一种靶向心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤的代谢标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤的代谢标志物及其应用，属于生物标志物领域。本发明公开一种靶向心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤的代谢标志物，包括天冬氨酸和/或赖氨酸。实验发现，心肌肽对于心肌缺血再灌注损伤的治疗作用，通过对心肌组织进行非靶向代谢组学指标筛选，并对筛选出的赖氨酸及天冬氨酸进行靶向代谢组学验证，发现了赖氨酸及天冬氨酸对于心肌肽治疗心肌缺血再灌注的指示作用。本发明为心肌缺血再灌注的治疗提供了新的思路和方向。

说明书

技术领域

本发明涉及生物标志物领域，特别是涉及一种靶向心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤的代谢标志物及其应用。

背景技术

心肌缺血指心脏的血液灌注降低，诱使心脏的供氧减少，心肌能量代谢异常，无法促进心脏正常工作的一种病理状态。心肌缺血一段时间后恢复血流灌注会加重心肌结构和功能的损伤，导致心功能下降和恶性心律失常，这一过程称为心肌缺血再灌注。

心肌肽是一种具有生物活性的小分子多肽。已有研究表明，心肌肽对心肌缺血再灌注损伤具有明显的预防和治疗作用，并能减少缺血再灌注后心肌酶的释放和严重的心律失常。心肌肽能够减轻心肌缺血再灌注后心肌酶的释放起到减轻心肌损伤的作用。缺血再灌注损伤时，心肌细胞出现变性坏死，使细胞膜功能受损，细胞内CK外逸，致心肌酶活性增高，临床研究表明心肌肽用药后血清心肌酶活力比用药前显著降低，从而保护心肌损伤。心律失常的原因之一是心肌细胞膜离子通道功能障碍，心肌缺血再灌注损伤时，细胞内酸中毒，H浓度升高，通过H/Na交换和Na/Ca

代谢组学起源于20世纪90年代，多用于量化和表征小分子代谢物。其中，非靶向代谢组学以同时定量分析大规模数据的优势在疾病的病理生理机制方面广泛应用，代谢组学分析主要通过对细胞、有机体分析出的体液进行动态跟踪分析，由于代谢产物相对稳定的存在于体液中，因此代谢组学分析可用于疾病的诊断研究，而发现新的代谢物用于心肌缺血再灌注的研究，对于心肌缺血再灌注的预防和治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤的代谢标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过实验验证赖氨酸、天冬氨酸对于心肌肽治疗心肌缺血再灌注的指示作用，为心肌缺血再灌注损伤治疗提供新的方向与思路。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种靶向心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤的代谢标志物，所述代谢标志物包括天冬氨酸和/或赖氨酸。

本发明还提供一种所述的代谢标志物在制备监测心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤作用的产品中的应用。

本发明还提供一种所述的代谢标志物的检测试剂在制备监测心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤作用的产品中的应用。

优选的是，所述产品包括试剂或者试剂盒。

优选的是，与用所述心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤之前相比，心肌组织中的天冬氨酸和赖氨酸含量降低，指示所述心肌肽起到治疗心肌缺血再灌注损伤的作用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过实验发现心肌肽对于心肌缺血再灌注损伤的治疗作用，通过对心肌组织进行非靶向代谢组学指标筛选，并对筛选出的赖氨酸及天冬氨酸进行靶向代谢组学验证，通过心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤7天后，心肌组织中天冬氨酸和赖氨酸含量均有所降低，而治疗27天后，天冬氨酸和赖氨酸呈现显著的下降，说明赖氨酸及天冬氨酸对于心肌肽治疗心肌缺血再灌注的指示作用，可作为代谢标志物对心肌肽治疗心肌缺血再灌注进行监测。本发明为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的思路和方向。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为HE染色结果；

图2为Masson染色结果；

图3为心肌缺血再灌注损伤血清标志物含量；Ast为天门冬氨酸转氨酶，TnT为肌钙蛋白T，MYO为肌红蛋白；

图4为非靶向代谢组学检测结果；

图5为靶向代谢组学检测结果；

图6为治疗前后各组大鼠心肌组织中天冬氨酸及赖氨酸的含量；

图7为天冬氨酸和赖氨酸特异性和灵敏度检测结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

为了检测动物代谢组织中各种氨基酸的含量，以及精密度、回收率、重复性等指标，现以SD雄性大鼠心肌组织为基础，研究动物代谢组织样本中氨基酸的多项指标。

实施例1

1、标准曲线配制

称取22种氨基酸标准品适量，用甲醇或水配制成单标母液，量取各母液适量制成混合标准品，用10％甲酸甲醇-水1:1稀释至合适浓度，制成工作标准溶液。氨基酸物质各浓度见表1，母液及工作标准溶液均冷藏保存。称取同位素标准品(Trp-d3)适量，用10％甲醇配制混标母液浓度为1000ng/mL。

表1

标准曲线：

标准曲线如下表2所示：

表2

2、代谢物提取

精确称取适量动物组织样本于2mL EP管中，准确加入600μL 10％甲酸甲醇溶液-H

稀释20倍含量(μg/g)＝C*0.6*2*20/取样量，其中，C：ng/mL；取样量：mg。

3、上机检测

(1)色谱条件

采用ACQUITY

梯度洗脱条件为0～6.5min，10～30％B；6.5～7min，30～100％B；7～14min，100％B；14～17.5min，100～10％B。流速0～8.0min，0.3mL/min；8.0～17.5min，0.4mL/min。

(2)质谱条件

电喷雾电离(ESI)源，正离子电离模式。离子源温度500℃，离子源电压5500V，碰撞气6psi，气帘气30psi，雾化气和辅助气均为50psi。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。用于定量分析的离子对见下表3。

表3用于分析定量离子对

3、精密度

将不同浓度的工作标准溶液连续进样六次，计算日内精密度，以RSD表示。每天处理六份不同浓度标准样品于不同三天测定，计算日间精密度，以RSD表示。日内精密度在1.29％～14.63％之间，日间精密度在1.70％～14.96％之间，表明仪器的精密度良好。结果见表4。

4、重复性

重复处理八份样本，按“代谢物提取”进行，得到浓度计算重复性，以RSD表示。结果详见表4。

5、回收率

各浓度质控样本按照“代谢物提取”平行处理十份，在同一天测定回收率。结果详见表4。

表4日内、日间精密度、回收率及重复性

为了进一步验证代谢组织中氨基酸和心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤的相关性，下面以动物实验进行进一步验证。

实施例2

1、实验分组

(1)对照组：正常大鼠；

(2)模型组：心肌缺血再灌注损伤模型大鼠；

(3)阳性对照组：心肌缺血再灌注损伤模型大鼠，硝酸异山梨酯灌胃；

(4)低剂量治疗组：心肌缺血再灌注损伤模型大鼠，低剂量(18.9mg/kg)心肌肽注射液尾静脉注射；

(5)中剂量治疗组：心肌缺血再灌注损伤模型大鼠，中剂量(56.7mg/kg)心肌肽注射液尾静脉注射；

(6)高剂量治疗组：心肌缺血再灌注损伤模型大鼠，高剂量(170.1mg/kg)心肌肽注射液尾静脉注射。

每组6只大鼠，共36只。阳性对照组和心肌肽药物组进行连续给药28天，并于造模后40天眼球取血，处死动物并进行心肌组织解剖和处理。

2、高中低剂量心肌肽治疗心肌缺血再灌注损伤(IR)的结果

1.1苏木精伊红(HE)染色

1)固定：取各实验组心肌组织置于10％甲醛中固定48h；

2)洗涤与脱水：将固定后的组织用流水冲洗，去除残留的固定液和杂质。不同浓度的乙醇逐级脱水，50％，70％，85％，95％直至无水乙醇，每级脱水2h；

3)透明：50％酒精+50％二甲苯浸泡2h，再用纯二甲苯浸泡2h，再一次醇二甲苯浸泡2h；

4)浸蜡：先把组织材料块置于融化的石蜡和二甲苯的等量混合液中1～2h，再先后置于2个熔化的石蜡液中各3h左右；

5)包埋：将浸好蜡的组织块放入装有蜡液的容器中，摆好组织块位置。待石蜡凝固后将周围多余的石蜡去除，准备切片；

6)切片：切片前将蜡块置于-20℃冰箱中至少30min，以增加硬度。将切片刀装在刀片机的刀架上并固定，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5°角，调整切片机上的切片厚度4～7μm，然后切片；

7)烤片和脱蜡：将玻片置于65℃恒温烘箱中烤片30min，置于二甲苯Ⅰ(对位)中浸泡15min，再置于二甲苯Ⅱ(对位)中浸泡15min；

8)水化：将脱蜡后的切片经100％，95％，85％，75％酒精分别浸泡5min，自来水冲洗10min；

9)苏木素染色：将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5min，氨水中分色，数秒钟。流水冲洗15min，加入70％和90％酒精中脱水各10min；

10)伊红染色：加入0.5％酒精伊红染色液染色1～2min，流水冲洗冲洗干净，染色后的切片经纯酒精脱水；

11)透明和封片：将玻片置于二甲苯中透明3min×2次，中性树胶封片，放入65℃烘箱中15min。

12)图像采集和分析：通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位。

1.2马松(Masson)染色

1.2.1预处理

石蜡切片：按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min；分别用无水乙醇浸泡5min；95％乙醇浸泡5min；85％乙醇浸泡5min；70％乙醇浸泡5min，PBS浸洗3min×3次；

1.2.2实验步骤

1)苏木素染色5min，用蒸馏水冲洗干净；

2)0.1％HCl分化，自来水冲洗后返蓝；

3)丽春红酸性复红染色液染色5min，蒸馏水稍冲洗；

4)1％磷钼酸水溶液处理50s；

5)甩干，不用水洗，固绿染色5s，自来水洗净，电热扶风干燥箱烘干；

6)晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片；

7)显微镜观察，拍照。

3、心肌损伤血清标志物含量检测

各组大鼠眼球取血，利用全自动生化分析仪检测(BECKMAN AU5800)天门冬氨酸转氨酶(Ast)、肌钙蛋白T(TnT)、肌红蛋白(MYO)含量。

4、天冬氨酸、赖氨酸在各组别中的含量检测

1)液相色谱-质谱检测各代谢指标含量

代谢物提取：精确称取适量样本于2mL EP管中，准确加入600μL 10％甲酸甲醇溶液-H

2)上机检测

色谱条件：采用ACQUITY

质谱条件：电喷雾电离(ESI)源，正离子电离模式。离子源温度500℃，离子源电压5500V，碰撞气6psi，气帘气30psi，雾化气和辅助气均为50psi。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。

5、天冬氨酸、赖氨酸在各组治疗前后的含量差异

液相色谱-质谱检测心肌缺血再灌注模型组、治疗7天组及治疗28天组进行心肌组织靶向代谢组学检测。

6、结果

1)HE染色结果如图1所示，由图可以看出，对照组心肌纤维排列规则，没有破损或坏死的间隙。模型组心肌纤维结构受损，心肌纤维断裂溶解，肌间隙扩大，炎性细胞浸润。阳性对照组和心肌肽注射液注射后，心肌纤维结构破坏和炎性细胞浸润得到明显改善。

2)Masson染色结果如图2所示，由图可以看出，对照组心肌组织纤维排列整齐，染色均匀，胶原纤维较少。模型组心肌纤维化程度明显，胶原纤维明显增加。阳性对照组和心肌肽注射液注射后，心肌纤维化明显改善，胶原纤维明显减少。

3)心肌损伤血清标志物含量如图3所示，由图可以看出，心肌肽治疗后心肌损伤标志物Ast、TnT、MYO含量均显著降低，由此可看出，心肌肽治疗对于心肌损伤的保护作用。

4)图4为非靶向代谢组学检测结果，对3组动物的各6只大鼠的心肌组织进行非靶向代谢组学检测，筛选发现天冬氨酸和赖氨酸的含量在心肌缺血再灌注模型组显著升高，而当使用心肌肽治疗后二者的含量相比模型组显著降低。

非靶向代谢组学筛选后，进行靶向代谢组学检测验证，结果如图5所示，可以看出，心肌缺血再灌注模型组中天冬氨酸和赖氨酸的含量相比正常大鼠组显著升高，使用心肌肽处理后二者含量显著降低。提示心肌组织中天冬氨酸和赖氨酸含量与心肌肽治疗相关，且对预后有一定标识作用。

5)对心肌肽治疗前后大鼠心肌组织中天冬氨酸及赖氨酸含量进行检测，结果如图6所示。由图可以看出，心肌肽治疗7天后，心肌缺血再灌注模型心肌组织中天冬氨酸及赖氨酸含量均有所降低，而治疗28天后，心肌组织中天冬氨酸及赖氨酸含量显著降低。由此可以看出，天冬氨酸及赖氨酸可作为代谢组学指标对心肌肽治疗心肌缺血再灌注进行监测。

6)特异性和灵敏度的测定

根据比较治疗前和治疗后(28d)大鼠心肌细胞天冬氨酸和赖氨酸的含量制作ROC曲线。如图7所示，ROC曲线显示，治疗后的Asp的AUC值为1.000，Lys的AUC值为0.944，说明天冬氨酸和赖氨酸具有较高的灵敏度和特异性，可以作为代谢组学治疗对心肌肽治疗缺血再灌注进行监测。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。