一种唾液酸乳糖发酵培养基添加剂及其在提高微生物生产唾液酸乳糖能力中的应用

摘要

本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及一种唾液酸乳糖发酵培养基添加剂及其在提高微生物生产唾液酸乳糖能力中的应用。所述唾液酸乳糖发酵培养基添加剂包括：谷氨酰胺、天冬氨酸或胞嘧啶中的一种或多种。本发明发现谷氨酰胺、天冬氨酸和胞嘧啶在一定的含量下可以提高菌株生产唾液酸乳糖的能力；并且将这三种成分组合得到一种发酵培养基添加剂，通过在产唾液酸乳糖的菌株的发酵培养基中添加该发酵培养基添加剂组合，可以显著提高菌株生产唾液酸乳糖的产量。本发明提供的发酵培养基添加剂适用于多种类型的产唾液酸乳糖菌株，对于提高唾液酸乳糖的产量具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及一种唾液酸乳糖发酵培养基添加剂及其在提高微生物生产唾液酸乳糖能力中的应用。

背景技术

人乳寡糖(HMOs)被认为是母乳中的双歧因子，可以调节肠道菌群环境，促进有益菌群的生长，调节免疫系统，同时对促进大脑发育也有重要的作用。唾液酸乳糖是寡糖中的最主要组分，其在食品行业具有广阔的前景，但是现有技术中仍然难以实现大规模生产唾液酸乳糖。

目前对于提高唾液酸乳糖的生产手段都集中于对工程菌的继续改造，而通过改善发酵条件来提升的生产效率鲜有报道。发酵生产的水平取决于菌种的性能和环境条件的控制水平，获得稳定高产的菌株固然重要，但发酵条件的调控能够使菌株性能发挥到最大优势，并且对于同类型的菌株发酵具有指导性意义，是实现产业转化的关键步骤。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种唾液酸乳糖发酵培养基添加剂及其在提高微生物生产唾液酸乳糖能力中的应用。

第一方面，本发明提供一种唾液酸乳糖发酵培养基添加剂，包括：

谷氨酰胺、天冬氨酸或胞嘧啶中的一种或多种；

所述谷氨酰胺在添加至发酵培养基中的最终质量体积百分含量为0.1～0.5％；所述天冬氨酸在添加至发酵培养基中的最终质量体积百分含量为0.04～0.2％；所述胞嘧啶在添加至发酵培养基中的最终质量体积百分含量为0.25～0.4％。其中，基于溶解度考虑，天冬氨酸包括天冬氨酸及其盐。

本发明发现，在一定范围内，谷氨酰胺、天冬氨酸或胞嘧啶在单独添加至发酵培养基添加剂中具有一定的提高生产唾液酸乳糖能力的效果。

进一步地，所述唾液酸乳糖发酵培养基添加剂包括谷氨酰胺、天冬氨酸或胞嘧啶中的至少两种。

进一步地，所述唾液酸乳糖发酵培养基添加剂包括：谷氨酰胺、天冬氨酸和胞嘧啶。

本发明经过研究摸索发现胞嘧啶在产唾液酸乳糖的菌株中单独添加胞嘧啶时，难以有效提高唾液酸乳糖的产量，甚至可能降低唾液酸乳糖的产量，但是在和谷氨酰胺以及天冬氨酸复合使用时，其可以显著大幅度提高唾液酸乳糖的含量，且适用于多种类型的产唾液酸乳糖菌株。

进一步地，所述谷氨酰胺在添加至发酵培养基中的最终质量体积百分含量为0.3～0.5％；和/或，所述天冬氨酸在添加至发酵培养基中的最终质量体积百分含量为0.04～0.05％；和/或，所述胞嘧啶在添加至发酵培养基中的最终质量体积百分含量为0.25～0.35％。

优选地，谷氨酰胺为0.5％，天冬氨酸为0.05％，胞嘧啶为0.35％。

本发明进一步提供包括所述唾液酸乳糖发酵培养基添加剂的唾液酸乳糖发酵培养基。

第二方面，本发明提供一种提高微生物生产唾液酸乳糖能力的方法，包括：

在所述微生物进行发酵培养的过程中，在发酵培养基中加入所述的唾液酸乳糖发酵培养基添加剂。

进一步地，所述微生物为具有产聚唾液酸和/或唾液酸乳糖功能的微生物。

优选为所述微生物为弱化或消除的β-半乳糖苷酶基因的表达，且具有产聚唾液酸和/或唾液酸乳糖功能的微生物。

进一步地，所述发酵培养培养基还包括：

天然氮源、碳源、无机盐、乳糖和诱导剂IPTG。

进一步地，所述发酵培养的条件如下：

在30～37℃的条件下，转速200～300r/min的条件下进行发酵培养。

本发明进一步提供所述唾液酸乳糖发酵培养基添加剂在提高微生物生产唾液酸乳糖能力中的应用。

进一步地，所述微生物为具有产聚唾液酸和/或唾液酸乳糖功能的微生物。

本发明具备如下有益效果：

本发明提供了一种用于提高微生物生产唾液酸乳糖的产量的培养基添加剂组合，在发酵培养基中加入特定浓度的天冬氨酸、谷氨酰胺和胞嘧啶时，可以有效提高唾液酸乳糖的产量。此外，本发明还发现天冬氨酸、谷氨酰胺和胞嘧啶在单独使用时也具备提高微生物生产唾液酸乳糖的能力，但是均效率较低。本发明提供的发酵培养基添加剂组合可以适用于底盘菌株和不同路径构建得到的生产唾液酸乳糖的菌株，对于唾液酸乳糖的发酵生产具有指导意义。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供一种发酵培养方法，具体流程如下：

(1)种子活化培养：取大肠杆菌基因工程菌菌株1，菌株1是基于产SA的工程菌，保藏号CCTCC No：M2013494(公开于CN201910135109.9)所进一步改造的生产SL的菌株，具体为在CCTCC No：M2013494的基础上敲除了β-半乳糖苷酶基因(lacZ)整段表达基因，转入了含有neuA、唾液酸转移酶基因6’-nst的质粒，pCDFDuet-neuA-nst，构建成产唾液酸乳糖菌株，表达操作方法同中国专利ZL2021115551327；

实际上，只要是敲除lacZ功能，例如通过RNAi、AmiRNA、SiRNA、AsRNA或Crispri等方法造成碱基的缺失或替换的方式，或是抑制启动子表达的方式抑制lacZ功能均可以。

同时，只要是提高neuA，6’-Nst的表达的方式，例如通过增加拷贝数、增强启动子或采用强启动子的方式提高neuA，6’-Nst的表达水平均可。

接种到含有30μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB培养基中培养活化，培养温度37℃，摇床振摇转速为220r/min，培养时间6-8h，获得一级种子；将一级种子按照体积比千分之一接种量接到含有30μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的LB培养基中培养活化，培养温度37℃，摇床振摇转速为220r/min，培养时间6-8h获得二级种子液。所述活化培养基为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨5g/L，Nacl 5g/L，pH自然。

(2)发酵培养：将上述步骤(1)培养的活化种子培养液按照千分之一(体积比)接种量接种到摇瓶中进行培养，在培养基中添加不同类型的发酵培养基添加剂进行摇瓶发酵，培养温度37℃，转速为220r/min，所述培养基为：酵母粉0.2％，胰蛋白胨0.6％，甘油4％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸铵0.5％，乳糖1％，硫酸镁0.1％，IPTG 0.5mM，pH7.5。72h发酵完成后检测SL产物产量。

对照组如下：

(1)种子活化培养：同前述发酵培养步骤(1)。

(2)将上述步骤(1)培养的活化种子培养液按照千分之一(体积比)接种量接种到摇瓶中进行培养，培养基中不添加任何发酵培养基添加剂成分，培养温度37℃，转速为220r/min，所述培养基为：酵母粉0.2％，胰蛋白胨0.6％，甘油4％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸铵0.5％，乳糖1％，硫酸镁0.1％，IPTG 0.5mM，pH7.5。发酵结束检测SL含量。

实验结果：

本发明对于发酵培养基，分别添加不同成分的发酵培养基添加剂，产量提升率如表格中所示，其中发酵培养基中氨基酸的添加量根据其溶解度进行预设计：

表1产量提升效果统计

如上所示，对于不同浓度谷氨酰胺、天冬氨酸和胞嘧啶，均是在一定范围内可以提升唾液酸乳糖的产量，但是所显示的趋势有较大区别。

本发明对于发酵培养基，分别添加不同浓度的添加剂组合，部分组合中加入了乳清酸，其添加成分、浓度以及产量提升率如表格中所示：

表2组合物的产量提升效果

本发明基于表2本发明继续优化添加量，得到如表3所示的结果：

表3组合物的产量提升效果

本发明发现在合适的范围内降低添加量，尤其是0.04-0.05％的天冬氨酸、0.3-0.5％的谷氨酰胺和0.25-0.35％胞嘧啶的范围内对于产量的提升效果能够达到合适的范围内(产量提升高于20％)，对于成本的控制具有重要意义。

本发明进一步采用菌株1和2对于方案进行发酵罐验证(活化，培养基与摇瓶方案都相同，不同之处在于，发酵容器为1L发酵罐，将活化种子培养液按照10％(体积比)接种量接种到1L发酵罐中进行培养(装液量为1/4体积)，培养温度37℃，在OD达到0.6时加入50μg/mL的IPTG诱导，继续培养70h，转速为250r/min)。

其中菌株2是基于专利ZL2021115551327的实施例4，在产PSA的菌株(CCTCC NO：M20211274)的基础上构建的产唾液酸乳糖的菌株，该菌株敲除了聚唾液酸转移酶基因neuS、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)和多唾液酸合成蛋白基因(neuE)，转入了含有neuBCA、唾液酸转移酶基因6’-nst、lacY的重组质粒，pCDFDuet-neuBCA-nst-lacY，菌株活化方法同菌株1相同。

表4验证结果

验证实验表明，本发明方法能够运用在基于由天然产PSA或构建产SA的大肠杆菌底盘所构建的SL菌株中，且均能实现提高产量的效果。

另外，3-SL在菌株构建上仅仅是唾液酸转移酶基因与产6-SL的菌株有不同而已，在代谢路径上与6-SL并无太大区别，所以本方法同样能够适用于3-SL的发酵，以促进3-SL产量的提高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。