一种检测血清中激素的方法以及样本前处理方法

摘要

本发明公开了一种检测血清中激素的方法以及样本前处理方法，涉及生物检测技术领域。具体而言，本发明通过将体积比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)的乙腈和甲醇的混合溶液作为沉淀剂对血清样本进行前处理，在该条件下处理血清，能够达到净化目的，基质干扰较少，使得四种激素进行上机检测时，与杂质分离的效果较好，能够同时实现四氢脱氧皮质酮、17a‑羟孕酮、5α‑雄甾烷‑3α，17β‑二醇以及雌三醇‑16‑葡萄糖醛酸的有效检测，该方法具有操作简单，重现性好，灵敏度高且准确可靠的优点，可实现大批量样本的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种检测血清中激素的方法以及样本前处理方法。

背景技术

文献报道孕妇体激素的水平与分娩日期有一定的相关性。这些激素的体内含量与分娩日期的具体联系研究并不是很清楚。为了建立这些激素水平与预测分娩日期之间的预测模型，以准确预测分娩日期，需要建立血清中几种激素的准确定量方法。这些激素包括：四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇、雌三醇-16-葡萄糖醛酸。

现有大多是检测单种激素，目前没有一次性检测以上四种激素的液相色谱质谱联用方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测血清中激素的方法以及样本前处理方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种检测血清中激素的样本前处理方法，其包括：采用沉淀剂对血清样本进行蛋白沉淀；所述沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液，在沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；

所述激素包括四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇、雌三醇-16-葡萄糖醛酸中的至少一种。

第二方面，本发明实施例提供了一种检测血清中激素的方法，其包括采用如前述实施例所述的检测血清中激素的样本前处理方法对样本进行前处理，并对处理后的样本进行液相色谱串联质谱检测；其中，所述激素包括四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇、雌三醇-16-葡萄糖醛酸中的至少一种；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

第三方面，本发明实施例提供了一种用于检测血清中激素的试剂盒，其包括：沉淀剂、流动相A和流动相B；其中，所述沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液，在所述沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述流动相A为含体积分数为0.08％～0.12％甲酸的水溶液，所述流动相B为含体积分数为0.08％～0.12％甲酸的乙腈溶液；所述激素包括四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇、雌三醇-16-葡萄糖醛酸中的至少一种。

本发明具有以下有益效果：

本发明选择体积比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)的乙腈和甲醇的混合溶液作为沉淀剂对血清样本进行前处理，在该条件下处理血清，能够达到净化目的，基质干扰较少，使得四种激素进行上机检测时，与杂质分离的效果较好，能够同时实现四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇、雌三醇-16-葡萄糖醛酸的有效检测，该方法具有操作简单，重现性好，灵敏度高且准确可靠的优点，可实现大批量样本的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为17α-羟孕酮及内标提取离子流图；

图2为四氢脱氧皮质酮及内标提取离子流图；

图3为5α-雄甾烷-3α，17β-二醇及内标提取离子流图；

图4为雌三醇-16-葡萄糖醛酸及内标提取离子流图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供了一种检测血清中激素的样本前处理方法，其包括：采用沉淀剂对血清样本进行蛋白沉淀；所述沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液，在沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；

所述激素包括四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇和雌三醇-16-葡萄糖醛酸中的至少一种，或四种激素中的任意2种、3种，更优选为4种激素。

本申请的发明人经一系列创造性劳动，从众多试剂中发现，采用上述沉淀剂处理纯化血清，在该条件下处理血清，能够到达净化目的，四种激素上机检测时，与杂质分离效果较好。若采用其他现有的沉淀剂，则导致无法实现4种激素的同时有效检测，如乙腈作为沉淀剂时，则可能导致四氢脱氧皮质酮干扰较多，上机检测时不能与杂质实现基线分离；若只采用甲醇进行蛋白沉淀，上机检测时，雌三醇-16-葡萄糖醛酸干扰较多，影响定量。

此外，本发明提供的前处理方法对血清样本进行处理，经一步蛋白沉淀即可有效完成对血清样本的净化，无需进行其他繁杂的步骤，如进一步进行衍生化等。

具体地，在所述沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比可以为(0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5中的任意一种)：(0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5中的任意一种)，优选为1：1。

优选地，进行所述蛋白沉淀时，所述血清样本与蛋白沉淀的体积比为(40～60)：(150～250)，具体可以为(40、50和60中的任意一种)：(150、170、190、200、220、230和250中的任意一种)，优选为50：200。

优选地，所述样本前处方法还包括将蛋白处理后的溶液静置1～3h后，进行离心，取上清液用于检测。

优选地，静置的温度为﹣10～﹣30℃，具体可以为﹣10℃、﹣12℃、﹣14℃、﹣16℃、﹣18℃、﹣20℃、﹣22℃、﹣24℃、﹣26℃、﹣28℃和﹣30℃中的任意一种或任意两种之间的范围，静置的时间可以为1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h和3h中的任意一种或任意两种之间的范围。

可选地，离心的条件可以为：13000～17000rpm/min，1～4℃，离心5～15min，优选为15000rpm/min，4℃，离心10min。

本发明实施例还提供了一种检测血清中激素的方法，其包括采用如前述任意实施例所述的检测血清中激素的样本前处理方法对样本进行前处理，并对处理后的样本进行液相色谱串联质谱检测；所述激素包括四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇和雌三醇-16-葡萄糖醛酸中的至少一种。

所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。所述样本包括血清样本，具体包括但不限于为含有血清样本的环境样本、孕妇的血清样本或正常人的血清样本，当样本为孕妇的血清样本时，通过测定血清样本中四种激素的含量，可以研究孕妇体内激素水平与分娩日期的关系，最终达到准确预测分娩日期的目的；当样本为正常人的血清样本时，通过测定样本中激素含量，可以了解正常人体内激素的分泌水平。

优选地，质谱采用ESI离子源，检测方法为正负离子检测，扫描方式为多重反应监测。

优选地，进行质谱检测时，四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮和5α-雄甾烷-3α，17β-二醇采用正离子模式，雌三醇-16-葡萄糖醛酸采用负离子模式进行扫描。

本发明采用液相色谱与三重四级杆质谱联用仪进行检测，质谱检测模式为多反应监测(Multiple Reaction Monitoring，MRM)。其原理为：经过液相色谱系统分离后，待测物进入质谱检测器。每种待测物在离子源被离子化，带上电荷进入质谱，经过一级筛选后，具有特异性的母离子进入二级质谱。在碰撞室可以将选定的特异性母离子进行碰撞诱导，去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。信号采集过程中，经过两次筛选，特定目标物最终到达检测器，被检测器捕获，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰。

优选地，质谱条件中4种激素的检测离子对为：四氢脱氧皮质酮：335.3→317.1，17a-羟孕酮：331.4→109.2，5α-雄甾烷-3α，17β-二醇：275.0→257.2，雌三醇-16-葡萄糖醛酸：463.2→287.1。离子对为本申请发明人经一系列创造性劳动后建立的。

优选地，质谱的电参数包括：四氢脱氧皮质酮：去簇电压为100～120V，碰撞电压为40～60V，17a-羟孕酮：去簇电压为120～140V，碰撞电压为20～40V，5α-雄甾烷-3α，17β-二醇：去簇电压为100～120V，碰撞电压为10～30V，雌三醇-16-葡萄糖醛酸：去簇电压为-120～-140V，碰撞电压为-30～-50V。

优选地，所述色谱包括采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；

所述流动相A为含体积分数为0.08％～0.12％甲酸的水溶液，甲酸的体积分数具体可以为0.08％、0.09％、0.1％、0.11％和0.12％中的任意一种或任意两种之间的范围。

所述流动相B是含体积分数为0.08％～0.12％甲酸的乙腈溶液；甲酸的体积分数具体可以为0.08％、0.09％、0.10％、0.11％和0.12％中的任意一种或任意两种之间的范围。

优选地，所述梯度洗脱的程序如下：

0～0.5min，流动相A的体积百分比维持在70％～90％，流动相B的体积百分比维持在10％～30％；

0.5～2min，流动相A体积百分比由70％～90％降至10％～30％，流动相B体积百分比由10％～30％增至70％～90％；

2～4.8min，流动相A体积百分比维持在10％～30％，流动相B体积百分比维持在70％～90％；

4.8～5min，流动相A体积百分比由10％～70％增至70％～90％，流动相B体积百分比由70％～90％降至10％～30％；

5～5.5min，流动相A体积百分比保持在70％～90％，流动相B体积百分比保持在10％～30％。

优选地，色谱条件如下：液相采用SHIMADZU LC-20ADXR，色谱柱为thermoscientific Hypersil GOLD 3μm，50×2.1mm。

本发明提供的方法可以同时检测四种激素的含量，方法灵敏度高，重现性好，17α-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇以及四氢脱氧皮质酮的检出限均达到0.1ng/ml，雌三醇-16-葡萄糖醛酸的检出限达到1ng/ml。且样本用量少，仅需50μl血即可实现对血清中4种激素的有效检测，且用时较短，4种待测物与杂质的分离效果好，定量准确有效。

此外，本发明实施例还提供了一种用于检测血清中激素的试剂盒，其包括：沉淀剂、流动相A和流动相B；所述沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液，在所述沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述流动相A为含体积分数为0.08％～0.12％甲酸的水溶液，所述流动相B为含体积分数为0.08％～0.12％甲酸的乙腈溶液。需要说明的是，流动相A、流动相B以及沉淀剂的具体范围同前述任意实施例所述，在此不再赘述。

所述激素包括四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇和雌三醇-16-葡萄糖醛酸中的至少一种。

优选地，所述试剂盒还包括激素的内标品、标准品和质控品中的至少一种。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种检测血清中四种激素(四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇、雌三醇-16-葡萄糖醛酸)的方法，其包括以下步骤。

(1)样本前处理

蛋白沉淀：50μL血清加入200μL沉淀剂，2500rpm混匀5min。于-20℃放置2h后取出，15000rpm/min，4℃条件下离心10min，取上清用于后续进样检测。

其中，所述沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液，在沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为1：1。

(2)液相色谱串联质谱检测

液相采用SHIMADZU LC-20ADXR，色谱柱为thermo scientific Hypersil GOLD 3μm，50×2.1mm，采用梯度洗脱的方式在5.5分钟内，实现待测物与杂质的分离。其中，所述流动相A为含体积分数为0.1％甲酸的水溶液，所述流动相B是含体积分数为0.1％甲酸的乙腈溶液。

洗脱条件如表1所示。

表1洗脱条件

采用正负离子同时扫描的模式对四种激素进行检测。其中，四氢脱氧皮质酮、17a-羟孕酮、5α-雄甾烷-3α，17β-二醇采用正离子模式，雌三醇-16-葡萄糖醛酸采用负离子模式进行扫描。四种激素的质谱条件如表2所示。

表2质谱条件

离子源参数如表3所示。

表3离子源参数

检测样本时四种化合物的提取离子流图见图1～4，其中，17α-羟孕酮及内标提取离子流图见图1，出峰时间为2.79min；四氢脱氧皮质酮及内标提取离子流图见图2，出峰时间为2.83min；5α-雄甾烷-3α，17β-二醇及内标提取离子流图见图3，出峰时间为2.93min；雌三醇-16-葡萄糖醛酸及内标提取离子流图见图4，雌三醇-16-葡萄糖醛酸出峰时间为2.17min，内标出峰时间为2.42min。

对比例1

一种检测血清中四种激素的方法，大致与实施例1相同，区别在于，沉淀剂不同，沉淀剂为乙腈。

对比例2

一种检测血清中四种激素的方法，大致与实施例1相同，区别在于，沉淀剂不同，沉淀剂为甲醇。

试验例1

比较实施例1、对比例1和2的三种沉淀剂对加标回收率的影响。

具体结果如下表4所示，以乙腈为沉淀剂时，四氢脱氧皮质酮干扰较多，导致加标回收率偏高；以甲醇为沉淀剂时，5α-雄甾烷-3α，17β-二醇上机检测，与杂质分离效果较差，导致加标回收率偏高。

表4加标回收率

试验例2

验证实施例1提供的方法的定量下限，结果如表5所示。

表5定量下限

考察方法加标回收率，以孕妇混合血清作为基质，加入标准溶液，每个浓度平行制备5份。加标回收率结果如表6所示。

表6加标回收率

对比例3

一种检测血清中四种激素的方法，大致与实施例1相同，区别在于，流动相的不同，流动相B为含体积分数为0.1％甲酸的甲醇溶液。

甲醇作为流动相时，5α-雄甾烷-3α，17β-二醇峰展宽，灵敏度变差，检出限约为1ng/mL，无法满足样本检测要求。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。