一种同时测定舒肝宁注射液中10个成分含量的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定舒肝宁注射液中10个成分含量的方法，包括以下步骤：S1，供试品溶液的制备：将用甲醇稀释了1000倍的舒肝宁注射液，涡混5min，之后再在14000rpm离心10min，得供试品溶液；S2，成分测定：采用超高液相色谱‑三重四级杆质谱联用仪，在特定色谱条件和特定质谱条件下对供试品溶液中羟基苯乙酮、咖啡酸、木犀草苷、野黄芩苷、黄芩素、千层纸素A、栀子苷、千层纸素A‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、腺苷10个成分含量进行测定。本发明采用液质联用技术建立了舒肝宁注射液中10个成分的含量测定方法，该方法测定时间短，精密度、稳定性、重复性好；可同时准确、快速地分析测定舒肝宁注射液中10个成分的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及舒肝宁注射液检测技术领域，尤其涉及一种同时测定舒肝宁注射液中10个成分含量的方法。

背景技术

舒肝宁注射液是依据传统中医理论和张仲景主编的《伤寒论》中记载的茵陈蒿汤肝病经典名方创新研发生产的新型中药复方制剂，其由茵陈、栀子、板蓝根、灵芝四种中药提取物和一种黄酮类原料药黄芩苷组成；具有清热解毒，利湿退黄，益气扶正，保肝护肝的功效；常用于湿热黄疸，面目俱黄，胸肋胀满，恶心呕吐，乏力，纳差，便溏；急、慢性病毒性肝炎症状者等。舒肝宁注射液是具有较好前景和升值潜力的品种，对于肝病临床治疗效果确切。

目前，有关舒肝宁注射液含量测定已有不少报道，仅限于其中单个药材或者部分药材个别成分或几个成分的含量测定，未见多个药材指标成分的研究。但舒肝宁注射液由茵陈、栀子、板蓝根、灵芝4种中药提取物和一种黄酮类原料药黄芩苷组成，目前关于其含量测定仅限于其中单个药材或者部分药材个别成分或几个成分的含量测定，未见多个药材指标成分的研究。因此，仅以单个药材或部分药材中指标成分作为其质量控制的方法不可靠，质量研究不够全面，难以全面控制其质量。

发明内容

本发明提供了一种同时测定舒肝宁注射液中10个成分含量的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种同时测定舒肝宁注射液中10个成分含量的方法，包括以下步骤：

S1，供试品溶液的制备：将用甲醇稀释了1000倍的舒肝宁注射液，涡混5min，之后再在14000rpm离心10min，得供试品溶液；

S2，成分测定：采用超高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，在特定色谱条件和特定质谱条件下对供试品溶液中羟基苯乙酮、咖啡酸、木犀草苷、野黄芩苷、黄芩素、千层纸素A、栀子苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、腺苷10个成分含量进行测定。

作为本技术方案的进一步改进方案：所述S1中，获得甲醇稀释了1000倍的舒肝宁注射液具体步骤为：分别精密吸取舒肝宁注射液100μL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，涡混5min，再取该溶液1mL至10mL容量瓶中，甲醇定容，即甲醇稀释了1000倍的舒肝宁注射液。

作为本技术方案的进一步改进方案：所述S2中，特定色谱条件为：色谱柱采用Waters BEH C18柱，保护柱采用Waters Van Guard BEH C18，流速为0.1-0.5mL/min，柱温为35-45℃，流动相为0.2％甲酸水(A)-0.2％甲酸乙腈(B)，进行梯度洗脱，进样体积为1μL。

作为本技术方案的进一步改进方案：流速为0.30mL/min。

作为本技术方案的进一步改进方案：柱温为40℃。

作为本技术方案的进一步改进方案：所述S2中，特定质谱条件为：采用电喷雾离子源，毛细管电离电压为2kV，离子源温度为140-160℃；喷雾气与反吹气是N2，去溶剂气流速为800-1200L/h，去溶剂气温度为500-700℃，扫描方式为多反应监测模式，质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站。

作为本技术方案的进一步改进方案：离子源温度为150℃。

作为本技术方案的进一步改进方案：去溶剂气流速为1000L/h。

作为本技术方案的进一步改进方案：去溶剂气温度为600℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用液质联用技术建立了舒肝宁注射液中10个成分的含量测定方法，该方法测定时间短，精密度、稳定性、重复性好；可同时准确、快速地分析测定舒肝宁注射液中10个成分的含量，可为进一步完善舒肝宁注射液的质量标准提供参考，为其在临床应用中的安全合理性奠定基础。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为供试品溶液的MRM色谱图；

图2为混合系列标准溶液的MRM色谱图；

图3为空白对照品溶液的MRM色谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在下列段落中参照附图以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

首先进行对照品溶液的配制：

对照品储备液的配制为：甲醇润洗容量瓶同时进行检漏操作。精密称取咖啡酸、野黄芩苷、黄芩素、黄芩苷、腺苷对照品适量置于不同的检定合格的10mL容量瓶中，精密称取对羟基苯乙酮、千层纸素A、木犀草苷、栀子苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品适量置于不同的检漏合格的5mL容量瓶中，分别加甲醇充分溶解，超声，定容，得到咖啡酸1.05mg/mL、野黄芩苷1.05mg/mL、黄芩素0.99mg/mL、黄芩苷1.08mg/mL、腺苷1.06mg/mL、对羟基苯乙酮1.09mg/mL、千层纸素A 0.81mg/mL、木犀草苷1.01mg/mL、栀子苷1.02mg/mL、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷1.13mg/mL共10种相应浓度的对照品储备液，-20℃保存，备用。

混合对照品溶液的配制为：分别精密吸取适量对照品储备液适量置于同一容量瓶中，加甲醇制成对羟基苯乙酮、咖啡酸、木犀草苷、野黄芩苷、黄芩素、千层纸素A、栀子苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、腺苷浓度分别为30.08、523.00、0.13、522.83、993.70、15.21、1271.25、636.14、51157.50、106.04μg/mL的混合对照品溶液，-20℃保存，备用。

然后进行供试品溶液的制备：分别精密吸取舒肝宁注射液100μL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，涡混5min，再取该溶液1mL至10mL容量瓶中，甲醇定容，即甲醇稀释了1000倍的舒肝宁注射液，涡混5min，14000rpm离心10min，得供试品溶液。

之后采用超高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪在特定色谱条件和特定质谱条件下对供试品溶液中羟基苯乙酮、咖啡酸、木犀草苷、野黄芩苷、黄芩素、千层纸素A、栀子苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、腺苷10个成分含量进行测定。

其中色谱条件：色谱柱：Waters BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)柱，保护柱：WatersVan Guard BEH C18(2.1mm×5mm，1.7μm)，流速为：0.30mL/min；柱温为40℃，流动相：0.2％甲酸水(A)-0.2％甲酸乙腈(B)，进样体积为1μL。梯度洗脱条件见表1。

表1液相色谱条件

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，毛细管电离电压为2kV，离子源温度为150℃；喷雾气与反吹气是N

表2十种成分的质谱条件

之后拟定的色谱条件和质谱条件，分别吸取空白对照溶液(甲醇)、混合系列标准溶液和供试品溶液进行测定，色谱图见图1-图3(其中1为对羟基苯乙酮，2为咖啡酸，3为木犀草苷，4为野黄芩苷，5为黄芩素，6为千层纸素A，7为栀子苷，8为千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，9为黄芩苷，10为腺苷)。结果显示，所建立的方法具有良好的专属性，可用于含量测定研究。

线性关系：精密量取上述混合对照品溶液适量，采用倍数稀释法,用甲醇分别稀释制得不同浓度梯度的系列标准溶液，按拟定的色谱条件和质谱条件进样分析，记录各个成分的峰面积。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。回归方程、相关系数及线性范围见表3。结果表明，10个成分拟定的色谱条件和质谱条件下，线性关系良好。

表3舒肝宁注射液中10种成分的标准曲线及线性范围

精密度试验：取同一批号供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算精密度，结果见表4。结果显示10个成分峰面积RSD在0.10％～1.97％之间，表明仪器精密度良好。

表4舒肝宁注射液中10个成分的精密度实验结果(峰面积，n＝6)

重复性试验：取同一批号舒肝宁注射液6份，按上述方法制备供试品溶液，分别测定，结果见表5。6份供试品溶液中10个成分的含量平均值的RSD均小于2.50％，表明此方法的重复性良好。

表5舒肝宁注射液中10个成分的重复性实验结果(ng/mL，n＝6)

稳定性考察：取同一批号(批号20210422)供试品溶液，于0、2、4、8、12、24h分别进样，测定各成分的峰面积见表6。结果表明供试品溶液在24h内稳定。

表6舒肝宁注射液中10个成分的稳定性实验结果(峰面积，n＝6)

回收率实验：精密量取6份同一批号(批号20210422)舒肝宁注射液50μL置于10mL容量瓶中，精密加入10个成分的对照品溶液适量，加甲醇稀释至刻度，涡混5min，再取该溶液1mL至10mL容量瓶中，甲醇定容，涡混5min，14000rpm离心10min，按拟定的色谱条件和质谱条件进样分析，10个成分的回收率为95.63％～102.04％，结果表明回收率良好，结果见表7。

表7舒肝宁注射液中10个成分的回收率实验结果(ng/mL，n＝6)

16批不同批号的舒肝宁注射液各2份，按照上述方法制备供试品溶液，按拟定的色谱条件和质谱条件进样测定，记录10个成分的色谱峰面积，代入各成分相应的标准曲线，分别计算对羟基苯乙酮、咖啡酸、木犀草苷、野黄芩苷、黄芩素、千层纸素A、栀子苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、腺苷的含量，结果见表8。

表816批舒肝宁注射液中10个成分的含量测定结果(μg/mL，n＝2)

本发明的原理是：

对舒肝宁注射液中10个成分进行测定，16批样品中对羟基苯乙酮、咖啡酸、木犀草苷、野黄芩苷、黄芩素、千层纸素A、栀子苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、腺苷的平均含量分别为：5.95、54.51、0.32、52.61、133.90、4.57、543.43、304.51、21650.17、30.27μg/mL；含量波动范围为：3.97～7.67、48.16～58.47、0.27～0.48、44.18～65.40、120.22～163.57、3.05～6.15、494.83～622.43、267.28～344.98、20806.15～22682.46、27.04～38.78μg/mL；含量波动均在平均值的66.67％～147.53％之内，其中对羟基苯乙酮和千层纸素A的含量波动范围最大。从结果可以看出，不同批号的舒肝宁注射液中10个成分的含量具有一定的差异，可能与舒肝宁注射液复方中各中药药材来源有关。

综上所述，本发明采用液质联用技术建立了舒肝宁注射液中10个成分的含量测定方法，该方法测定时间短，精密度、稳定性、重复性好；可同时准确、快速地分析测定舒肝宁注射液中10个成分的含量，可为进一步完善舒肝宁注射液的质量标准提供参考，为其在临床应用中的安全合理性奠定基础。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上所述而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。