淫羊藿次苷Ⅱ在制备缓解顺铂所致肾损伤药物中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及淫羊藿次苷Ⅱ在制备缓解顺铂所致肾损伤药物中的应用。本发明表明淫羊藿次苷Ⅱ能够干预顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型，降低小鼠的血肌酐和尿素氮水平，提高小鼠体重；明显改善顺铂诱导的急性肾组织损伤，减少肾小管细胞内糖原沉积；显著降低小鼠的IL‑6、TNF‑α和MDA含量，也使得SOD含量上升，抑制炎症反应，并抑制氧化应激反应，降低肾组织的凋亡。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及淫羊藿次苷Ⅱ在制备缓解顺铂所致肾损伤药物中的应用。

背景技术

顺铂(Cisplatin)是一种较常见的化疗药物，对肺癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌等多种恶性实体肿瘤都具有较好的控制效果。但是，在使用顺铂进行化疗的过程中，大量的顺铂会积累在肾脏中，引起急性肾损伤，能引起肾功能不全甚至肾衰竭。顺铂引起的轻度肾毒性作用是可逆的，但严重的肾毒性会导致永久性的肾损伤、慢性进行性肾功能衰竭或肾小管功能损害。为了减轻或预防顺铂引起的肾毒性，临床上常常采用水化、补充镁或给利尿剂等办法，但由此导致的过度利尿和脱水使很多患者不能耐受。当肾毒性无法克服时，则只能减少顺铂剂量甚至停止化疗，而这无疑会增加肿瘤进展或复发的风险。因此，临床上迫切需求寻找到安全有效的药物作为顺铂的辅助药物，能对肾起保护作用而且不影响顺铂的抗瘤作用。

淫羊藿次苷Ⅱ是淫羊藿中的一种单体成分，具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤、调控脂质代谢等作用，但其减缓顺铂所致急性肾损伤的作用尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能有效缓解顺铂所致肾损伤，从而改善顺铂化疗预后的方案。

本发明提供了淫羊藿次苷Ⅱ在制备缓解顺铂所致肾损伤药物中的应用。

优选的，所述肾损伤包括急性肾损伤。

本发明还提供了淫羊藿次苷Ⅱ在制备抑制肌酐和/或尿素氮的药物中的应用。

本发明还提供了淫羊藿次苷Ⅱ在制备降低炎症因子表达水平的药物中的应用。

优选的，所述炎症因子包括抑制IL-6和TNF-α。

本发明还提供了淫羊藿次苷Ⅱ在制备降低丙二醛含量的药物中的应用。

本发明还提供了淫羊藿次苷Ⅱ在制备促进超氧化物歧化酶活性药物中的应用。

本发明还提供了一种缓解顺铂所致肾损伤的药物，有效成分包括淫羊藿次苷II。

优选的，所述药物中淫羊藿次苷II的质量百分含量＞98％。

优选的，还包括药学上可接受的载体。

本发明提供了淫羊藿次苷Ⅱ在制备缓解顺铂所致肾损伤药物中的应用。本发明采用淫羊藿次苷Ⅱ干预顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型，能够显著降低小鼠的血肌酐和尿素氮水平，提高了小鼠体重；明显改善顺铂诱导的急性肾组织损伤，减少肾小管细胞内糖原沉积。电镜结果显示本发明淫羊藿次苷II明显减轻了肾组织的超微结构破坏。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同处理小鼠体重对比图；

图2为不同处理小鼠肌酐含量对比图；

图3为不同处理小鼠尿素氮含量对比图；

图4-1和4-2为不同处理小鼠HE染色结果；

图5为不同处理小鼠肾小管损伤评分结果；

图6-1和图6-2为不同处理小鼠PAS染色透射电镜结果，其中图6-1为透射电镜下肾小球组织的2000倍放大图，图6-2为透射电镜下肾小管组织的2000倍放大图；

图7为不同处理小鼠炎症因子IL-6表达水平；

图8为不同处理小鼠炎症因子TNF-α表达水平；

图9为不同处理小鼠MDA的含量；

图10为不同处理小鼠SOD含量；

图11-1和11-2为不同处理小鼠TUNEL染色结果；

图12为不同处理小鼠TUNEL染色阳性检测统计结果；

图13为不同处理小鼠SDS-PAGE电泳分离结果。

具体实施方式

本发明提供了淫羊藿次苷Ⅱ在制备缓解顺铂所致肾损伤药物中的应用。

在本发明中，所述肾损伤优选包括急性肾损伤。本发明所述淫羊藿次苷Ⅱ能够显著降低小鼠的血肌酐和尿素氮水平，提高了小鼠体重；明显改善顺铂诱导的急性肾组织损伤，减少肾小管细胞内糖原沉积；显著降低小鼠的IL-6、TNF-α水平和MDA含量，也使得SOD含量上升，抑制炎症反应，并抑制氧化应激反应，降低肾组织的凋亡。电镜结果显示本发明淫羊藿次苷II明显减轻了肾组织的超微结构破坏。

在本发明中，所述淫羊藿次苷Ⅱ的结构式如下：

在本发明中，以所述药物中淫羊藿次苷II的质量计，所述药物的使用剂量优选为50～490mg/60kg/天/人，进一步优选为50～390mg/60kg/天/人，更优选为50～190mg/60kg/天/人。本发明对所述淫羊藿次苷II的来源没有严格要求，可购买获得或者自行制备，保证淫羊藿次苷II的纯度＞99％即可。本发明具体实施过程中，所述淫羊藿次苷II优选购自上海融禾医药科技发展有限公司。

本发明还提供了淫羊藿次苷II在制备抑制肌酐和/或尿素氮的药物中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了淫羊藿次苷II在制备降低炎症因子表达水平的药物中的应用。本发明所述炎症因子包括抑制IL-6和TNF-α。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了淫羊藿次苷II在制备降低丙二醛含量的药物中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了淫羊藿次苷II在制备促进超氧化物歧化酶活性药物中的应用。

本发明在制备抑制肌酐和/或尿素氮的药物、降低炎症因子表达水平的药物、降低丙二醛含量的药物和促进超氧化物歧化酶活性药物时，使用的淫羊藿次苷II的浓度，以及淫羊藿次苷II的来源同上，在此不作赘述。

动物实验结果表明，在顺铂注射诱导的肾损伤的小鼠疾病模型中，高剂量(小鼠中为80mg/kg，相当于人的390mg/60kg)和低剂量(小鼠中为40mg/kg，相当于人的195mg/60kg)的淫羊藿次苷II能够改善小鼠的体重、肌酐和尿素氮，体重明显上升，肌酐和尿素氮显著下降；减少肾小管细胞内糖原沉积，减轻了肾组织的超微结构损害；降低了炎症因子IL-6和TNF-α水平，抑制炎症；减少丙二醛(MDA)含量，增大超氧化物歧化酶(SOD)的活性，减轻肾组织的超微结构损害，缓解顺铂诱导的肾组织凋亡，改变凋亡相关蛋白的表达，缓解顺铂所致肾损伤。

本发明还提供了一种缓解顺铂所致肾损伤的药物，有效成分包括淫羊藿次苷II。本发明所述药物中淫羊藿次苷II的质量浓度优选＞98％。本发明所述淫羊藿次苷II可以单独使用，也可以与其他具有缓解顺铂所致肾损伤的药物搭配使用，达到缓解顺铂所致肾损伤的效果。本发明提供的缓解顺铂所致肾损伤的药物中优选还包括药学上可接受的载体。本发明对所述载体的种类和用量不作特殊限定，根据不同剂型要求常规添加即可。

在本发明中，所述药物的剂型优选包括口服药剂或注射药剂，更优选包括注射用药剂。本发明所述缓解顺铂所致肾损伤的药物中，以所述药物中淫羊藿次苷II的质量计，所述药物的使用浓度优选与前文记载的内容一致，在此不作赘述。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.实验试剂和材料

淫羊藿次苷II(上海融禾医药科技发展有限公司，纯度＞98％)，羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)，地塞米松(Sigma公司)，4～5周的雄性C57BL/6小鼠共60只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，肌酐和尿素氮测定试剂盒(深圳雷杜生命科学股份有限公司)，IL-6和TNF-αELISA检测试剂盒(Multisciences公司)，总超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、HE染色检测试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)、PAS染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)、ELISA检测试剂盒(Multisciences公司)、TUNEL检测试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

2.动物实验

2.1动物实验分组

4～5周的雄C57BL/6小鼠共60只适应性喂养1周后，随机分为空白对照组(control)组，淫羊藿次苷II(IS)组，顺铂模型(DDP)组，低剂量淫羊藿次苷II干预(DDP+低IS)组，高剂量淫羊藿次苷II干预(DDP+高IS)组和地塞米松干预(DDP+Dex)组，每组各10只，具体分组和给药干预方式如表1所示。

表1动物实验分组及给药干预方式

2.2.肾功能检测

按照表1分组和干预方式处理完成并继续饲养72h后获取小鼠肾脏，在肌酐和尿素氮试剂盒酶标包被板上设置标准品孔、空白孔、待测样品孔，按照肌酐和尿素氮试剂盒说明书分别配制好试剂上样。如待测样本量不够，则用样本稀释液进行稀释。在全自动生化仪上设置好相应参数，启动仪器自动测定血肌酐和尿素氮的数值，结果如图1～3和表2所示。

表2不同处理小鼠体重和肾功能情况

根据图1～3和表2可以看出，与顺铂模型组相比，高低两个剂量的淫羊藿次苷II都能改善小鼠的体重、肌酐和尿素氮，其中高剂量组的体重明显上升，肌酐和尿素氮显著下降，结果有统计学差异。

2.3肾组织HE染色、PAS染色和肾小管损伤评分

(1)固定：按照表1分组和干预方式处理完成并继续饲养72h后获取小鼠肾脏，将小鼠肾组织在质量浓度为4％多聚甲醛中固定24小时以上(4％多聚甲醛的体积为组织体积的10倍以上)；脱水：取出组织，流水冲洗，装入组织病理包埋框，做好标记，依次经浓度梯度增加的乙醇脱水；透明：在两道组织环保透明液中分别浸泡30分钟；浸蜡：在完全融化的石蜡中浸泡组织(石蜡熔点约54℃，无杂质)，浸蜡温度58℃，经石蜡浸泡4次，具体的：第一次浸泡40min、第二次浸泡40min、第三次浸泡1h、第四次浸泡1h后完成浸蜡；包埋：浸蜡后的组织转移至包埋机，掀开组织病理包埋框，按照制片所需观察部位进行石蜡包埋，做好标本编号的标记；切片：蜡块组织置于4℃冰箱预冷，先粗切除去多余组织，暴露组织最大面，然后将切片刻度调整至4～5μm的厚度进行细切。片子用毛笔挑取，在摊片机(水温37℃)中展片，预先标好编号的清洁玻璃片捞片；烤片：将玻璃片放置到50℃烘箱中烘烤，让组织中的石蜡充分烘干流出；脱蜡：将切片放入两道环保透明液中分别5min，脱去组织中的石蜡；复水：切片依次在浓度梯度降低的乙醇、蒸馏水分别中浸泡5min左右；染色：苏木素染色，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，伊红染液染色，流水冲洗；再次脱水、透明等程序后，最终用中性树脂封片(按照HE染色检测试剂盒说明书进行操作)，观察HE染色结果，具体如图4-1和4-2所示，其中图4-1从左到右依次为control组，IS组，DDP组，从上到下依次为HE染色结果50、100和200倍放大图；图4-2从左到右依次为DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组HE染色结果，从上到下依次为HE染色结果50、100和200倍放大图。

(2)肾组织制成石蜡块后切片，脱蜡至水，用高碘酸溶液浸泡5～10分钟，流水冲洗5min，Schiff氏液染色15～20分钟，流水冲洗5～10分钟，苏木素复染约3分钟，然后用盐酸酒精分化，水洗反蓝，脱水后经组织环保透明液透明，最后封片(按照PAS染色试剂盒说明书进行操作)，在镜下对肾小管损伤进行评分，评分标准为：无异常记0分；扩张明显、细胞扁平记1分；刷状缘损伤记1分；肾小管腔内有细胞脱落、坏死，但未成管型或细胞碎片记1分；管型记2分；刷状缘脱落记2分。

肾小管损伤评分情况如图5所示。其中图5control组，IS组，DDP组，DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组肾小管损伤评分依次为0.20±0.42、0.30±0.48、4.10±0.73、3.40±0.98、2.30±0.48和2.00±0.67。透射电镜图像如图6-1和图6-2所示。图6-1为透射电镜下肾小球组织的2000倍放大图，图6-2为透射电镜下肾小管组织的2000倍放大图。

根据图4-1、4-2、5、6-1和图6-2可以看出，高低两个剂量的淫羊藿次苷Ⅱ能不同程度地改善顺铂诱导的急性肾组织损伤，减少肾小管细胞内糖原沉积，减轻了肾组织的超微结构损害。高剂量淫羊藿次苷Ⅱ的改善效果明显，肾小管损伤评分有统计学差异。

2.4 ELISA检测

将冻存的小鼠血清样本置于冰上解冻。将control组，IS组，DDP组，DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组小鼠血清样本和标准品分别加入反应孔中，室温下孵育2小时。充分洗涤后加生物素化抗体工作液，除空白孔外，每孔加50μL，室温孵育1小时。洗涤后加酶结合工作液，除空白孔外，每孔加100μL，室温孵育30分钟。洗涤后每孔加入显色剂100μL，室温孵育5～30分钟，加入终止液100μL(按照ELISA检测试剂盒说明书进行操作)，酶标仪检测450nm处的光吸收值，根据标准品测得标准曲线，进而得出5control组，IS组，DDP组，DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组小鼠血清样本炎症因子IL-6、TNF-α、MDA和SOD含量(以上ELISA检测步骤委托上海联科生物科技有限公司进行)，结果如图7～10所示。

根据图7～8可以看出，control组，IS组，DDP组，DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组小鼠血清中的IL-6的表达水平依次为1.60±0.80、1.67±0.46、92.66±12.96、72.72±7.95、43.69±17.00和46.80±20.82pg/mL；TNF-α表达水平依次为5.89±1.63、6.76±2.00、20.28±2.62、15.58±3.52、11.57±3.70、和11.43±5.42pg/mL，顺铂使得血清中的IL-6和TNF-α显著升高，而高剂量淫羊藿次苷II的干预显著降低了炎症因子的数值，有效抑制了炎症。

根据图9～10可以看出，control组，IS组，DDP组，DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组小鼠血清中MDA的含量依次为3.08±0.85、3.24±1.03、6.98±1.40、5.62±1.42、4.16±1.21和3.88±1.03mmol/mg；SOD表达量依次为216.00±17.65、200.20±16.57、126.00±29.55、148.20±32.93、181.20±16.12和184.4±14.22U/mg，顺铂引起肾组织发生了氧化应激反应，使MDA含量显著增加，SOD含量显著降低。与顺铂模型组相比，高剂量淫羊藿次苷II和地塞米松的干预使MDA含量降低，同时也使得SOD含量上升，结果有统计学差异。

2.5肾组织TUNEL检测和凋亡相关蛋白的Westernblot检测

(1)按照表1分组和干预方式处理并继续饲养72h后获取小鼠肾脏，取各组肾组织的石蜡块切片，脱蜡并水化，用不含DNase I的蛋白酶K，37℃反应15～30分钟，以增加细胞通透性。PBS冲洗后滴加破膜工作液，室温孵育20分钟，PBS冲洗。加TdT酶和dUTP反应液，37℃反应2h，PBS冲洗。3％BSA，室温封闭30分钟。滴加一抗，4℃孵育过夜。加二抗室温孵育1小时(按照TUNEL检测试剂盒说明书进行)。DAPI避光染核，中性树脂封片；观察TUNEL染色结果并且统计阳性检测结果，具体如图11-1、11-2和12所示，其中图11-1从左到右依次为control组，IS组，DDP组，从上到下依次为TUNEL染色、DAPI染色merged(融合)染色图像；图11-2从左到右依次为DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组TUNEL染色结果，从上到下依次为TUNEL染色、DAPI染色和merged(融合)染色图像。图12control组，IS组，DDP组，DDP+低IS组，DDP+高IS组和DDP+Dex组阳性细胞率依次为0.40±0.55％、0.40±0.54％、34.80±8.17％、25.60±4.34％、14.60±4.45％和12.60±3.29％。

(2)抽提各组肾组织的蛋白，定量进行SDS-PAGE电泳分离，待电泳完毕后转印至硝酸纤维素膜，在室温下封闭，加入一抗，4℃过夜，再加入HRP标记的二抗，室温反应1小时，化学发光法显色，曝光显影，结果如图13所示，其中图13第1列为control组检测结果即DDP(－)+IS(－)，第2列为DDP组检测结果即DDP(+)+IS(－)，第3列为DDP+低IS组检测结果即DDP(+)+IS(40)，第4列为DDP+高IS组检测结果即DDP(+)+IS(80)。

根据图11～13可以看出，淫羊藿次苷Ⅱ可以缓解顺铂诱导的肾组织凋亡，改变凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax和β-ctin的表达。

本发明淫羊藿次苷Ⅱ能够干预顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型，降低小鼠的血肌酐和尿素氮水平，提高了小鼠体重；明显改善顺铂诱导的急性肾组织损伤，减少肾小管细胞内糖原沉积；显著降低小鼠的IL-6、TNF-α和MDA含量，也使得SOD含量上升，抑制炎症反应，并抑制氧化应激反应，降低肾组织的凋亡。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。