一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基及其方法

摘要

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种提高难出胚大白菜胚胚诱导率的培养基及其方法。其中本发明的培养基为向1/2NLN培养基中添加浓度为0.05‑2.0mg/L的灰黄霉素。本方案首次提出向培养基内添加抗生素灰黄霉素用以提高供试白菜小孢子胚胚诱导率的方法，该方法不仅可以显著地提高难出胚白菜材料的出胚率，在一定程度上打破基因型对小孢子胚诱导的限制，还可降低小孢子培养过程中的污染率，有助于建立白菜小孢子高效培养体系，加快白菜种质创新及育种进程。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种提高难出胚大白菜胚胚诱导率的培养基及其方法。

背景技术

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)是一种两年生叶用蔬菜，属于十字花科芸薹属芸薹种。据不完全统计，目前大白菜全国每年播种面积近267万hm2，占比全国蔬菜总播种面积的15％左右，是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。近年来随着我国蔬菜产业模式和人民消费方式的改变，市场对适宜冬春季节栽培的耐抽薹大白菜的需求不断增加，但国内育成的耐抽薹大白菜品种由于育种研究起步相对较晚，种质资源相对狭窄，耐抽性和商品性与国外品种相比，尚存在明显差距，因此目前亟需不断提高育种者对耐抽薹资源的搜集利用意识，加强应用高效育种技术加速优质种质资源创制纯化的技能。

游离小孢子培养是在花药培养基础上发展起来的一种高效再生体系。它主要是经过单倍体小孢子的培养、染色体加倍、胚胎发生等过程，在1～2年内即可获得大量基因型丰富且稳定遗传的纯合自交系材料,为新种质创制及新品种选育提供更加高效的途径。

目前，芸薹属小孢子培养过程中主要是通过预处理以及在培养基中添加不同配比的激素、活性炭等添加剂来激发小孢子出胚，但在实际应用中小孢子胚诱导能否成功在极大程度上受到基因型的影响。就大白菜而言，有研究表示，拧抱炮弹型大白菜品种胚诱导率及子叶胚数量要优于叠抱型和合抱型品种，夏秋耐热早熟的大白菜品种和冬大白菜中晚熟品种小孢子胚的胚诱导率也明显高于春性耐抽薹的早熟品种。对于耐抽薹类型等难出胚的品种很难找到一种具有显著效果的体系或方法诱导小孢子的出胚率。为了克服上述缺陷，特提出本申请。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，以上培养基能够有效降低培养过程中的污染率，提高试材胚诱导成功率。

本发明的第二目的在于提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，以解决耐抽薹类型大白菜游离小孢子培养难以出胚的技术难题。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，向1/2NLN培养基中添加浓度为0.05-2.0mg/L的灰黄霉素。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述培养基中灰黄霉素的浓度为0.1-1.0mg/L。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述培养基中灰黄霉素的浓度为0.5mg/L。

第二方面，本发明提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，采摘初花期至盛花期的花蕾经过处理后得到纯化小孢子，对小孢子培养时采用的培养基为向1/2NLN培养基中添加浓度为0.05-2.0mg/L的灰黄霉素制备得到的。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，花蕾的处理步骤依次包括消毒和研磨；

进一步地，在本发明较佳的实施例中，花蕾的在消毒前的处理步骤还包括预冷处理。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述花蕾为单核靠边期花蕾。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，消毒方式包括酒精消毒和次氯酸钠消毒消毒；

研磨方式为将消毒后的花蕾倒入B5洗涤培养基研磨挤压使花粉充分释放在培养基中得到小孢子溶液，倒掉上清液处于后得到纯化小孢子。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，预冷处理的温度为4-8℃，预冷时间为24-72小时。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，对处理后的纯化小孢子用培养基进行重悬稀释，获得含有纯化小孢子的密度为1×10

进一步地，在本发明较佳的实施例中，在培养之前对所述悬浮液进行热激处理，热激处理的温度为30-35℃，时间为24-72小时。

与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

本发明研发了一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，因为小孢子培养过程中，由于细胞的增值与生长，会产生有害物质(如酚类、脱落酸等)真菌干扰等，从而抑制胚胎的发生。本试验首次探讨了灰黄霉素在小孢子培养中的应用，通过在1/2NLN培养基中添加抗生素灰黄霉素，抑制了小孢子培养过程中产生的真菌等有害物质对小孢子的污染和毒害，使某些较难出胚的材料摆脱基因型的限制，从而利于小孢子胚胎的诱导。本发明的一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，该方法通过在培养基中加入灰黄霉素，不仅可以显著地提高供试白菜出胚率，而且可降低游离小孢子培养过程中的污染率，有助于建立更高效的白菜游离小孢子培养体系，加快白菜种质创新及单倍体育种的研究。

附图说明

图1为本发明对比例1验证同一培养条件下，不同基因型试材的小孢子出胚效果图。

图1中不添加灰黄霉素的前提下，采用本方案的白菜小孢子培养方法成功诱导试材D2(图A)、材料D4(图C)、材料D8(图B)出胚。

图2为本发明实验例5验证添加灰黄霉素前后小孢子出胚效果图。

图2左侧图培养基中不添加灰黄霉素的供试材料D12未诱导出胚。

图2右侧图添加1.0mg/L灰黄霉素的培养基成功诱导供试材料D12出胚。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，向1/2NLN培养基中添加浓度为0.05-2.0mg/L的灰黄霉素；

进一步优选地，灰黄霉素的浓度为0.1-1.0mg/L。

进一步优选地，灰黄霉素的浓度为0.5mg/L。

本实施方式提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，其包括：

步骤S1：选取耐抽薹大白菜品种种植，采摘初花期至盛花期的花蕾经过处理后得到纯化小孢子并进行培养，小孢子培养时采用培养基，其中培养基为向1/2NLN培养基中添加浓度为0.05-2.0mg/L的灰黄霉素；

进一步优选地，灰黄霉素的浓度为0.1-1.0mg/L。

进一步优选地，灰黄霉素的浓度为0.5mg/L。

其中，小孢子培养过程中，由于细胞的增值与生长，会产生有害物质(如酚类、脱落酸等)真菌干扰等，从而抑制胚胎的发生。灰黄霉素是由Oxford等从灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvin)培养液中得到的一种含氯非多烯类的抗真菌抗生素，被广泛应用于治疗皮肤和角质层真菌感染。随着对灰黄霉素代谢机制的深入研究，发现它对植物真菌性病害也有明显的抑制作用。本试验首次探讨了灰黄霉素在小孢子培养中的应用，通过在1/2NLN培养基中添加抗生素灰黄霉素，抑制了小孢子培养过程中产生的真菌等有害物质对小孢子的污染和毒害，使某些较难出胚的材料摆脱基因型的限制，从而利于小孢子胚胎的诱导。

步骤S2：采摘的花蕾依次经过消毒和研磨并且过滤后得到纯化小孢子；

进一步地，消毒方式包括酒精消毒和次氯酸钠消毒；以上消毒方式是较常见的消毒方式，消毒方法简单、安全，便于实施。

进一步地，在本发明中较佳的实施方式中，花蕾先后采用70-75％酒精消毒20-40s，10-12％次氯酸钠溶液消毒10-12min。

进一步地，在本发明中较佳的实施方式中，消毒后的花蕾用无菌水冲洗；其中用水冲洗掉消毒溶液，其目的是次氯酸钠属于氯漂白剂，具有腐蚀性，水冲洗是为防止次氯酸钠残液腐蚀花蕾

进一步地，研磨方式为将消毒后的花蕾倒入10-12mL B5洗涤培养基并研磨挤压使花粉充分释放在培养基中得到小孢子溶液，倒掉上清液后得到纯化小孢子。其中洗涤培养基为多种，但是本试验筛选出用B5洗涤培养基筛选后出胚率较高。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，在洗涤培养基中得到小孢子溶液过滤后，在转移至含有B5洗涤培养基的容器中进行离心处理后倒掉上清液得到纯化小孢子。其目的是采用离心的方式去除较大组织残渣，得到的纯化小孢子更纯，对后续的小孢子出胚率的结果也更加准确。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，消毒步骤前经过镜检和预处理；

其中预冷处理的温度为4-8℃，预冷时间为24-72小时。其中，对采摘的花蕾进行低温处理，能够有效地打断小孢子预定的配子体发育途径，启动小孢子的孢子体发育途径，大大提高了小孢子愈伤或胚胎的发生频率，而4-8℃环境预冷处理24-72小时，对脱分化最为有效。其中，时间过长将降低小孢子的活性。

进一步地，在本发明较佳的实施方式中，其中镜检可以筛选出最优质的的处于单核靠边期花蕾。其中，花蕾选取是小孢子培养技术的基础及关键，研究表明小孢子胚状体胚诱导率以处于单核靠边期阶段最高，通过镜检后确定花蕾的长度，既提高了花蕾选择的准确性，又降低了工作量(避免后续的一一镜检步骤筛选花蕾)，提高了试验效率。

进一步地，本发明的较佳实施方式中，采摘的花蕾长度为2.5-4mm。其目的是因为面对众多试材仅靠显微镜观察选择花蕾，必然费时费工，因而花蕾的长度是小孢子培养中花蕾选择最简便的一种方法，但不同材料的花蕾大小范围相对较广。本方案通过长期实验得到，本实施方式中处于单核靠边期花蕾样本的花蕾长度为2.5-4mm时，出胚效果最好。

步骤S3：步骤S2后得到的纯化小孢子用培养基进行重悬稀释，获得含有纯化小孢子的密度为1×10

其中，小孢子的培养密度也是影响胚胎诱导的重要培养条件，小孢子浓度过高和过低都不利于胚的发育。密度过高时，不仅会消耗大量的营养物质，还会使释放的有毒物质浓度升高；小孢子发育具有群体效应，过低的密度同样会影响小孢子胚的发生。

进一步地，在本发明中较佳的实施例中，分装后的小孢子悬浮液密封，于30-35℃热激24-72h，然后在转移至25℃恒温箱黑暗培养。其中，高温热激在小孢子的分化启动中可有效提高小孢子对称分裂比例，提高小孢子的成胚能力。

步骤S4：恒温箱黑暗培养2周后，得到肉眼可见的胚状体后，统计胚状体数量。

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一、试验材料

表1供体植株编号及名称

表2主要试剂

表3实验器材

二、试验验证

试验搜集引进23份商品性优异的难出胚(耐抽薹)品种，品种信息如表1，供试材料于2021年12月7日、12月29日、1月15日分3个播期播种于天津科润蔬菜研究所武清试验基地，以延长花蕾最适采集时期，于2021年3月底至5月底取花蕾进行游离小孢子培养。

1、验证不同基因型对小孢子出胚率的影响，同时提供了一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，具体步骤如下：

(1)在植株初花期至盛花期，于晴朗的天气采摘大白菜花蕾；

采摘的白菜花蕾用显微镜进行镜检，挑选处于单核靠边期的花蕾30颗，其中可以预先选取长度为2.5-4mm花蕾，以便作为后续花蕾样本采摘的标准，符合标准的花蕾置于4℃环境预冷处理24h。

(2)预冷处理后，用蒸馏水冲洗数遍，紫外灭菌灯照射台面30min，然后将选取的花蕾置于无菌烧杯中，将花蕾依次用75％酒精消毒30s，10％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗3次，每次3～5分钟。

(3)在烧瓶中倒入10ml B5洗涤培养基，用灭菌的研棒轻轻挤压使花粉充分散出，过滤后将其转至离心管；离心管中添加B5培养基10ml，1000rpm离心2-3min，倒掉上清液；按照上述步骤重复离心1次，倒掉上清液，得到的沉淀物即为目标所需的纯化小孢子。

(4)用1/2NLN-13培养基重悬稀释步骤(3)得到的纯化小孢子，调整纯化小孢子悬浮液的密度为1×10

(5)调整密度后的纯化小孢子悬浮液分装到60mm×15mm无菌塑料培养皿，用Parafilm膜封口，于32℃热激24h，然后转移至25℃恒温黑暗培养。

(6)黑暗培养2周后，得到肉眼可见的胚状体后，统计胚状体数量。每7天统计1次胚状体数量，共统计5次，得到数据表4所示。

表4.基因型不同的大白菜小孢子出胚情况

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平

(P<0.05)。

上述实验数据确认了选取的不同基因型的耐抽薹大白菜仅仅有D2,D4,D8品种成功诱导出胚，上述验证实验证明了不同基因型试材出胚率存在显著差异且本方案中选取的品种是难出胚的品种。出胚图见图1

实施例1

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，向1/2NLN培养基中添加浓度为0.05mg/L的灰黄霉素得到培养基1。

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法

其中本实施例中选择除D2、D4、D8、D12以外的其他19份难出胚大白菜材料作为试材。

(1)在植株初花期至盛花期，于晴朗的天气采摘大白菜花蕾；

采摘的白菜花蕾用显微镜进行镜检，挑选处于单核靠边期的花蕾30颗，其中预先选取长度为2.5-4mm花蕾，以便作为后续花蕾样本采摘的标准，符合标准的花蕾置于4℃环境预冷处理24h。

(2)预冷处理后的花蕾，用蒸馏水冲洗数遍，紫外灭菌灯照射台面30min，然后将选取的花蕾置于无菌烧杯中，将花蕾依次用73％酒精消毒35s，10％次氯酸钠溶液消毒12min，无菌水冲洗3次，每次5分钟。

(3)在烧瓶中倒入10ml B5洗涤培养基，用灭菌的研棒轻轻挤压使花粉充分散出，过滤后将其转至离心管；离心管中添加B5培养基10ml，1000rpm离心2min，倒掉上清液；按照上述步骤重复离心1次，倒掉上清液，得到的沉淀物即为目标所需的纯化小孢子。

(4)用培养基1重悬稀释步骤(3)得到的纯化小孢子，调整纯化小孢子悬浮液的密度为1×10

(5)调整密度后的纯化小孢子悬浮液分装到60mm×15mm无菌塑料培养皿，用Parafilm膜封口，于32℃热激48h，然后转移至25℃恒温黑暗培养。

(6)培养周期为2周后，得到肉眼可见的胚状体后，统计胚状体数量。每7天统计1次胚状体数量，共统计5次，

实施例2

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，向1/2NLN培养基中添加浓度为0.1mg/L的灰黄霉素得到培养基2。

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，本实施例的方法步骤同实施例1相同。

实施例3

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，向1/2NLN培养基中添加浓度为0.5mg/L的灰黄霉素得到培养基3。

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，本实施例的方法步骤同实施例1相同。

实施例4

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，向1/2NLN培养基中添加浓度为1.0mg/L的灰黄霉素得到培养基4。

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，本实施例的方法步骤同实施例1相同。

实施例5

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的培养基，向1/2NLN培养基中添加浓度为2mg/L的灰黄霉素得到培养基5。

本实施例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，本实施例的方法步骤同实施例1相同。

对照例

本对照例提供一种提高难出胚大白菜胚诱导率的方法，供试验材料同实施例1相同，选择除D2、D4、D8、D12以外的其他19份难出胚大白菜材料作为试材。

本对照例的步骤同实施例1相同，仅仅在第(4)步骤培养基选择中改变，本对照例使用1/2NLN培养基。

实施例1-5以及对照例中分别加入不同浓度灰黄霉素的培养基诱导出胚的出胚率统计如表5

表5添加灰黄霉素时小孢子的出胚情况

附表5

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平

(P<0.05)。

上述表格的数据表明了在相同培养条件下，与培养基中不添加灰黄霉素的对照组相比，灰黄霉素的添加使得19份难出胚材料成功诱导出胚材料16份，灰黄霉素在0.05-2.0mg/L中绝大多数材料都可以诱导出胚，且当灰黄霉素浓度为0.5mg/L时，16份材料出胚率达最高。由此可见，添加适当浓度的灰黄霉素能够促进材料胚状体的发生。

为了说明本申请提供的培养基以及采用此培养基具有更好的出胚效果，特进行下述实验：

实验例1

其中实验例的步骤同实施例1相同，仅仅在小孢子培养阶段的培养基选择不同。其中培养基为在1/2NLN-13培养基内添加生长素类型的植物激素为褪黑素(MT)，且浓度梯度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L；统计结果如下表：

表6.添加褪黑素(MT)时小孢子的出胚情况

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平

(P<0.05)。

实验例2

其中实验例的步骤同实施例1相同，仅仅在小孢子培养阶段的培养基选择不同。其中培养基为在1/2NLN培养基内添加细胞分裂素类型的植物激素为激动素(KT)，且浓度梯度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L；统计结果如下表：

表7.添加激动素(KT)时小孢子的出胚情况

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平

(P<0.05)。

实验例3

其中实验例的步骤同实施例1相同，仅仅在小孢子培养阶段的培养基选择不同。其中培养基为在1/2NLN培养基内添加乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB)，且浓度梯度为0、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L；统计结果如下表：

表8.添加丁酸钠(NaB)时小孢子的出胚情况

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平

(P<0.05)。

实验例4

本实验例的步骤同实施例1相同，仅仅在小孢子培养阶段的培养基选择不同。其中培养基为在1/2NLN培养基内添加重金属添加剂硝酸银(AgNO3)，且浓度梯度/0、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L；统计结果如下表：

表9.添加硝酸银(AgNO3)时小孢子的出胚情况

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平(P<0.05)。

实验例5

本实验例的步骤同实施例1相同，仅仅在小孢子培养阶段的培养基选择不同。其中培养基为在1/2NLN培养基内添加抗生素为灰黄霉素，且浓度梯度为0、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L；统计结果如下表：

表10.添加灰黄霉素时小孢子的出胚情况

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平(P<0.05)。

实验例6

本实验例的步骤同实施例1相同，仅仅在小孢子培养阶段的培养基选择不同。其中培养基为在1/2NLN培养基内添加抗生素为两性霉素B，且浓度梯度为0、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L；统计结果如下表：

表11.添加两性霉素B时小孢子的出胚情况

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平(P<0.05)。

通过上述1-6个实验例可以看出，对于D2此种较容易出胚的材料，加入不同诱导剂后，例如丁酸钠、硝酸银对材料2的出胚表现出了抑制作用，对于D12也未能诱导出胚。有些诱导剂则对材料出胚表现出了促进作用，例如褪黑素和激动素，但是促进出胚率较少。添加灰黄霉素则既可以促进出胚率且出胚较高。

实验例7

不同培养基类别添加灰黄霉素后对胚诱导率的影响

本实验例的步骤同实施例1相同，仅仅在小孢子培养阶段选择不同类别培养基添加灰黄霉素，灰黄霉素的浓度为0.5mg/L。其中培养基选择NLN培养基和1/2NLN培养基

表12.不同培养基类别添加灰黄霉素时小孢子的出胚情况

从表可以看出，添加灰黄霉素的2种不同类别的培养基均成功诱导2份耐抽薹材料出胚，其中1/2NLN培养基胚诱导率更高。

实验例8

不同取蕾时期对胚诱导的影响

以D2、D4、D8为试材，在其他条件同实施例1相同的情况下，分别于初花期、盛花期和末花期取蕾进行游离小孢子培养，确定适宜取材时期。

初花期指从主花茎上的第一层花朵开放至一级分枝上有50％花朵开放；盛花期指自一级分枝上有50％花朵开放至大部分侧枝顶部出现了生长较弱的花蕾；末花期指自大部分侧枝顶部出现了生长较弱的花蕾至侧枝顶部的花蕾停止发育。确定不同时期花蕾对胚诱导率的影响，统计结果如下表：

表13取蕾时期对白菜小孢子胚诱导率的影响

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平(P<0.05)

从表可以看出，初花期取蕾的胚诱导率最高，与盛花期、末花期的差异达到显著水平。其次是盛花期，诱导率最低的是末花期。说明取蕾时期对白菜小孢子胚诱导有极显著的影响，初花期是最适宜的取蕾时期。

实验例9

低温预处理时间对白菜胚胎发生的影响

以D2、D4、D8为试材，采摘适宜大小的花蕾，在4℃冰箱内进行低温预处理，设24h、48h、72h 3个处理，以未经低温处理的为对照，分析低温预处理对胚诱导的影响。统计结果如下表：

表14冷处理时间对白菜小孢子胚诱导率的影响

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平(P<0.05)。

由表可见，进行适当的低温预处理可以提高白菜胚状体诱导率，以4℃处理24h为最适宜，得到的胚状体诱导率最高，当处理时间超过24h后胚诱导率就开始下降，说明过长时间的低温处理对小孢子的活力具有抑制作用。

实验例10

高温热激处理时间对白菜胚胎发生的影响

以D2、D4、D8为试材，采摘适宜大小的花蕾，在32±1℃恒温箱内进行高温热激处理，设24h、48h、72h 3个处理，以未经高温热激处理的为对照，分析高温热激处理对胚诱导的影响。统计结果如下表：

表15热激处理时间对白菜小孢子胚诱导率的影响

注：采用邓肯氏新复极差法进行单因素方差分析，同一列内不同小写字母表示差异达显著差异水平(P<0.05)。

由表可见，高温预处理可以提高白菜胚状体诱导率，以32±1℃处理48h为最适宜，得到的胚状体诱导率最高，当处理时间超过48h后胚诱导率就开始下降，说明过长时间的高温处理不利于小孢子成胚。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。