一种烟叶培养基及其制备以及直接发酵生产生物基化学品的方法

摘要

一种烟叶培养基及其制备以及直接发酵生产生物基化学品的方法，属于生物质资源利用技术领域。本发明的生物质烟叶可直接利用，主要是以烟叶和水为原料，不添加或添加不高于10％的其他生物质，经过灭菌处理而成的培养基，直接进行发酵利用。本发明的原料可以仅包括烟叶和水，也可以包括添加不高于10％的其他生物质、烟叶和水，灭菌处理后直接获得发酵用培养基，该培养基制作成本低，制作工艺简单。本发明不仅简化了传统生物质作为发酵培养基生产生物基化学品的步骤，而且很大程度上降低了生产成本和对石油资源的依赖。本发明方法提供了一种全新的烟叶利用途径，不仅在生物合成领域应用前景广阔，而且在替代动物来源性蛋白也有巨大的发展潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物质能源利用技术领域；具体涉及一种烟叶培养基及其制备以及直接发酵生产生物基化学品的方法。

背景技术

微生物合成生物基化学品和生物燃料具有天然环保，周期短等优势。但由于培养基碳源和氮源价格昂贵，使其成本居高不下，工业化进程受阻。生物质资源虽为微生物合成生物基化学品提供大量发酵糖，缓解对石化资源的依赖和减少环境污染，但由于生物质中木质纤维素结构复杂、该过程中使用的酶成本较高以及应用步骤繁琐等原因，促使该工艺的效率不高且成本居高不下，限制了其大规模生产应用的进程。目前研究的重点主要是降低整体生产成本，一方面，大量的研究集中在了解不同木质纤维素的结构设计合适的预处理方法，从而可以提高木质纤维素的使用效率并降低成本；另一方面，应用不同的技术，降低酶的成本；此外，还有研究集中在基因改造能源植物方面，育种低木质素或高纤维素的植物。这些方法虽然在一定程度上可以降低木质纤维素的利用成本，但目前该工艺的工业化应用仍无法实现，需进一步的完善和改进。

发明内容

本发明的目的是为促进工业发酵生产生物燃料和生物基化学品提供更加经济环保的新方法和新材料。本发明方法可直接利用烟叶加水灭菌处理后的溶液作为发酵培养基生产生物基化学品，为生物质的利用和烟草资源转型利用提供新思路。在资源利用效能最大化，减少环境污染以及缓解环境压力也有着积极的作用。本发明方法操作简单，节能减排，发展潜力巨大。本发明方法以烟叶为原料，通过一步处理后所得的处理液直接用作微生物发酵培养基，这不仅可以改善木质纤维素生物质应用工艺中由于其木质纤维素结构复杂、该过程中使用的酶成本较高以及工艺步骤繁琐等缺点，对生物质资源的开发利用具有重要意义，而且对烟草资源的转型利用具有指导意义。此外，烟叶中植物来源性氮源，用来替代动物来源性蛋白，从而避免近年来使用过程中发现动物源蛋白带来的潜在的病毒污染、成分不明确和不利于产物纯化等风险，保障后续产品安全性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

所述烟叶培养基主要是以烟叶和水为原料，经灭菌处理后的上清液，其中，固体和水的质量比为1:(12.5～5)；具体是通过下述步骤完成的：

步骤一、将烟叶放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干直至能用手指捻碎，从烘箱中取出烘好的烟草，马上研磨，持续研磨时间不超过2min；将研磨过后立即装入洁净干燥的避光容器中密闭起来，充分摇动，混匀，获得烟叶粉末；

步骤二、向步骤一获得的烟叶粉末，按固体和水的质量比为1:(12.5～5)配比加入纯水，直接灭菌处理，离心后，取上清液，即得到烟叶培养基。

所述烟叶培养基还可以是以烟叶和水为原料，经灭菌处理，再经酶处理后的全部溶液；具体是通过下述步骤完成的：

步骤一、将烟叶放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干直至能用手指捻碎，从烘箱中取出烘好的烟草，马上研磨，持续研磨时间不超过2min；将研磨过后立即装入洁净干燥的避光容器中密闭起来，充分摇动，混匀，获得烟叶粉末；

步骤二、向步骤一获得的烟叶粉末，按固体和水的质量比为1:(12.5～5)配比加入纯水，直接灭菌处理再加入纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖酶处理，收集溶液，即得到烟叶培养基。

进一步限定，原料包括秸秆、玉米芯、玉米杆、稻草杆、柳枝稷、芒草、木屑中的一种或者其中几种的任意比组合，但不仅限于这些；制备步骤与上述方法不同在于：按步骤一的操作处理秸秆、玉米芯、玉米杆、稻草杆、柳枝稷、芒草、木屑中的一种或者其中几种的组合，得到粉末A；步骤二中先向步骤一获得的烟叶粉末粉末A再加入纯水

进一步限定，烟叶为烤烟烟叶和/或晾晒烟烟叶。

进一步限定，所述原料还包括酸水、碱水、有机溶剂或者离子液。

进一步限定，所述的酸水为盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸中的一种，但不仅限于这些。

进一步限定，所述的碱水为氢氧化钠、氢氧化钙、氨水、氢氧化钾中的一种，但不仅限于这些。

进一步限定，有机溶剂为乙醇或者甲醇，但不仅限于这些。

烟叶培养基发酵生产生物基化学品的方法，其特征在于所述生产生物基化学品方法如下：向上述的烟叶培养基或者上述方法制备的烟叶培养基加入微生物，进行液体发酵，即可。

烟叶作为烟草工业的原料，种植范围广泛。与传统的生物质相比，烟叶具有可溶性组分含量高，糖含量高、氮含量高，木质素含量低等优点，所以烟叶具有直接利用的可行性。烟叶可以通过一步处理后所得的处理液直接用作微生物发酵培养基，这不仅可以改善木质纤维素生物质应用工艺中由于其木质纤维素结构复杂、该过程中使用的酶成本较高以及工艺步骤繁琐等缺点，对生物质资源的开发利用具有重要意义，而且对烟草资源的转型利用具有指导意义。此外，烟叶因其含氮量高而可作为植物来源性氮源，用来替代动物来源性蛋白，从而避免近年来使用过程中发现动物源蛋白带来的潜在的病毒污染、成分不明确和不利于产物纯化等风险，保障后续产品安全性。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1)本发明提供了工业发酵生产生物燃料和生物基化学品的新材料。本发明的生物基化学品可直接液态发酵生产生物基化学品和生物燃料，本发明的生物基化学品水溶性高、可溶性糖含量高、含氮量高，利用效率高。

2)本发明的原料仅包括烟叶和水，灭菌处理后直接获得，成本低，工艺简单。本发明不仅简化了传统生物质作为发酵培养基生产生物基化学品的步骤，而且很大程度上降低了生产成本和对石油资源的依赖。

3)本发明提供了工业发酵生产生物燃料和生物基化学品的新材料。本发明的生物基化学品种植范围广，生长迅速，生物量较大，田间管理简便，获取成本低。

4)本发明提供了工业发酵生产生物燃料和生物基化学品的新材料。本发明的生物基化学品可用于替代动物源性氮源，从而减少动物来源蛋白使用过程中存在的潜在的病毒污染、成分不明确和不利于产物纯化等的风险，保障后续产品安全性。本发明方法提供了一种全新的烟叶利用途径，不仅在生物合成领域应用前景广阔，而且在替代动物来源性蛋白也有巨大的发展潜力。

5)本发明提供了工业发酵生产生物燃料和生物基化学品更加经济环保的新方法。该处理方法操作简单，节能减排，发展潜力巨大。

6)本发明提供了一种烟叶生物质直接液态发酵生产生物基化学品的方法，该方法可以绿色化的方式生产出生物基燃料和生物基化学品，并具有很好的经济性和可持续性。

附图说明

图1为实施例3发酵获得法尼烯的质谱图；

图2为实施例7发酵获得2,3-丁二醇的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：本实施例中所述生物基化学品是以烟叶和水为原料，不添加其他生物质，经灭菌处理后的上清液；具体制备方法是通过下述步骤完成的：

步骤一、制备烟叶粉末

1.样品收集

烟叶样本的收集采用随机抽样的原则。主要采样的晾晒后的烟叶产品。

2.样品制备

将收集晾晒后的烟叶放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎；然后从烘箱中取出烘好的烟草，马上研磨，持续研磨时间不应超过2min；再将研磨过后的烟叶粉末立即装入洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来。充分摇动，混匀；得到烟叶粉末。此即为制备好的试样。

步骤二、取4.00g制备好的试样，加入50mL纯水，直接在115℃下灭菌处理15min，离心后，上清液保存至冰箱中待用。

采用下述试验验证发明效果：

1.溶解性表征：

称取步骤一获得的烟叶粉末4.00g，加入50mL的纯水于高温高压灭菌锅，进行灭菌处理。经处理后的样品趁热抽滤，滤液保存于-20℃待用，滤渣用100mL纯水洗涤三次后，于42℃烘至恒重，结果显示烟叶可溶物可达62.23±0.34％。

2.总糖含量测定

0.1g步骤一获得的烟叶粉末加入20mL纯水，超声处理30min后，离心取上清，采用硫酸苯酚法测总糖。最后结果表明烟叶样本中的总糖含量可达24.04±0.16％。

3.总氮含量测定

准确称取0.2500g步骤二获得的生物基化学品，加入消化管中，并加入硫酸铜、硫酸钾和浓硫酸后，进行消化反应，420℃消化1h。消化结束冷却后，利用凯氏定氮仪进行定氮，最后对接收瓶中的液体利用0.5M盐酸进行滴定，最终根据盐酸的消耗量计算烟叶中的总氮含量。结果表明烟叶样品中的总氮含量为3.01±0.43％。

实施例2：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

取实施例1方法获得的烟叶培养基50mL直接作为发酵培养基，生产法尼烯的具体步骤如下：

将产法尼烯基因工程大肠杆菌接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为209.78±1.24mg/L。

实施例2所用的产法尼烯基因工程大肠杆菌的构建方法(CN111607546A、公布日20200901)。

1)质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS构建：来自青蒿的β-法尼烯合成酶AaFS基因序列经大肠杆菌密码子偏好性优化后，两端分别加限制性内切酶BglII、XhoI酶切位点，由华大基因进行序列合成，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-AaFS。质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS的构建采取酶切-连接的方法。首先用限制性内切酶BglII、XhoI分别对质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1和pUC57-AaFS进行双酶切，酶切体系如下：

酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的条带割胶回收，其中pACYC-mvaE-mvaS-ispA-Sab1经BglII、XhoI双酶切后回收8260bp片段，作为载体；pUC57-AaFS经BglII、XhoI双酶切后回收1725bp片段，作为插入片段，回收产物进行连接反应：

连接产物10μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LBCm平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS。

2)质粒pTrcLower-ΔIDI构建：为考察所有基因拷贝数都为1的情况下异源IDI的催化效果，制备单拷贝基因重组菌，将质粒pTrcLower原来含有的酵母ScIDI去掉。质粒pTrcLower-ΔIDI的构建采取Gibson Assembly方法，以pTrcLower质粒为模板扩增不含ScIDI的载体部分即pTrc-ERG12-ERG8-ERG19。PCR扩增体系如下：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收约8352bp的pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段，用NEBuilder试剂盒进行自连接反应，根据说明书计算片段的比例和各成分的量，连接反应50℃，60min，产物加等体积无菌水稀释，取5μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LBAmp平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pTrcLower-ΔIDI。

3)质粒pTrcLower-AaIDI构建：来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因序列经大肠杆菌密码子偏好性优化后，由华大基因进行序列合成，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-AaIDI，质粒pTrcLower-AaIDI的构建采取酶切-连接的方法。首先以质粒pUC57-AaIDI和pTrcLower为模板，用带有SacI和PstI的引物分别扩增AaIDI基因片段和pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别割胶回收约708bp的AaIDI基因片段和8412bp的pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段，用SacI和PstI进行双酶切：

酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别割胶回收约708bp的AaIDI基因片段和8412bp的pTrc-ERG12-ERG8-ERG19载体片段，回收产物进行连接反应：

连接产物10μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LB Amp平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，获得质粒pTrc-ERG12-ERG8-ERG19-AaIDI即pTrcLower-AaIDI。

4)质粒pET28a-AaFS-ispA-IDI构建：

来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，由华大基因进行序列合成，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-AaIDI；来自番茄的异戊烯基二磷酸异构酶SlIDI基因经大肠杆菌密码子偏好性优化，由华大基因进行序列合成，并克隆到pUC57-simple载体上得到质粒pUC57-SlIDI。

质粒pET28a-AaFS-ispA-IDI的构建采取Gibson Assembly方法，首先扩增出pET28a载体和AaFS、ispA、IDI(分别来自于青蒿和番茄)三个基因片段，分别以pET28a质粒、pUC57-AaFS质粒、大肠杆菌BL21(DE3)菌液、pUC57-AaIDI质粒、pUC57-SlIDI质粒为模板：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的条带割胶回收，测定胶回收产物浓度，使用NEBuilder试剂盒进行Gibson Assembly，根据说明书计算片段的比例和各成分的量，连接反应50℃，60min，产物加等体积无菌水稀释，取5μL热激转化DH5α感受态细胞并涂布LBKan平板，37℃培养过夜。第二天观察板子上的菌落情况，挑取单菌落到液体培养基，37℃培养至较浓，进行菌落PCR鉴定或提取质粒酶切鉴定，并送交测序，分别获得质粒pET28a-AaFS-ispA-AaIDI和质粒pET28a-AaFS-ispA-SlIDI。

5)质粒转化：将测序正确的质粒pACYC-mvaE-mvaS、步骤2)制备得到的pTrcLower-ΔIDI和步骤4)制备得到pET28a-AaFS-ispA-SlIDI/AaIDI(单拷贝)或步骤1)制备的pACYC-mvaE-mvaS-ispA-AaFS、步骤3)制备pTrcLower-AaIDI和步骤4)制备的pET28a-AaFS-ispA-AaIDI(双拷贝)组合转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布相应的三抗(Cm、Amp和Kan)LB培养基平板，其中Cm在LB培养基中的终浓度为34mg/L，Amp在LB培养基中的终浓度为100mg/L，Kan在LB培养基中的终浓度为50mg/L，37℃培养至有单菌落长出，获得合成法尼烯的基因工程菌。

含青蒿来源AaIDI基因的基因工程菌(单拷贝)：过表达乙酰CoA酰基转移酶/HMG-CoA还原酶mvaE基因、HMG-CoA合成酶mvaS基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶ERG8基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶ERG19基因、来自青蒿的异戊烯基二磷酸异构酶AaIDI基因、法尼基二磷酸合成酶ispA基因以及β-法尼烯合成酶AaFS基因的重组菌，所述IDI基因、ispA基因和AaFS基因在质粒上的拷贝数均为1个。

本实施例获得法尼烯图如图1所示，由图可知此发酵产物为法尼烯。

实施例3：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

本实施例的发酵用培养基成分为，总体积50mL：9.8g/L K

将产法尼烯基因工程大肠杆菌(与实施例2相同)接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为234.00±0.17mg/L。

实施例4：酿酒酵母菌利用烟叶直接液态发酵生产法尼烯

本实施例的发酵用培养基成分为，总体积50mL：15g/L尿素；8g/L KH

将产法尼烯酵母菌接种于5mL YPD液体培养基中制作一级种子液，5mL全部接种于50mL YPD发酵培养基中，30℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为94.55±2.62mg/L。

本实施例产法尼烯酵母菌的基因工程菌的构建(申请公布号CN111378588A、公布日20200707)：

目标基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。

本工程菌株以酵母菌株CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)为出发菌株，构建简单过程如下：

(1)所述的各基因通过PCR方法获得，其中，法尼烯合成酶基因AaFS来源于青蒿(Artemisia annuaL.)序列登记号为GenBank:AY835398.1；磷酸乙酰转移酶基因CkPTA来源于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)，序列登记号为GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK来源于明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，序列登记号为GenBank:AY804190.1；乙醛脱氢酶基因DzeutE来源于水稻基腐菌(Dickeyazeae)，序列登记号为GenBank:CP006929.1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR来源于Ruegeriapomeroyi,序列登记号为NCBIReferenceSequence:NC_006569.1。

(2)构建整合片段：PGAL1-AaFS-TCYC1、PGAL1-LmPK-TCYC1_PGAL10-CkPTA-TADH1_HIS、

PGAL1-AaFS-TCYC1_PGAL10-DzeutE-TADH1_URA3、PGAL1-AaFS-TCYC1_PGAL10-RpHMGR-TADH1_LEU2

P(OC)GAL4-GAL4_PGAL1-tHMG1_KanMX。将上述片段分别整合到GAL80、ALD4、ALD6、ADH5、RHR2位点。PGAL1、_PGAL10分别为GAL1和GAL10启动子。TCYC1、TADH1为终止子。

(3)将获得的整合载体转化出发菌株，获得目标转基因工程菌株。

本工程菌株以酵母菌株CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)为出发菌株，构建过程如下：

含法尼烯合成酶基因AaFS的酵母工程菌株构建具体过程：

(1)法尼烯合成酶基因AaFS插入酵母基因组的GAL80位点。所述的法尼烯合成酶基因来源于青蒿(Artemisia annua L.)序列登记号为GenBank:AY835398.1，对该基因进行密码子优化。通过BamHI和SalI将AaFS从合成的质粒上酶切下来，连入pESC-HIS质粒，得到重组质粒pESC-HIS-AaFS。通过PCR获得PGAL1-AaFS-T CYC1片段，P GAL1为GAL1启动子、TCYC1为CYC1终止子，利用限制性内切酶NdeI和PstI将其连接到pUC19质粒中。再通过NdeI和PstI将GAL80的上游(GAL80US)511bp、GAL80的下游(GAL80DS)501bp、依次连入P GAL1-AaFS-T CYC1的两端，得到重组质粒pUC19-GAL80US-P GAL1-AaFS-T CYC1-GAL80DS。通过NdeI和PstI酶切获得供体片段：GAL80US-P GAL1-AaFS-T CYC1-GAL80DS。

(2)以序列TAAGGCTGCTGCTGAACGT为靶标序列，构建gRNA的表达片段。通过设计引物时引入19bp的靶标序列，以线性化的pML104为模板，PCR扩增其两端的各500bpDNA序列，两个上下游片段均含有19bp的GAL80的靶标序列，再通过重叠PCR将两个片段融合到一起获得完整的gRNA表达片段，其19bp的靶序列位于gRNA表达片段的中心。以限制性内切酶SwaI和BclI对质粒pML104进行双酶切，获得线性化质粒；将上述供体DNA片段、线性化的pML104质粒、gRNA表达片段通过化学转化法同时转入酵母感受态细胞CEN.PK2-1C，得到酵母基因工程菌FS1。

含磷酸转酮酶基因LmPK和磷酸乙酰转移酶基因CkPTA的酵母工程菌株构建。

(1)在FS1菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。磷酸乙酰转移酶基因CkPTA和磷酸转酮酶基因LmPK插入酵母基因组的ALD6位点。所述的磷酸乙酰转移酶基因CkPTA来源于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)，序列登记号为GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK来源于明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，序列登记号为GenBank:AY804190.1。CkPTA基因通过EcoRI和SacI连入pESC-URA质粒，得到重组质粒pESC-URA-CkPTA。LmPK基因通过BamHI和SalI连入pESC-URA-CkPTA质粒，得到重组质粒pESC-URA-LmPK-CkPTA。通过PCR获得P GAL1-LmPK-T CYC1_P GAL10-CkPTA-T ADH1片段。

(2)通过PCR获得ALD6基因的上下游片段ALD6US及ALD6DS，以pESC-HIS质粒为模板，通过PCR获得HIS表达片段。通过限制性内切酶Sma I和PstI将pUC19质粒线性化，然后通过多片段一步法快速克隆试剂盒(Hieff Plus Multi OneStep Cloning Kit，10912ES10)将P GAL1 -LmPK-TCYC1_P GAL10 -CkPTA-T ADH1、ALD6US、ALD6DS、HIS连入pUC19质粒,获得重组质粒pUC19-ALD6US-P GAL1 -LmPK-T CYC1_P GAL10 -CkPTA-T ADH1 -HIS-ALD6DS。通过SmaI和SphI酶切重组质粒获得供体片段：ALD6US-P GAL1 -LmPK-T CYC1_P GAL10 -CkPTA-T ADH1 -HIS-ALD6DS。将供体片段转入通过化学转化法酵母菌株FS1，得到酵母菌株FS2。

含乙醛脱氢酶基因DzeutE的酵母工程菌株构建。

(1)在FS2菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。乙醛脱氢酶基因DzeutE和法尼烯合成酶基因AaFS插入酵母基因组的ALD4位点。乙醛脱氢酶基因DzeutE来源于水稻基腐菌(Dickeya zeae)，序列登记号为GenBank:CP006929.1。

DzeutE基因通过NotI和PacI连入pESC-HIS-AaFS质粒，得到重组质粒pESC-HIS-AaFS-DzeutE。通过PCR获得PGAL1-AaFS-T CYC1_P GAL10-DzeutE-T ADH1片段。

(2)通过PCR获得ALD4基因的上下游片段ALD4US及ALD4DS。以pESC-URA质粒为模板，通过PCR获得URA表达片段。将P GAL1-AaFS-T CYC1_P GAL10-DzeutE-T ADH1、ALD4US、ALD4DS、URA4个片段通过化学转化法转入酵母菌株FS2，得到酵母菌株FS3。

含羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR的酵母工程菌构建。

(1)在FS3菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR和法尼烯合成酶基因AaFS插入酵母基因组的ADH5位点。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR来源于Ruegeriapomeroyi,序列登记号为NCBIReferenceSequence:NC_006569.1。本发明所述的RpHMGR为经过优化的序列。

通过PCR获得RpHMGR基因，通过SpeI和SacI连入pESC-HIS-AaFS质粒，得到重组质粒pESC-HIS-AaFS-RpHMGR。通过PCR获得P GAL1-AaFS-T CYC1_P GAL10-RpHMGR-T ADH1片段。

(2)通过PCR获得ADH5基因的上下游片段ADH5US及ADH5DS。以pESC-LEU质粒为模板，通过PCR获得LEU表达片段。将P GAL1-AaFS-T CYC1_P GAL10-RpHMGR-T ADH1、ADH5US、ADH5DS、LEU4个片段通过化学转化法转入酵母菌株FS3，得到酵母菌株FS4。

过表达酵母GAL4基因和tHMG1基因的酵母工程菌构建。

(1)在FS4菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。GAL4基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，序列登记号为NCBI Reference Sequence:NC_001148.4。所述GAL4基因含有终止密码子后面251bp的下游序列。所述GAL4基因的启动子为经过优化的GAL4启动子。tHMG1基因来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，序列登记号为NCBI Reference Sequence:NC_001145.3。其所述的tHMG1基因为缺失N端529个氨基酸的截断体，并含有终止密码子后面的225bp序列，启动子为PGAL1启动子。GAL4基因和tHMG1插入酵母基因组的RHR2位点。

(2)将GAL4表达片段(包括启动子，编码基因及终止子序列)分为A、B、C三个片段，分别通过PCR扩增得到。tHMG1表达片段(包括启动子，编码基因及终止子序列)分为D、E两个片段，分别通过PCR扩增得到。带有loxP位点的筛选标记基因KanMX以质粒pUC6为模板通过PCR获得。RHR2基因的上下游片段RHR2US、RHR2DS通过PCR获得。

(3)通过Overlap extension PCR将片段RHR2US和A、C和D、E和KanMX、KanMX和RHR2-DS分别融合成一个片段，再将融合好的RHR2US+A与B融合为一个片段，将这四个片段通过化学转化法同时转入酵母菌株FS4，得到酵母菌株FS5。

下调表达酵母ERG9基因的酵母工程菌构建。

(1)在FS5菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。ERG9基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，序列登记号为NCBI Reference Sequence:NC_001140.6。所述下调ERG9基因表达片段(包括启动子，编码基因及下游537bp序列)的启动子为MET3启动子。

(2)以酵母基因组为模板，通过PCR获得ERG9基因的上下游片段ERG9US及ERG9+ERG9DS。以以酵母基因组为模板，通过PCR获得MET3启动子P MET3。以质粒pESC-TRP为模板，通过PCR获得TRP表达片段。

(3)通过Overlap extensionPCR将片段ERG9US和TRP融合为一个片段，将ERG9US+TRP、P MET3及ERG9三个片段通过化学转化法同时转入酵母菌株FS5，得到酵母菌株FS6，即为本发明所用的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌。

实施例5：酿酒酵母菌利用烟叶直接液态发酵生产法尼烯

取实施例2方法获得的上清液50mL直接作为发酵培养基。生产法尼烯的具体步骤如下：

将产法尼烯酵母菌(与实施例4相同)接种于5mL YPD液体培养基中制作一级种子液，5mL全部接种于50mL YPD发酵培养基中，30℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为95.67±0.87mg/L。

实施例6：解淀粉芽孢杆菌利用烟叶直接液态发酵生产2,3-丁二醇

取实施例2方法获得的上清液50mL直接作为发酵培养基。生产2,3-丁二醇的具体步骤如下：

将解淀粉芽孢杆菌接种于5mL LB液体培养基中制作一级种子液，然后以5％接种量接种于250mL锥形瓶含100mL种子培养基中进行二次传代培养，37℃、200rpm培养9h后以5％的接种量接种于发酵培养基中(250mL锥形瓶含100mL发酵培养基)，37℃，200rpm培养84h取发酵液用于气相检测。取上述发酵液经12000r/min离心10min，弃除沉淀，将发酵液上清用等体积乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物，用0.22μm有机相膜过滤，利用GC进行定量检测。采用毛细管气相色谱法，设置气体流速1mL/min，分流比为30:1，进样量为1μL。起始柱温100℃，保留1min，然后以5℃/min速率升温至180℃，保留3min，检测器和进样口温度均为250℃。

根据2,3-丁二醇气相检测标准曲线，计算获得2,3-丁二醇产量，最终产量为2.27±0.87g/L。

本实施例获得2,3-丁二醇图如图2所示，由图可知所产化合物为2,3-丁二醇。

实施例7：解淀粉芽孢杆菌利用烟叶直接液态发酵生产2,3-丁二醇

本实施例的发酵用培养基成分为，总体积50mL：KH

将解淀粉芽孢杆菌接种于5mLLB液体培养基中制作一级种子液，然后以5％接种量接种于250mL锥形瓶含100mL种子培养基中进行二次传代培养，37℃、200rpm培养9h后以5％的接种量接种于发酵培养基中(250mL锥形瓶含100mL发酵培养基)，37℃，200rpm培养84h取发酵液用于气相检测。取上述发酵液经12000r/min离心10min，弃除沉淀，将发酵液上清用等体积乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物，用0.22μm有机相膜过滤，利用GC进行定量检测。采用毛细管气相色谱法，设置气体流速1mL/min，分流比为30:1，进样量为1μL。起始柱温100℃，保留1min，然后以5℃/min速率升温至180℃，保留3min，检测器和进样口温度均为250℃。

根据2,3-丁二醇气相检测标准曲线，计算获得2,3-丁二醇产量，最终产量为2.89±0.15g/L。

实施例8：酿酒酵母S288c利用烟叶直接液态发酵生产苯乙醇

取实施例1方法获得的上清液50mL直接作为发酵培养基。生产苯乙醇的具体步骤如下：

将酿酒酵母S288c接种于5mLLB液体培养基中制作一级种子液，然后以5％接种量接种于250mL锥形瓶含50mL种子培养基中进行二次传代培养，30℃、200rpm培养16h后以2％的接种量接种于发酵培养基中(250mL锥形瓶含50mL发酵培养基)，37℃，200rpm培养84h。发酵结束后，加入2％TRPO，萃取后，溶剂层取1mL过滤后，进行气相色谱检测，检测条件为：

色谱柱：Agilent DB-WAX；进样量：1μL；柱温：初始50℃保持1min，以25℃/min速率升温至180℃，保持1min，以20℃/min速率升温至240℃，保持15min；体流速0.5mL/min，检测器和进样口温度均为250℃。

根据苯乙醇气相检测标准曲线，计算获得苯乙醇产量，最终产量为0.57±0.22g/L。

实施例9：本实施例中所述烟叶培养基是以烟叶和水为原料，添加10％柳枝稷，经灭菌处理后的上清液；具体制备方法是通过下述步骤完成的：

步骤一、制备烟叶和柳枝稷粉末

1.样品收集

烟叶样本的收集采用随机抽样的原则。主要采样的晾晒后的烟叶产品和柳枝稷样品。

2.样品制备

将收集晾晒后的烟叶和柳枝稷样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎；然后从烘箱中取出烘好的样品，马上研磨，持续研磨时间不应超过2min；再将研磨过后立即装入洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来。充分摇动，混匀；得到样品粉末。此即为制备好的试样。

步骤二、取4.00g制备好的试样，再加入0.4g柳枝稷样品粉末，加入50mL纯水，直接在115℃下灭菌处理15min，离心后，上清液保存至冰箱中待用。

实施例10：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

取实施例9方法获得的上清液50mL直接作为发酵培养基，生产法尼烯的具体步骤如下：

将产法尼烯基因工程大肠杆菌(与实施例2相同)接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为189.78±0.29mg/L。

实施例11：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

本实施例的发酵用培养基成分为，总体积50mL：9.8g/L K

将产法尼烯基因工程大肠杆菌(与实施例2相同)接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为214.00±0.47mg/L。

实施例12：本实施例中所述烟叶培养基是以烟叶和水为原料，不添加其他生物质，经灭菌处理，加入酶，具体制备方法是通过下述步骤完成的：

步骤一、制备烟叶

1.样品收集

烟叶样本的收集采用随机抽样的原则。主要采样的晾晒后的烟叶样品。

2.样品制备

将收集晾晒后的烟叶样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎；然后从烘箱中取出烘好的样品，马上研磨，持续研磨时间不应超过2min；再将研磨过后立即装入洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来。充分摇动，混匀；得到样品粉末。此即为制备好的试样。

步骤二、取4.00g制备好的试样，加入50mL纯水，直接在115℃下灭菌处理15min，再加入1.44U/mg纤维素酶12mg、7.7U/mg木聚糖酶5mg、60U/mgβ-葡萄糖苷酶10mg，获得酶解液，保存至冰箱中待用。

实施例13：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

取实施例12方法获得的酶解液50mL直接作为发酵培养基，生产法尼烯的具体步骤如下：

将产法尼烯基因工程大肠杆菌(与实施例2相同)接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为225.78±0.76mg/L。

实施例14：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

本实施例的发酵用培养基成分为，总体积50mL：9.8g/L K

将产法尼烯基因工程大肠杆菌(与实施例2相同)接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为309.00±1.48mg/L。

实施例15：本实施例中所述烟叶培养基是以烟叶和水为原料，添加其他生物质，经灭菌处理，加入酶，具体制备方法是通过下述步骤完成的：

步骤一、制备烟叶和柳枝稷粉末

1.样品收集

烟叶样本的收集采用随机抽样的原则。主要采样的晾晒后的烟叶产品和柳枝稷样品。

2.样品制备

将收集晾晒后的烟叶和柳枝稷样品放入烘箱中，在不高于40℃的条件下烘干，直至可用手指捻碎；然后从烘箱中取出烘好的样品，马上研磨，持续研磨时间不应超过2min；再将研磨过后立即装入洁净干燥的棕色广口瓶中密闭起来。充分摇动，混匀；得到样品粉末。此即为制备好的试样。

步骤二、取4.00g制备好的试样，再加入0.4g柳枝稷样品粉末，加入50mL纯水，直接在115℃下灭菌处理15min，再加入1.44U/mg纤维素酶16mg、7.7U/mg木聚糖酶10mg、60U/mgβ-葡萄糖苷酶10mg，获得酶解液，保存至冰箱中待用。

实施例16：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

取实施例15方法获得的酶解液50mL直接作为发酵培养基，生产法尼烯的具体步骤如下：

将产法尼烯基因工程大肠杆菌(与实施例2相同)接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为389.78±2.19mg/L。

实施例17：大肠杆菌利用烟叶培养基直接液态发酵生产法尼烯

本实施例的发酵用培养基成分为，总体积50mL：9.8g/L K

将产法尼烯基因工程大肠杆菌(与实施例2相同)接种于LB液体培养基中制作种子液，按接种量1％，接种于发酵培养基中，37℃培养至OD

色谱柱：Agilent DB-5MS；进样量：1μL；柱温：初始60℃保持0.75min，以10℃/min速率升温至180℃，再降至初始温度；运行时间：13min。

根据法尼烯气相检测标准曲线，计算获得法尼烯产量，最终产量为414.00±1.07mg/L。