多囊卵巢综合征小鼠卵泡形态学评估方法

摘要

本申请建立了一种PCOS小鼠卵泡形态学评估的方法，通过取离体卵巢组织后进行连续切片和HE染色比较正常小鼠和DHEA诱导小鼠目标卵泡的最大切面面积、壁层颗粒细胞层面积、壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡最大切面面积比值，确定PCOS疾病中卵泡形态关键评估指标的临界值，准确评估PCOS卵泡。本申请的方案具有准确、高效、可重复性的特点，并且该方法的建立对研究PCOS的发生、发展机制以及有效的治疗措施具有重要意义。

说明书

技术领域

本申请属于生物学和疾病研究诊断领域，具体涉及一种多囊卵巢综合征小鼠卵泡形态学评估方法及应用。

背景技术

多囊卵巢综合征(PCOS)是生育期妇女常见的生殖和内分泌紊乱性疾病，以雄激素过多、多囊卵巢和排卵障碍为主要临床特征，是无排卵性不育最常见的原因。PCOS患者大多依靠药物来治疗，采用手术治疗的患者很少，因此临床取材非常困难，这对PCOS病理生理机制及治疗效果的研究带来诸多困难。由于高雄激素血症是PCOS的主要病因，采用脱氢表雄酮(DHEA)皮下注射诱导幼年雌性小鼠PCOS形成是一种接近人类病理特征的理想型动物模型。一般均采用卵巢组织的连续切片和HE染色观察小鼠卵泡个数和形态来判断PCOS造模是否成功，描述PCOS主要病理改变为卵泡多呈囊性扩张，颗粒细胞层数减少，排列疏松。

目前，PCOS小鼠卵巢卵泡形态评估均为人为判断，未有相应具体数值的确定，也没有相应的量化标准，从而造成PCOS判断评估有误差，不利于临床病理评估。

发明内容

基于此，本申请提供一种多囊卵巢综合征小鼠卵泡形态学评估方法及应用，由于PCOS小鼠卵巢卵泡形态评估均为人为判断，没有相应的量化标准，从而造成PCOS判断与评估有误差。

为解决此技术问题，本申请的技术方案是，提供一种多囊卵巢综合征小鼠卵泡形态学评估方法，包括以下步骤：

步骤S1、选取周龄6～24周的C57BL/6小鼠的离体卵巢组织经过连续切片与染色后，确定目标卵泡在选取的多个切片中的最大切面面积，所述目标卵泡包括成熟卵泡或异常增大的卵泡。

步骤S2、统计具有目标卵泡的最大切面面积的切片中围绕该目标卵泡的壁层颗粒细胞内层的面积，计算卵巢壁层颗粒细胞层的面积。

步骤S3、根据目标卵泡最大切面面积与围绕该目标卵泡的壁层颗粒细胞内层的面积计算目标卵泡的所述卵巢壁层颗粒细胞层的面积与其最大切面的面积的比值。

步骤S4、根据所述目标卵泡的最大切面面积，和目标卵泡的卵巢壁层颗粒细胞层的面积与其最大切面的面积的比值来判断该离体卵巢组织是否符合多囊卵巢的形态学特征。

在其中一个实施例中，所述连续切片中每张切片的厚度独立地为4～6μm。

在其中一个实施例中，所述连续切片中每切8～12张切片选取一张切片进行染色。

在其中一个实施例中所述染色的方法包括HE染色和Masson染色中的一种或两种。

在其中一个实施例中，所述目标卵泡的数量≥1。

在其中一个实施例中，所述目标卵泡的数量＞1。

在其中一个实施例中，所述卵巢组织切片经染色后通过SPSS软件沿着卵巢组织切片的颗粒细胞层与卵泡膜层连接处，框选目标卵泡，确定所述最大切面面积。

在其中一个实施例中，所述卵巢组织切片染色后通过SPSS软件沿着卵巢组织切片的壁层颗粒细胞内层与卵泡腔连接处，框选壁层颗粒细胞内层，确定所述的壁层颗粒细胞内层面积。

在其中一个实施例中，壁层颗粒细胞层面积＝目标卵泡的最大切面面积-壁层颗粒细胞内层面积；壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡的最大切面面积＝(目标卵泡的最大切面面积-壁层颗粒细胞内层面积)/目标卵泡的最大切面面积。

在其中一个实施例中，当所述卵巢切片统计后同时满足：

(1)所述目标卵泡的最大切面的面积大于118649.4μm

(2)所述壁层颗粒细胞层面积/所述目标卵泡的最大切面面积比值小于0.5261，则所述离体卵巢组织符合多囊卵巢的形态学特征。

在其中一个实施例中，统计待评估的卵巢组织中n个目标卵泡数值是否同时符合权利要求8所述的(1)和(2)的数值范围，若n≥1即为待评估的离体卵巢组织符合多囊卵巢的形态学特征。

本申请的多囊卵巢综合征小鼠卵泡形态学评估方法及应用，通过确定DHEA诱导PCOS疾病小鼠卵泡最大切面面积、壁层颗粒细胞层面积、壁层颗粒细胞层面积与目标卵泡的最大切面面积比值的形态学评估临界值，准确评估PCOS。本申请的方案具有准确、高效、可重复性的特点，并且该方法的建立对研究PCOS的发生、发展机制以及有效的治疗措施具有重要意义。

附图说明

图1为正常小鼠离体卵巢组织切片染色图。

图2为PCOS小鼠离体卵巢组织切片染色图。

图3为正常组与PCOS组离体卵巢组织的最大切面面积统计结果。

图4为正常组与PCOS组离体卵巢组织壁层颗粒细胞层面积统计结果。

图5为正常组与PCOS组离体卵巢组织壁层颗粒细胞层面积/最大切面面积比值的统计结果。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

术语

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

多囊卵巢综合征：多囊卵巢综合征(PCOS)是生育期妇女常见的生殖和内分泌紊乱性疾病，以雄激素过多、多囊卵巢和排卵障碍为主要临床特征，是无排卵性不育最常见的原因。

卵泡：哺乳动物的卵巢中，卵母细胞发生与发育的基本功能单位为卵泡，呈圆形泡状，位于卵巢皮质。与雄性动物睾丸终生含有生殖干细胞不同，雌性哺乳动物的卵泡储备是有限并在成年期不可更新的。

卵泡按发育顺序分为：原始卵泡—生长卵泡(初级卵泡、次级卵泡)—成熟卵泡；按形态结构分为：原始卵泡—窦前卵泡—窦状卵泡—成熟卵泡。卵泡个数在胎儿时期就已确定，因此卵巢的衰老与始基卵泡池卵泡的减少或衰竭有关。窦状卵泡发育阶段，大部分卵泡闭锁凋亡，少数到达青春期后，在周期性促性腺激素作用下发育为窦状卵泡。成熟的卵泡是女性生育期周期性分泌雌激素的主要来源，每个生理周期中，在卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)作用下募集得到优势卵泡，黄体生成素(luteinizinghormone，LH)促进卵泡排出成熟卵母细胞，剩余卵泡结构转变为黄体，主要由膜细胞和颗粒细胞组成。

壁层颗粒细胞内层：位于壁层颗粒内层与卵泡腔相接触的位置。颗粒细胞功能为原始颗粒细胞围绕在卵母细胞周围分化两种结构和功能不同的亚型：卵丘细胞和壁层颗粒细胞。卵丘细胞直接与卵母细胞接触，构成的特殊结构叫卵丘卵母复合体(cumulus-oocytecomplex，COC)，卵丘细胞参与细胞增殖和代谢；壁层颗粒细胞分布在卵泡壁，靠近基底膜和膜细胞，参与细胞分化和信号转导，同时，其还是类固醇激素生成的主要细胞，以旁分泌的方式促进卵泡发育。

FSH由脑垂体分泌，是下丘脑-垂体-性腺轴中的重要激素。颗粒细胞表面有丰富的受体，如：FSH受体、LH受体和雌激素受体。FSH与颗粒细胞上的FSH受体结合后，产生多种信号分子，促进卵泡募集，卵母细胞生长，使窦前卵泡向窦状卵泡发育，同时也促进颗粒细胞增殖和细胞内芳香化酶的合成，芳香化酶催化雄激素转化为雌激素。LH同样由脑垂体分泌，其作用是启动卵母细胞减数分裂、排卵、促进卵泡分化成黄体。LH峰作用于颗粒细胞上的LH受体，诱导卵丘颗粒细胞分泌透明质酸，使输卵管捕获卵巢排出的卵子。颗粒细胞表达的雌激素受体在雌激素刺激下诱导卵泡发育成熟和排卵。

脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone)：是一种由肾上腺分泌产生的甾类激素，其英文缩写是DHEA。身体能将脱氢表雄甾酮转变成叫做雌激素和睾酮的另外两种甾类激素。脱氢表雄酮可在卵泡膜细胞中由胆固醇代谢产生，转变为雄烯二酮，后进入颗粒细胞，转化为雌激素。

C57BL/6：近交品系实验鼠，常被称作“C57black 6”、“C57”或者“black 6”(标准简称为B6)。在遗传学试验中广泛用作转基因鼠以模拟人类的基因缺陷类疾病。

本申请提供一种多囊卵巢综合征小鼠卵泡形态学评估方法，包括以下步骤：

步骤S1、选取周龄6～24周的小鼠的离体卵巢组织经过连续切片与染色后，确定目标卵泡在选取的多个切片中的最大切面面积，目标卵泡包括成熟卵泡或异常增大的卵泡。卵泡不断发育，卵泡液增多、卵泡体积增大，使其逐渐突出至卵巢表面，至排卵前，称成熟卵泡。

成熟卵泡腔很大，卵丘很明显，卵泡内膜细胞紧靠卵泡颗粒层，与颗粒层细胞之间有一层基膜相隔，内膜细胞呈多边形，胞质清亮，胞核圆形，细胞间可见许多毛细血管，外膜细胞位于最外层，多呈梭形，与周围结缔组织分界不明显。

异常增大的卵泡即为在窦状卵泡时期未进入成熟期由于病理原因较其他正常卵泡相比呈现异常增大的状态，例如相比较正常卵泡，体积增大5％～10％。

关于成熟卵泡和异常增大的卵泡可以按照本领域技术人员公知的认定标准来确定。

步骤S2、统计具有目标卵泡的最大切面面积的切片中围绕该目标卵泡的壁层颗粒细胞内层的面积，计算卵巢壁层颗粒细胞层的面积。

步骤S3、根据目标卵泡最大切面面积与围绕该目标卵泡的壁层颗粒细胞内层的面积计算目标卵泡的卵巢壁层颗粒细胞层的面积与其最大切面的面积的比值。

步骤S4、根据目标卵泡的最大切面面积，和目标卵泡的卵巢壁层颗粒细胞层的面积与其最大切面的面积的比值来判断该离体卵巢组织是否符合多囊卵巢的形态学特征。

可选地，所述连续切片中每张切片的厚度独立地为4～6μm，例如4μm、5μm、6μm。切片是玻片标本的一种，供光学显微镜或电子显微镜观察的动植物组织薄片。可将组织块包埋于石蜡或火棉胶中或以低温冰冻，用切片机切片，经过染色后供光学显微镜观察。

在一个具体的示例中，所述连续切片中每切8～12张切片选取一张切片进行染色，例如可选取8张、9张、10张、11张、12张进行染色。

进一步地，所述染色的方法包括HE染色、Masson染色中的一种或两种。其中，HE染色为苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，是石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸染上紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分染上红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。

Masson染色是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。

在其中一个具体的示例中，目标卵泡的数量≥1。

可选地，目标卵泡的数量＞1。

在一个具体的示例中，卵巢组织切片经染色后通过SPSS软件沿着卵巢组织切片的颗粒细胞层与卵泡膜层连接处，框选目标卵泡，确定最大切面面积。

进一步地，卵巢组织切片染色后通过SPSS软件沿着卵巢组织切片的壁层颗粒细胞内层与卵泡腔连接处，框选壁层颗粒细胞内层，确定壁层颗粒细胞内层面积。

在一个具体的示例中，壁层颗粒细胞层面积＝目标卵泡的最大切面面积-壁层颗粒细胞内层面积；壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡的最大切面面积比值＝(目标卵泡的最大切面面积-壁层颗粒细胞内层面积)/目标卵泡的最大切面面积。

进一步地，当所述卵巢切片统计后同时满足：

(1)目标卵泡的最大切面的面积大于118649.4μm

(2)壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡的最大切面面积比值小于0.5261；则离体卵巢组织符合多囊卵巢的形态学特征。

在其中一个实施例中，统计待评估的卵巢组织中n个目标卵泡数值是否同时符合权利要求8所述的(1)和(2)的数值范围，若n≥1即为待评估的离体卵巢组织符合多囊卵巢的形态学特征。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1

一、PCOS小鼠模型建立

采用文献报道的脱氢表雄酮(DHEA)建模法。选用出生后21日龄的C57BL/6雌性小鼠，PCOS造模组(DHEA组)小鼠每日皮下注射DHEA(按6mg/100g体重溶于0.1ml注射油剂中)，连续21天；对照组(Control组)为同窝雌性小鼠每日皮下注射0.1ml注射油剂，连续21天，实验组小鼠和对照组小鼠每组各6只。

二、取小鼠离体卵巢组织

将实验组和对照组小鼠处死后，取正常小鼠和DHEA诱导小鼠卵巢组织，进行行卵巢组织连续切片，切片厚度为5μm，每切10张组织切片，取一张切片，进行HE染色分析。

三、统计相应的面积

如图1、图2所示，根据连续切片中卵泡的大小，选取待分析成熟卵泡的最大切面面积(分析每组卵泡个数14个)，使用CaseViewer等图像处理软件，沿着壁层颗粒细胞层与卵泡膜层连接处，框选目标卵泡，确定目标卵泡的最大切面面积，使用软件自动面积计算工具，计算所选区域面积；壁层颗粒细胞内层与卵泡腔连接处，框选壁层颗粒细胞内层确定所述的壁层颗粒细胞内层面积。

使用软件自动面积计算工具，计算所选区域面积。

壁层颗粒细胞层面积＝目标卵泡的最大切面面积-壁层颗粒细胞内层面积。

壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡的最大切面面积比值＝(目标卵泡的最大切面面积-壁层颗粒细胞内层面积)/目标卵泡的最大切面面积。

四、进行相应的统计分析

进行正常小鼠和DHEA诱导小鼠离体卵巢组织中目标卵泡的最大切面面积、壁层颗粒细胞层面积、壁层颗粒细胞层面积/卵泡的最大切面面积比值的统计，3组数据均不呈正态分布，使用秩和检验，结果如图3、图4和图5。

结果显示：DHEA诱导的PCOS小鼠离体卵巢组织中目标卵泡的最大切面面积大于正常组小鼠目标卵泡的最大切面面积，但壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡最大切面面积比值明显低于正常组的比值。

五、确定PCOS疾病相关的临界值

通过SPSS软件，分析目标卵泡最大切面面积、壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡最大切面面积比值的ROC曲线及计算曲线下的面积，当曲线下面积越大时，判断价值越高。

目标卵泡最大切面面积ROC曲线下面积为：0.893，(95％的置信区间0.753-1.0，P＝0.000)。复制ROC曲线上的坐标点，计算约等指数＝敏感度-(1-特异度)，根据最大约等指数选出最佳临界值118649.4μm

壁层颗粒细胞层面积/目标卵泡的最大切面面积比值ROC曲线下面积为：0.974，(95％的置信区间0.926-1.0，P＝0.000)。复制ROC曲线上的坐标点，计算约等指数，根据最大约等指数选出最佳临界值0.5261，对应的灵敏度为0.857，特异性为1。

通过Hosmer-Lemeshow拟合优度验证，当P>0.05为可接受的水平上模型的估计拟合了数据，表明评分模型工作效果良好。两变量拟合优度P均>0.1，证明两变量的预测能力很好。因此，当卵巢连续切片中最大目标卵泡的最大切面面积大于118649.4μm

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。