制环氧化酶(COX)来抑制前列腺素的合成，COX酶有两种亚型：COX-1和COX-2。COX-1主要负责合成前列腺素，用于维持健康的胃肠道、肾功能、血小板功能和其他正常功能。COX-2被诱导并负责合成的前列腺素是疼痛、炎症和发热的重要介质。与非选择性非甾体抗炎药相比，在体外试验中，罗贝考昔对COX-2的选择性更强，因此，与其它非选择性非甾体抗炎药相比，罗贝考昔对胃肠道或肾脏的不良反应较轻。

罗贝考昔的CAS编号为220991-32-2，分子式为C

目前，尚未有文献涉及罗贝考昔口服膏剂含量的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗贝考昔含量的检测方法，可以对罗贝考昔口服膏剂中罗贝考昔的含量进行精确测定。该检测方法通过高效液相色谱法进行测定，罗贝考昔的峰面积与浓度呈良好的线性关系，并且具有良好的重复性和回收率。

为此，第一方面，本发明提供一种罗贝考昔含量的检测方法，包括提供罗贝考昔的对照品溶液和罗贝考昔的供试品溶液；采用高效液相色谱法进行分析，检测条件包括：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：以磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，分别对罗贝考昔的对照品溶液和罗贝考昔的供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱的过程中控制流动相A和流动相B的体积比在10-90:90-10范围内变化；

检测波长：275-285nm。

进一步，所述梯度洗脱的条件包括：

t＝0min时，所述流动相A为67％，所述流动相B为33％；

t＝0-30min时，所述流动相A为67％→44％，所述流动相B为33％→56％；

t＝30-35min时，所述流动相A为44％→20％，所述流动相B为56％→80％；

t＝35-38min时，所述流动相A为20％，所述流动相B为80％；

t＝38-38.1min时，所述流动相A为20％→67％，所述流动相B为80％→33％；

t＝38.1-45min时，所述流动相A为67％，所述流动相B为33％。

进一步，所述磷酸溶液为含有磷酸的水溶液。

进一步，所述磷酸溶液还含有高氯酸钠、乙腈中的一种或两种。

在某实施方式中，所述磷酸溶液中磷酸的浓度为0.05-0.15％(v/v)，例如0.05％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％等。

在某实施方式中，所述磷酸溶液中含有高氯酸钠的浓度为50-100mM，例如50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM等。

在某实施方式中，所述磷酸溶液中含有乙腈的浓度为5％-15％(v/v)，例如5％、10％、15％等。

进一步，所述罗贝考昔的供试品溶液的制备方法包括：将含罗贝考昔的制剂溶解于乙腈或乙腈的水溶液中。

进一步，所述含罗贝考昔的制剂为罗贝考昔膏剂。

进一步，所述含罗贝考昔的制剂为罗贝考昔口服膏剂。

进一步，所述乙腈的水溶液中，所述乙腈的浓度为小于等于50％(v/v)，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％等。

进一步，所述罗贝考昔的供试品溶液的制备方法，将含罗贝考昔的制剂溶解于乙腈或乙腈的水溶液中之后还包括以下步骤：离心和/或过滤。

进一步，进行所述过滤时，弃去初始滤得的1mL以上滤液，并收集后续滤得的滤液。

在某实施方式中，所述弃去的初始滤得的滤液的体积为1mL、2mL、3mL、4mL或5mL等。

进一步，所述罗贝考昔的供试品溶液中所述罗贝考昔的浓度为0.0370-0.2222mg/ml。

进一步，所述色谱柱的规格为4.6×150mm，5μm、4.6×150mm，3.5μm、3.9×150mm，5μm、4.6×75mm，2.5μm或4.6×100mm，3μm。

进一步，所述色谱柱选自下组中的一种：Welch Ultimate LP-C18，4.6×150mm，5μm、XteRRARP18，4.6×150mm，3.5μm、Kromasil 100-5C18，4.6×150mm，5μm、ACE Excel3SuperPhenylHexyl，4.6×100mm，3μm、Symmetry C18，3.9×150mm，5μm、BEH-C18，4.6×75mm，2.5μm、ACE Excel 3，C18-Amide，4.6×100mm，3μm、ACE Excel 3，C18-AR，4.6×100mm，3μm、ACE Excel 3，Super-C18，4.6×100mm，3μm。优选为：ACE Excel3SuperPhenylHexyl，4.6×100mm，3μm、ACE Excel 3，C18-Amide，4.6×100mm，3μm、ACEExcel 3，C18-AR，4.6×100mm，3μm、或ACE Excel 3，Super-C18，4.6×100mm，3μm。更优选为：ACE Excel 3，C18-Amide，4.6×100mm，3μm。

进一步，所述高效液相色谱法的柱温为25-35℃，例如25℃、30℃、35℃等。

进一步，所述高效液相色谱法的流速为0.5-1.5mL/min；例如0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min等。

在某些实施方式中，所述高效液相色谱法的检测波长为275nm、280nm或285nm。

进一步，所述高效液相色谱法的进样量为1-100μL。

在某些实施方式中，所述高效液相色谱法的进样量为1μL、5μL、10μL、15μL、20μL等。

根据本发明所述的罗贝考昔含量的检测方法，按照下列公式计算样品中罗贝考昔的含量(mg/mL)：

式中：

W

P

A

D

A

D

V

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明首次提供了一种罗贝考昔含量的检测方法，可以对罗贝考昔口服膏剂中罗贝考昔的含量进行精确测定。根据本发明提供的检测方法，在0.0370-0.2222mg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数r≥0.999；该方法重复性较好，且具有良好的回收率。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1：空白溶液的HPLC检测图谱；

图2：罗贝考昔口服膏剂的辅料制备的空白辅料溶液的HPLC检测图谱；

图3：罗贝考昔对照品溶液的HPLC检测图谱；

图4：罗贝考昔供试品溶液的HPLC检测图谱；

图5：罗贝考昔的HPLC检测图谱峰面积与浓度的线性关系图；

图6：用色谱柱ACE Excel 3SuperPhenylHexyl，4.6×100mm，3μm对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图7：用色谱柱ACE Excel 3，C18-Amide，4.6×100mm，3μm对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图8：用色谱柱ACE Excel 3，C18-AR，4.6×100mm，3μm对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图9：用色谱柱ACE Excel 3，Super-C18，4.6×100mm，3μm对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图10：分别按照梯度1、梯度2和梯度3的洗脱条件对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图11：采用柱温为25℃对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图12：采用柱温为30℃对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图13：采用柱温为35℃对罗贝考昔供试品溶液进行HPLC检测的图谱；

图14：采用流动相A1：(100mM高氯酸钠+0.1％H

图15：采用流动相A2：0.1％H

图16：采用流动相A1：(100mM高氯酸钠+0.1％H

图17：采用流动相A2：0.1％H

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

以下实施例中采用的罗贝考昔原料药的纯度为99.81％，罗贝考昔口服膏剂的规格为2.5g/支，含有罗贝考昔约30mg，其他主要辅料包括中链甘油三酯、微粉硅胶、PEF-300、玉米淀粉、鸡肉粉等。

实施例1

本实施例对罗贝考昔口服膏剂(以下简称制剂)中罗贝考昔的含量进行测定。各试剂配制及检测方法如下：

(1)制剂配制：

流动相A：称取高氯酸钠(NaClO

流动相B：乙腈。

稀释剂(空白溶液)：乙腈。

空白辅料溶液配制：取罗贝考昔口服膏剂的空白辅料一支，精密称定，置于200ml量瓶中，加入约一半体积的乙腈，振摇30min后超声10min，乙腈稀释至刻度，摇匀，离心10min(10000rpm)，津腾有机系滤膜(0.45μm，13mm)过滤，弃去2ml，取续滤液即得。(0.15mg/mL)

对照品溶液配制：取罗贝考昔原料药约30mg，精密称定至200mL棕色量瓶中，加入稀释剂适量溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，即得。平行配制2份。(0.15mg/mL)

供试品溶液：取罗贝考昔口服膏剂一支，精密称定，置于200ml量瓶中，加入约一半体积的乙腈，振摇30min后超声10min，乙腈稀释至刻度，摇匀，离心10min(10000rpm)，津腾有机系滤膜(0.45μm，13mm)过滤，弃去2ml，取续滤液即得。(0.15mg/mL)

(2)检测条件：

仪器：HPLC；色谱柱：ACE Excel 3C18-Amide，4.6×100mm

检测波长：280nm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；

梯度洗脱程序如表1所示：

表1

(3)实验步骤：

取空白溶液、空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果分别见图1、图2、图3和图4所示。其中，图3中保留时间20.728分钟和图4中保留时间20.787分钟的色谱峰为罗贝考昔的色谱峰。

实施例2

本实施例对罗贝考昔的峰面积与其浓度之间的线性关系进行了检测。各试剂配制及检测方法如下：

(1)线性储备液：取罗贝考昔原料药约75mg，精密称定至50mL棕色量瓶中，加入稀释剂(100％乙腈)适量溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.5mg/mL的线性储备液。加稀释剂(100％乙腈)按照表2制备得到线性溶液。

表2

其他试剂的配制同实施例1。

(2)实验步骤

取线性溶液按实施例1所述的条件进行高效液相色谱分析，结果如表3所示，以罗贝考昔的理论浓度为横轴，以峰面积为纵轴作图，结果如图5所示。根据本发明所提供的检测方法，罗贝考昔在0.0370-0.2222mg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

表3

实施例3

本实施例对本发明提供的检测方法的回收率进行检测。各试剂配制及检测方法如下：

(1)准确度溶液配制：按照表4精密称定罗贝考昔原料药并分别置于200ml容量瓶中，用稀释剂(100％乙腈)润洗瓶口，再向每个容量瓶中加入一支该制剂的空白辅料，再加入约一半体积的乙腈，振摇30min后超声10min，加入乙腈稀释至刻度，摇匀，离心10min(10000rpm)，津腾有机系滤膜(0.45μm，13mm)过滤，弃去2ml，取续滤液即得。每个浓度做三份平行。

表4

其他试剂的配制同实施例1。

(2)实验步骤

取步骤(1)制备得到的准确度溶液按实施例1所述的条件进行高效液相色谱分析，结果如表5所示：

表5

根据表5所示的结果，本发明提供的检测方法具有良好的回收率。

实施例4

本实施例对检测过程中所用的滤膜的吸附性进行考察。具体如下：

取实施例1的供试品溶液，分别进行离心或者过滤。对于离心处理的溶液，10000rpm，离心10min用于检测；对于过滤处理的溶液，分别用津腾有机系滤膜(0.45μm，13mm)进行过滤，分别弃去0ml、1ml、2ml、3ml、4ml后，取续滤液用于检测。按照实施例1的检测方法对上述溶液进样罗贝考昔含量检测。检测结果如表6所示：

表6

实施例5

本实施例对供试品溶液的稀释剂进行了考察。各试剂配制及检测方法如下：

(1)试剂配制：

供试品溶液1：取罗贝考昔口服膏剂一支，精密称定，置于200ml量瓶中，加入100mL的乙腈，振摇30min后超声10min，加水稀释至刻度，摇匀，离心10min(10000rpm)，津腾有机系滤膜(0.45μm，13mm)过滤，弃去2ml，取续滤液即得。(0.15mg/mL)

供试品溶液2：取罗贝考昔口服膏剂一支，精密称定，置于200ml量瓶中，加入约一半体积的乙腈，振摇30min后超声10min，加乙腈稀释至刻度，摇匀，离心10min(10000rpm)，津腾有机系滤膜(0.45μm，13mm)过滤，弃去2ml，取续滤液即得。

其他试剂的配制同实施例1。

(2)取步骤(1)中配制的供试品溶液按实施例1所述的条件进行高效液相色谱分析，结果如表7所示：

表7

根据表7所示的结果，采取纯的乙腈或者50％浓度的乙腈作为稀释剂配制供试品溶液，按照本发明所提供的方法进行检测的结果是基本一致的。

实施例6

本实施例对检测罗贝考昔的色谱柱进行了筛选。所测试的色谱柱包括：

首批检测色谱柱：

Welch Ultimate LP-C18，4.6×150mm，5μm

XteRRA RP18，4.6×150mm，3.5μm

Kromasil 100-5C18，4.6×150mm，5μm

ACE Excel 3SuperPhenylHexyl，4.6×100mm

Symmetry C18，3.9×150mm，5μm

BEH-C18，4.6×75mm，2.5μm

根据首批色谱柱的检测结果，ACE Excel 3SuperPhenylHexyl，4.6×100mm分出来的杂质比较多，峰形也较好，故增加对ACE系列的色谱柱进行检测：

ACE Excel 3，C18-Amide，4.6×100mm，3μm

ACE Excel 3，C18-AR，4.6×100mm，3μm

ACE Excel 3，Super-C18，4.6×100mm，3μm

色谱条件如表8所示：

表8

系统平衡后，取罗贝考昔口服膏剂的乙腈稀释溶液作为待测样品，以乙腈为空白对照进行HPLC检测，将罗贝考昔的保留时间及拖尾因子统计于表9。

表9

根据色谱柱的检测结果分析，色谱柱ACE Excel 3SuperPhenylHexyl，4.6×100mm分出来的杂质比较多，峰形也较好(检测图谱见图6)，故对ACE系列柱子进行进一步筛选，检测结果见图7-9。根据筛选结果，选择ACE Excel 3，C18-Amide，4.6×100mm作为后续检测条件筛选的色谱柱。

实施例7

本实施例对检测罗贝考昔的洗脱梯度进行了考察。具体如下：

色谱柱：ACE Excel 3，C18-Amide，4.6×100mm，3μm

色谱条件如表10所示：

表10

系统平衡后，取罗贝考昔口服膏剂的乙腈稀释溶液作为待测样品，以乙腈为空白对照，分别按照各梯度洗脱条件进行HPLC检测，其中，按照梯度1、梯度2和梯度3洗脱得到的色谱图如图10所示。

结果分析：梯度1起始有机相比例比较低，主要考虑分离出峰快、极性大的杂质，结果显示前10分钟都没有杂质，因此考虑调高起始有机相比例得到梯度2，结果显示主峰后有一处两个杂质分离度不佳(参见图10中的标注)，为了使这两个杂质分开，调整流动相比例得到梯度3可用于原料药检测，但是在实际检测制剂产品时发现30min后还有杂质峰，梯度3方法30-30.1分钟变化比例比较大，容易导致基线剧烈波动不利于杂质峰检测，故把这个变化过程放缓为3min，再加入后运行时间得到梯度4，即本发明技术方案的梯度洗脱程序。

实施例8

本实施例对检测罗贝考昔的柱温进行了考察。柱温分别为25℃、30℃和35℃，采用梯度4进行洗脱，其他检测条件同实施例7。

HPLC分析结果如图11(25℃)、图12(30℃)和图13(35℃)所示，保留时间约24min的两个杂质峰分离度分别为1.02、1.49、1.29，结果显示30℃条件下杂质分离效果较佳，因此设定色谱柱柱温为30℃。

实施例9

本实施例对检测罗贝考昔的流动相A进行了考察。流动相A分别为A1：(100mM高氯酸钠+0.1％H

分别用流动相A1和A2对路线中的杂质、中间体以及起始物料进行定位，定位结果如图16(流动相A1)和图17(流动相A2)所示。当使用流动相A1时，RBC05与RBC06分离情况比使用流动相A2更优；RBC00在流动相A1中，有一定的保留(RT≈2.2min)，在流动相A2中，几乎没有保留(RT≈1.1min)。因此选用流动相A1作为本发明的流动相A。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。