STAT3抑制剂在制备调控正畸牙移动速度的药物中的应用

摘要

本发明提供了一种STAT3抑制剂在制备调控正畸牙移动速度的药物中的应用，STAT3抑制剂为AG490且作为靶向药物，药物的有效成分为STAT3抑制剂；一种用于调控正畸牙移动速度的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体和活性成分，活性成分为STAT3抑制剂，剂型为片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、药膜剂或微球；本发明采用STAT3抑制剂AG490药物以调控正畸牙移动速度，可实现精准控制支抗牙的移动，有利于缩短正畸治疗周期，减少牙的往返移动而导致的牙根吸收、牙龈退缩等风险，更安全、高效、快速地实现矫治的理想目标，用于解决现有其它正畸支抗技术存在的弱点。

说明书

技术领域

本发明属于口腔正畸技术领域，具体涉及一种STAT3抑制剂在制备调控正畸牙移动速度的药物中的应用。

背景技术

随着近年来人们的口腔保健及审美意识逐步增强，以健康、美观、协调为目标的正畸治疗已成为一个越来越普遍的选择。正畸矫治力施加于牙的作用往往是相互的。正畸医生设计矫治方案时，一部分牙齿需要在矫治力的作用下向目标位移动，如“帆船”一样“行驶”；而另一部分牙齿则需要给它们提供一个“锚”的固定作用，即所谓的“支抗”，这种情况下我们希望这些牙齿受力时尽可能不产生移动。失败的支抗控制不仅影响矫治治疗效果，耗费医生与患者大量的精力与诊疗时间，还可能增加牙根吸收、牙龈退缩等风险。因此，为达到高质量、理想的矫治效果，正畸医生合理的支抗设计和高效的支抗控制至关重要。

目前常用的支抗控制方法包括微种植钉支抗、口外弓、Nance弓、横腭杆等。微种植钉支抗虽有可观的临床效果，但由于部分患者骨质疏松或清洁不到位等，存在反复松动脱落或牙龈肿痛等风险；口外弓往往依赖于患者的配合度，美观度欠佳导致佩戴时间受到限制，户外运动时也会增加外伤风险；Nance弓、横腭杆则影响患者口内的舒适度，也增加了口腔卫生清洁的难度。因此，安全、无创或微创、高效的支抗控制方法亟待探索。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种STAT3抑制剂在制备调控正畸牙移动速度的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一方面，本发明提供了一种STAT3抑制剂在制备调控正畸牙移动速度的药物中的应用。

优选地，STAT3抑制剂为AG490，且作为靶向药物。

优选地，药物的有效成分为STAT3抑制剂。

另一方面，本发明提供了一种用于调控正畸牙移动速度的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体和活性成分，活性成分为STAT3抑制剂。

本发明中，“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、药膜剂或微球等普通剂型，也可制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂等，可通过常规方法进行制备。微粒给药系统药物剂型的选择应与给药方式相匹配，给药方式为局部应用，应用位置主要是所需控制的支抗牙牙周膜或其它牙周组织区域。

优选地，STAT3抑制剂为AG490，且作为靶向药物。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明采用STAT3抑制剂AG490药物以调控正畸牙移动速度，可实现精准控制支抗牙的移动，有利于缩短正畸治疗周期，减少牙的往返移动而导致的牙根吸收、牙龈退缩等风险，更安全、高效、快速地实现矫治的理想目标，用于解决现有其它正畸支抗技术存在的弱点。

附图说明

图1：小鼠杂交过程示意图。

图2：成骨细胞中STAT3在体外可被机械应力激活，在体内被正畸力激活。A)骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行体外应力加载的示意图。B)BMSCs体外在成骨诱导培养基中体外应力加载或非加载7d(8h·d

图3：成骨细胞敲除Stat3抑制了正畸力诱导的牙槽骨骨改建，从而减慢牙移动速率。A)他莫西芬(TA)诱导构建成骨细胞特异性敲除Stat3小鼠及牙移动模型时间轴示意图。B)免疫荧光双染色显示OTM后第10天WT和Stat3

图4：STAT3可作为调节力学诱导牙移动牙槽骨骨改建潜在的药物靶点。A)AG490腹腔注射小鼠及牙移动模型时间轴示意图。OTM后第10天免疫荧光染色及非OTM侧牙槽骨中p-STAT3

图5：Stat3敲除直接抑制成骨细胞分化，并在机械力作用下通过成骨细胞-破骨细胞相互作用抑制破骨细胞形成。A)体外应力加载装置分别应用于CRE腺病毒敲除Stat3(CRE组)和eGFP腺病毒感染对照组(eGFP组)的骨髓间充质干细胞示意图。B)Western blotting显示CRE组和eGFP组BMSCs在应力加载与非加载7d时STAT3表达。C)体外应力加载与非加载时CRE组和eGFP组骨髓间充质干细胞的ALP染色。D)qPCR结果显示Stat3和成骨相关基因Bsp、Osx、Alp、Col1a1、Ocn的mRNA相对水平。E)应力加载与非加载时BMSCs(eGFP或CRE组)与Raw 264.7细胞共培养诱导破骨细胞分化系统示意图。F)在应力加载与非加载下BMSCs(eGFP或CRE组)与Raw 264.7细胞系共培养后第5天TRAP染色。G)共培养后TRAP

图6：AG490药物抑制STAT3可直接减少成骨细胞分化，并间接抑制机械力作用下破骨细胞分化。A)体外应力加载装置分别应用于STAT3抑制剂AG490预处理的骨髓间充质干细胞(AG490组)或载药(对照组)的示意图。B)AG490或对照组处理1天后的BMSCs进行p-STAT3

图7：成骨细胞STAT3通过调节Mmp3转录介导机械力作用下成骨细胞-破骨细胞串扰。A)通过RNA-seq分析，将应力加载eGFP组比非加载eGFP组表达上调的基因，与应力加载Stat3敲除组比应力加载eGFP组表达下调或不变的基因取交集筛选出217个基因。筛选条件为P<0.25，FC>1.4。B)筛选的217个基因GO分析。C)应力加载与非加载条件下的CRE(Stat3敲除)或eGFP组(对照组)四组BMSCs进行热图分析，通过RNA-seq筛选可能的下游调控因子。D)应力加载与非加载条件下成骨诱导分化7d，qPCR显示CRE组和eGFP组BMSCs的Mmp3 mRNA相对水平。Western blotting显示各组MMP3的表达。E)WT和Stat3

图8：机械应力激活的STAT3可促进Mmp3转录，通过成骨细胞-破骨细胞交互调节牙槽骨重塑的机制示意图。机械应力诱导成骨细胞STAT3激活，通过成骨细胞-破骨细胞交互作用直接促进成骨细胞分化，调节破骨细胞形成。

具体实施方式

本发明提供了一种STAT3抑制剂在制备调控正畸牙移动速度的药物中的应用。

本发明通过建立Cre-loxp系统构建诱导型成骨细胞特异性敲除Stat3小鼠并构建牙移动模型，经研究发现敲除小鼠正畸牙移动(Orthodontic tooth movement,OTM)速率减慢，提示STAT3可能在正畸牙移动牙槽骨骨改建中起着重要的调控作用。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，其能够特异性抑制JAK的磷酸化作用，从而抑制STAT3的活性。值得关注的是，WT小鼠体内注射AG490后表现出牙移动速度减慢、成骨与破骨活性均下降等与Stat3基因敲除类似的表型，这提示STAT3具备未来成为牙移动调控药物潜在靶点的可能。与其它方法相比，生物靶向药物干预具有调控精准、高效、副作用少等优势。研究证实，AG490作为STAT3抑制剂，是一种可调控牙移动速率的药物，通过STAT3靶点减慢目标牙的移动速度，可实现对支抗牙的精准控制。相关研究显示AG490药物可用于预防腹主动脉瘤的发生、并防止进行性发展。目前尚无其它技术发明应用AG490药物在正畸领域，具备一定创新性。

AG490的化学结构式如下：

CAS号：133550-30-8

分子式：C

分子量：294.30

溶解度：不溶于水，溶于DMSO，乙醇：5mg/mL。

具体通过(1)Cre-loxp系统构建诱导型成骨细胞特异性敲除Stat3小鼠，(2)WT小鼠体内注射AG490(Absin,Shanghai,CHN)，两者均构建体内牙移动模型，均发现牙移动速率减慢，组织学分析可见成骨、破骨细胞活性减弱等表型。研究结果确证STAT3是调控正畸牙移动潜在的生物靶点，并探究其调控牙槽骨骨改建相关机理，同时验证AG490作为STAT3抑制剂，是一种可调控牙移动速率的新药物。

下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

实验步骤：

1)成骨细胞特异性敲除Stat3小鼠杂交培育与基因型鉴定

按照如下基因型小鼠的交配方案(图1)，运用Stat3

2)AG490体内给药方式

配制STAT3信号抑制剂AG490注射液：1mg AG490先用DMSO溶解50mg/mL，分装后-20℃储存；临用取AG490分装管用含1％DMSO的无菌PBS溶液稀释。建模前3d起每日分别以5mg/kg*bw的剂量腹腔注射AG490和空白对照组(1％DMSO)。正畸牙移动模型的构建同前，腹腔注射麻醉小鼠后，用结扎丝将正畸用镍钛关闭簧一端结扎于左侧上颌第一磨牙，另一端结扎于上颌切牙。收集AG490和空白对照组牙移动后4d、7d、10d的小鼠上颌骨样本进行组织学染色及分析，其余牙移动10d组可进行Micro-CT及活体荧光标记分析。小鼠建模示意及药物注射、收集样本时间线如图4中A所示。

3)构建小鼠牙移动模型

小鼠称重，并用2％水合氯醛腹腔注射麻醉(注射剂量为20μL/g)；将小鼠的四肢固定于解剖台板之上，取0.1mm直径的结扎丝，用弯止血钳将其从小鼠左上颌第一磨牙(1stMolar，M1)、第二磨牙(2nd Molar，M2)颈部间自腭侧穿出，将第一磨牙包绕，于近中旋紧结扎丝，使其不脱落；将0.25mm直径，0.76mm圈径，1mm的Ni-Ti拉簧置入其中一根结扎丝内，旋紧、剪断，将结扎线头藏于弹簧内，避免戳伤小鼠颊黏膜；用高速手机在小鼠左上颌中切牙远中舌角处作一0.5mm固位沟；再取一根新的结扎丝，穿过两中切牙之间，使其与弹簧连接在一起，结扎丝嵌入固位沟内，结扎旋紧；用小棉棒在牙表面涂布自酸蚀树脂粘接剂，用树脂将两中切牙连成一体，将结扎线头一并包绕其中，光固化灯光照30s；待小鼠清醒后放回笼中。每日观察小鼠口内牙移动弹簧装置是否脱落，若中途出现脱落或意外死亡则均予以剔除。小鼠建模示意图如图2中F所示。在体式镜下观察可见WT组小鼠4d、7d、10d不同时间点的牙移动距离变化(图2中G)；重要的是，Stat3

4)组织学分析

4.1)Micro-CT分析：采用micro-CT(SCANCO uCT-80)扫描牙移动10天组WT/Stat3

4.2)活体荧光标记与硬组织切片制备：牙移动建模当天腹腔注射钙黄绿素，第8天注射茜素红，第10天取材。制备硬组织样品，采用硬组织切片机切片，切片厚度为100μm，打磨，封片，抛光。结果示Stat3

4.3)组织学染色观察成骨/破骨活性：小鼠第一磨牙根分叉牙槽骨区域作为感兴趣区域。两组小鼠样本分别进行免疫荧光染色(OPN、CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，计算并统计分析第一磨牙根分叉区域牙槽骨的阳性细胞数目。OPN免疫荧光染色结果示Stat3

4.4)组织学染色验证STAT3活性：WT组牙移动0d、4d、7d不同时间点小鼠切片行免疫荧光双染色(OPN/pSTAT3)，结果示牙移动4d、7d后成骨细胞中pSTAT3活性均上调，证明其力学敏感性(图2中H)。WT/Stat3

5)小鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离与培养

分别取4周龄C57雄性小鼠Stat3

腺病毒感染体外敲除Stat3组：细胞铺板后16h左右，以MOI＝30值与BMSCs细胞数量、病毒滴度计算加入的腺病毒体积，votex振荡均匀后静置2min，各孔分别加入eGFP对照组腺病毒或Cre敲除组腺病毒，4-8h更换为新鲜培养液，48h后显微镜下观察多数细胞有eGFP绿色荧光表达即表明感染成功。

药物干预组：STAT3抑制剂AG490药物(20μM)、MMP3抑制剂UK 356618(6nM)在铺板24h后加入，隔天换液。

6)体外应力加载模型

采用美国Flexercell细胞应变加载装置(Flexercell 6000)，通过周期性张应力加载模拟BMSCs在体内受正畸应力的状况。eGFP组与Cre组均再次分为加力组与不加力组，间歇张应力组施加条件为幅度10％；方式-间断，每天1次，每次8h，停顿16h；时长为7d，频率0.5Hz。不加力对照组则放入同一细胞培养箱静置，隔天换液。

7)成骨分化诱导实验

WT组：WT小鼠BMSCs根据体外应力加载与否分为应力组与非应力组，同时进行成骨分化诱导并检测相关成骨指标，模式图如图2中A。蛋白芯片分析筛选出应力敏感的分子STAT3(图2中C)，结果示STAT3表达随加力变化显著。结果示加力组ALP染色明显增强(图2中B)，WB显示加力情况下STAT3激活为pSTAT3，pSTAT3表达上调(图2中D)，免疫细胞荧光染色(pSTAT3)示pSTAT3加力时表达上调。

腺病毒感染体外敲除Stat3组：敲除组(CRE)及对照(GFP)组均在构建体外应力加载模型的同时进行成骨分化诱导，模式图如图5中A。WB示CRE组细胞基本不表达STAT3，证明其敲除效率(图5中B)。AlP染色(图5中C)及成骨相关因子qPCR(图5中D)结果示，Stat3敲除后BMSCs加力状态下成骨分化减弱。

药物干预组：AG490药物实验模式图如图6中A。AlP染色(图6中C)及成骨相关因子qPCR(图6中D)结果示，AG490抑制STAT3活性后BMSCs加力状态下成骨分化减弱。细胞免疫荧光染色(pSTAT3)示AG490组pSTAT3表达明显下调，证明了其对STAT3活性抑制作用。

8)成骨破骨共培养体系

RAW264.7细胞系预先培养观察细胞状态是否良好，在BMSCs腺病毒转染后48h后，铺于BMSCs加力板中进行共培养，设置单独的RAW264.7作为阴性对照(Negative Control,NC)，待24h后镜下观察细胞贴壁情况及其生长状态，随后构建应力加载系统进行破骨分化。

腺病毒感染体外敲除Stat3组：模式图如图5中E。TRAP染色(图5中E)及破骨相关因子qPCR(图5中F)结果示，Stat3敲除后BMSCs加力状态下破骨分化减弱。

药物干预组：模式图如图6中E。TRAP染色(图6中F)AG490给药后BMSCs加力状态下破骨分化减弱。

9)RNA seq筛选

用Trizol提取腺病毒处理的Stat3敲除BMSCs(CRE组)与对照组(eGFP组)体外加力状态与不加力状态下诱导成骨分化的RNA样品，共收集不加力组的eGFP组(n＝2)、不加力组的CRE组(n＝2)、加力组的eGFP组(n＝2)和加力组CRE组(n＝2)共8个样品，委托公司进行样品的RNA测序研究。以P值(p<0.25)和变化倍数FC(Fold change>1.4)筛选表达差异基因。筛选条件可见图7中A，图7中B为GO分析，图7中C为热图，从中筛选出MMP3为可能的下游调控因子。

10)验证下游调控机制

WB与qPCR验证了MMP3的表达与测序结果同样的趋势(图7中D)。WT/Stat3

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。