利用专性噬菌体提升生防菌防控土传青枯病的方法

摘要

本发明公开了一株青枯病生防菌YL‑Ste‑01evo，保藏号为CCTCC NO:M2022939；一株青枯病生防菌YL‑Ste‑01，保藏号为CCTCCNO:M2022324；一株裂解性噬菌体YL‑Ste‑01P，保藏号为CCTCC NO:M2022460。本发明公开了生防菌YL‑Ste‑01evo或生防菌YL‑Ste‑01或生防菌YL‑Ste‑01evo协同噬菌体YL‑Ste‑01P在防控番茄土传青枯病的应用。生防菌YL‑Ste‑01可以显著抑制青枯菌的生长，降低番茄植株青枯病发病率；通过噬菌体胁迫YL‑Ste‑01进化获得噬菌体抗性更强但抑菌效果更佳的生防菌YL‑Ste‑01evo。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及利用专性噬菌体提升生防菌防控土传青枯病的应用，具体涉及一株生防菌YL-Ste-01，一株专性靶向宿主细菌YL-Ste-01的裂解性噬菌体YL-Ste- 01P，一株进化后的生防菌YL-Ste-01evo，以及生防菌YL-Ste-01或生防菌YL-Ste-01evo或生防菌YL-Ste-01evo协同噬菌体YL-Ste-01P在防控番茄土传青枯病的应用。

背景技术

由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)引起的土传青枯病严重制约了农业的可持续发展，常年来给农户造成了严重的损失。物理和化学防控方式虽然见效快，但易诱导病原菌的耐药性，且使用过程中因靶向性不强，杀灭青枯菌的同时也破坏了微生物群落。利用根际微生物防控土传病害已经成为新型环保的生防手段

发明内容

本发明的目的在于从番茄植株根际分离得到一株可以抑制青枯菌的生防菌YL-Ste-01，并筛选得到一株专性侵染生防菌YL-Ste-01的噬菌体YL-Ste-01P，发明人发现：噬菌体胁迫下，生防菌YL-Ste-01发生进化，对青枯菌抑制能力增强且对噬菌体的抗性增强，从而进一步筛选得到一株抑制青枯菌的生防菌YL-Ste-01evo，通过温室盆栽实验表明，施用进化菌株 YL-Ste-01evo可以显著提高防控番茄青枯病的效果。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株青枯病生防菌YL-Ste-01evo，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，于2022年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022939。

一株青枯病生防菌YL-Ste-01，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，于2022年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022324。

一株裂解性噬菌体YL-Ste-01P，属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体(Stenotrophomonas maltophilia phage)，于2022年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022460。

专性裂解性噬菌体YL-Ste-01P能够胁迫生防菌YL-Ste-01进化得到生防菌YL-Ste- 01evo，与生防菌YL-Ste-01相比，生防菌YL-Ste-01evo的抗病原菌能力和噬菌体抗性均显著增强。一种噬菌体YL-Ste-01P胁迫生防菌YL-Ste-01进化得到青枯病生防菌YL-Ste-01evo 的方法：采用NA液体培养基培养得到处于对数生长期的YL-Ste-01菌液，用无菌水将菌液 OD

本发明的另一个目的是提供一种含生防菌YL-Ste-01evo的菌剂，菌剂的浓度为1×10

一种含生防菌YL-Ste-01evo的菌剂的制备方法，包括：挑取生防菌YL-Ste-01evo单菌，接种于NA液体培养基，在温度30～33℃下、以转速160～180rpm振荡培养，得到对数生长期的YL-Ste-01evo菌液，用无菌水调整菌液的OD

本发明的另一个目的是提供一种含生防菌YL-Ste-01的菌剂，菌剂的浓度为1×10

一种含生防菌YL-Ste-01的菌剂的制备方法，包括：将生防菌YL-Ste-01接种于NA液体培养基，在温度30～33℃下、以转速160～180rpm振荡培养，得到对数生长期的YL-Ste-01菌液，用无菌水调整菌液的OD

一种含噬菌体YL-Ste-01P的噬菌体菌剂，是由以下方法制得的：采用NA液体培养基培养得到处于对数生长期的YL-Ste-01菌液，用无菌水将菌液OD

本发明的另一个目的是提供所述的生防菌YL-Ste-01或所述的生防菌YL-Ste-01evo或所述的生防菌YL-Ste-01evo协同噬菌体YL-Ste-01P在防控番茄土传青枯病的应用。

本发明的另一个目的是提供一种防控番茄土传青枯病的方法，包括：番茄幼苗移栽6～ 7天后，以灌根法将生防菌YL-Ste-01evo菌剂加入土壤中；或番茄幼苗移栽6～7天后，以灌根法将生防菌YL-Ste-01菌剂加入土壤中；其中，生防菌YL-Ste-01evo的终浓度为1×10

本发明的另一个目的是提供一种利用专性噬菌体提升生防菌防控土传青枯病的方法，包括：番茄幼苗移栽6～7天后，以灌根法将生防菌YL-Ste-01evo菌剂加入土壤中，2～3天后接入噬菌体YL-Ste-01P；其中，生防菌YL-Ste-01evo的终浓度为1×10

本发明的有益效果：

室内实验表明，生防菌YL-Ste-01可以显著抑制青枯菌的生长；进一步通过噬菌体胁迫 YL-Ste-01完成进化，获得了噬菌体抗性更强但抑病原菌效果更佳的生防菌YL-Ste-01evo，抑制青枯菌能力增强且能够抵抗噬菌体侵染裂解。温室盆栽实验表明，生防菌YL-Ste-01菌剂可以显著降低番茄植株青枯病发病率，噬菌体胁迫下进化后的生防菌YL-Ste-01evo可以进一步显著提高生防效果，具有广阔的前景。尤其是采用灌根法将噬菌体胁迫下进化得到的生防菌YL-Ste-01evo菌剂和噬菌体施入土壤抑制番茄土传青枯病，进化后的生防菌株与噬菌体协同作用，进一步提升了防控土传青枯病的防治效果。

附图说明

图1为生防菌YL-Ste-01形态。

图2为基于生防菌YL-Ste-01及相关菌株的16S rRNA基因序列建立的系统发育树

图3为噬菌体YL-Ste-01P在宿主菌平板上形成的噬菌斑。

图4为噬菌体YL-Ste-01P在透射电子显微镜下的形态。

图5为噬菌体YL-Ste-01P全基因组系统发育树。

图6为生防菌YL-Ste-01及噬菌体侵染下生防菌YL-Ste-01的生长曲线。

图7为生防菌YL-Ste-01及噬菌体侵染下生防菌YL-Ste-01进化株抗性；图中，虚线表示原始菌株YL-Ste-01的特性，每个点代表一个进化菌株。

图8为YL-Ste-01evo在NA固体平板上形成的菌落。

图9为生防菌YL-Ste-01evo抑菌能力变化。

图10为原始菌株及进化菌株抑制番茄青枯病的温室盆栽效果；图中，不同字母代表P <0.05水平具显著性差异。

生物保藏信息：

YL-Ste-01，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，于2022年 3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022324。

YL-Ste-01evo，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，于2022 年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022939。

YL-Ste-01P，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体(Stenotrophomonasmaltophiliaphage)，于2022年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2022460。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。

培养基配方如下：

NA液体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、去离子水1000mL，调节pH 7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。

NA固体培养基：1L NA液体培养基中加入25g琼脂粉。

庆大培养基：300mL NA半固体培养基加热后1％庆大霉素3μL。

青枯菌(RFP)菌液是由以下方法制得：青枯菌采用庆大霉素固体培养基活化，挑取单菌落转接到NA液体培养基中，30℃、170rpm振荡培养24h，获得对数生长期的青枯菌菌液。

实施例1

嗜麦芽窄食单胞菌的分离

(1)、取南京市麒麟镇后村健康番茄植株根际土壤，称取10g土置于装有90mL无菌水 250mL三角瓶中(含玻璃珠)，170rpm振荡30min，土壤悬液10倍系列稀释后，取0.1 mL悬液涂布于NA培养基平板，30℃培养2～4d。挑取单菌落，划线于NA平板纯化。挑取单菌于NA液体培养基中，30℃、170rpm振荡培养48h，获得菌液，6000r/min离心5 min，得到发酵液；(2)、用接种环蘸取青枯菌RFP

YL-Ste-01，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，于2022年 3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022324。

噬菌体的分离

在南京市麒麟镇后村青健康区域采集得到番茄植株根际土壤样品，通过双层琼脂平板法筛选出一株具有高效裂解能力的生防菌YL-Ste-01专性噬菌体。具体实施方案如下：

将甘油保存的拮抗菌YL-Ste-01在NA固体培养基上划线活化，30℃恒温培养箱中培养 48h。挑取平板上的单菌落转接到NA液体培养基中，在30℃、170rpm摇床中培养24h，获得对数生长期的YL-Ste-01菌液，备用。

称取采集的健康番茄植株根际新鲜土样1g于已灭菌且含有玻璃珠的三角瓶中，加入9 mL无菌水，混匀，放置于30℃、170rpm摇床中振荡培养1h；将经过富集的土壤悬浮液转装到已灭菌的2mL离心管中，10000rpm高速离心3min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤(去除细菌)，滤液即为噬菌体原液；取250μL对数生长期的YL-Ste-01菌液与25mL温度适宜的NA半固体培养基混匀，立即倒入已凝固的NA固体培养基上制成含YL-Ste-01的双层平板，待培养基凝固后，用无菌水进行稀释噬菌体悬液，在平板不同区域分别点接10μL 梯度稀释(10

当有噬菌斑出现后，挑取最大稀释度的单个噬菌斑接入到YL-Ste-01菌液中，30℃、 170rpm/min振荡培养12h使噬菌体增殖，将增殖培养后的悬液10000rpm高速离心3min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，将所得滤液通过上述双层琼脂平板法

实施例2

噬菌体电镜观察

1、培养需要观察的噬菌体YL-Ste-01P与对应的宿主菌YL-Ste-01。

2、参照实施例1“噬菌体的分离”制备含宿主菌YL-Ste-01的双层平板，在平板上滴四滴50μL噬菌体悬液，置于30℃恒温培养箱培养12～24h，直至出现噬菌斑。

3、抠取半固体层噬菌斑，逐一挑到盛有4mLSM液的15mL离心管中，平放到摇床上，30℃、170rpm摇2h。

4、3次离心3次过滤取上清液：首先3000rpm离心2min，取上清液，过滤；滤液二次离心(6000rpm)，取上清液，二次过滤；滤液第三次离心(6000rpm)取上清液，第三次过滤，所得滤液(噬菌体悬浮液)即为噬菌体电镜标本。

5、取适量的噬菌体悬浮液，用2％的磷钨酸染液进行负染，染色约90s后从染液中取出，室温下自然风干。

6、使用透射电子显微镜观察噬菌体的形态。噬菌体YL-Ste-01P具有典型的二十面体头部和不可收缩的尾部(图4)。经过与同国际病毒分类委员会的分类标准比对

噬菌体YL-Ste-01P，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体(Stenotrophomonasmaltophilia phage)，于2022年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2020460。

实施例3

噬菌体最佳感染复数测定

感染复数(Multiplicity of infection，MOI)是指在噬菌体吸附并感染宿主菌之前，噬菌体同宿主菌之间数量的比值。最佳感染复数是获到最高子代噬菌体产量的MOI。

参照实施例1方法，挑取生防菌YL-Ste-01单菌于NA液体培养基中，30℃、170rpm振荡培养，获得对数生长期的YL-Ste-01菌液，用无菌水将OD

滴加实施例1纯化得到的噬菌体悬液于含有YL-Ste-01菌液的NA液体培养基中，30℃、170rpm振荡培养12h；培养液常温10000rpm/min离心3min，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，得到噬菌体悬液；用无菌水调节噬菌体悬液滴度为1×10

取YL-Ste-01菌剂(OD

表1.噬菌体YL-Ste-01P的最佳感染复数

如表1所示，将感染复数为0.01的共培养液梯度稀释并滴加在含青枯菌的双层平板上培养24h，未发现噬菌斑。感染复数为1和10时噬菌体滴度最高，可推断噬菌体YL-Ste-01P与宿主菌YL-Ste-01的最佳感染复数在1和10之间。

实施例4

噬菌体胁迫下宿主细菌生长速率变化

通过设置有无噬菌体为单一变量，控制其他一致的前提下，用酶标仪测定OD

结果如图6，表明，单培养处理组中，YL-Ste-01前24h生长速度较快，24h后生长趋于稳定。而在共培养处理组中，生长初期宿主细菌YL-Ste-01由于被噬菌体YL-Ste-01P侵染裂解，增长速率很低，尤其在前24h内，生长量显著低于单培养处理组，随着时间延长，生防菌YL-Ste-01在24h后数量快速增加，在48h时OD值低于单培养处理组。可以得出噬菌体YL-Ste-01P对于生防菌YL-Ste-01起抑制作用，尤其在初始的24h内抑制显著。

实施例5

生防菌YL-Ste-01在噬菌体胁迫后抗性变化

噬菌体和细菌在长期相互作用中为了存活而不断进化，其中细菌宿主需要改变自身特性不断进化进而逃避侵染

抗噬菌体能力＝(进化菌株OD

抑制青枯菌能力＝(原始菌株RFUs

结果如图7所示，图中，虚线表示原始菌株YL-Ste-01的抗噬菌体和抑制青枯菌能力，每个点代表一个进化菌株。结果显示大部分进化株都在右上象限，说明噬菌体侵染胁迫下原始菌株YL-Ste-01实现进化，进化后的菌株抵抗噬菌体能力以及抑制青枯菌能力都优于原始菌株的。

筛选一株进化生防菌YL-Ste-01evo抑菌性检验

在188株进化株中选择抗噬菌体能力以及抑制青枯菌能力最强的进化株，记为YL-Ste- 01evo。YL-Ste-01evo在NA固体平板上呈现淡黄色且不透明、圆形、中间隆起、表面光滑湿润、易于挑取的菌落(图8)。

YL-Ste-01evo，分类命名为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，于2022 年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022939。

参照实施例1，挑取生防菌YL-Ste-01单菌于NA液体培养基中，30℃、170rpm振荡培养，制得处于对数生长期的的原始菌株YL-Ste-01菌液，将原始菌株YL-Ste-01菌液(对照)用无菌水调至OD

YL-Ste-01菌剂、YL-Ste-01evo菌剂分别按总体系1％接种量加入NA液体培养基中， 30℃、170rpm摇床中振荡培养48h，6000rpm离心5min，用0.22μm滤头过滤，获得进化菌株YL-Ste-01evo发酵液、原始菌株YL-Ste-01发酵液。在96孔板200μL体系中，按总体系1％接种量加入青枯菌悬液(OD

实施例6

原始生防菌及进化后生防菌温室盆栽试验

在南京农业大学温室考察原始菌株、进化菌株防治番茄土传青枯病的效果。

采用基质种植，番茄品种为红矮生。

试验设置4个处理，具体如下：

对照，CK：只接种病原菌；

处理1，YL-Ste-01：接种病原菌、生防菌YL-Ste-01。

处理2，YL-Ste-01evo：接种病原菌、生防菌YL-Ste-01evo。

处理3，YL-Ste-01+YL-Ste-01P：接种病原菌、生防菌YL-Ste-01、噬菌体YL-Ste-01P。

处理4，YL-Ste-01evo+YL-Ste-01P：接种病原菌、生防菌YL-Ste-01evo、噬菌体YL-Ste- 01P。

参照实施例5配制YL-Ste-01菌剂、YL-Ste-01evo菌剂；参照实施例3配制噬菌体菌剂。

将番茄幼苗移栽至六孔盘内，杯中放入拌好的基质，移栽后浇透水；移苗一周后，按照 10

发病率计算公式如下：

发病率(％)＝小区发病植株数/小区总植株数×100％

结果如图10所示，只向番茄根际接种生防菌YL-Ste-01后，青枯病的发病率显著下降，但同时接种生防菌YL-Ste-01和噬菌体YL-Ste-01P时，发病率与对照无显著差异，说明土壤中的噬菌体YL-Ste-01P会通过裂解生防菌YL-Ste-01降低生防菌的生防效果。而接种噬菌体胁迫下进化的进化菌株YL-Ste-01evo时，无论是否存在噬菌体，都可以显著的降低发病，其生防效果较好且不受噬菌体影响(P<0.05)。

综上，噬菌体通过胁迫生防菌进化降低其对噬菌体的敏感度但增强了自身的抑菌特性，为利用生物手段防控土传青枯病提供新的思路。

参考文献：

[1].Keswani C,Singh H B,García-Estrada C,et al.Antimicrobialsecondary metabolites from agriculturally important bacteria as next-generation pesticides[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2020,104:1013- 1034.

[2].Hsu Bryan B.,Gibson Travis E.,YeliseyevVladimir,LiuQing,LyonLorena,BryLynn,Silver Pamela A.,Gerber Georg K..Dynamic Modulation of theGut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model[J]. CellHost&Microbe,2018,25(6).

[3].韦中.生物有机肥防控土传番茄青枯病的效果及其机制研究[D].南京农业大学,2012.

[4].Breitbart M,Rohwer F.Here a virus,there a virus,everywhere thesame virus？Trends Microbiol2005；13:278-84.

[5].Ofir G,Sorek R.Contemporary Phage Biology:From Classic Models toNew Insights.Cell 2018；172:1260- 70.

[6].Aa,Haeruman,Azam,et al.Bacteriophage-host arm race:an update onthe mechanism of phage resistance in bacteria and revenge of the phage withthe perspective for phage therapy.[J].Applied Microbiology& Biotechnology,2019,103:2121-2131.