东紫苏或其提取物在制备防治急性肺炎药物中的应用

摘要

本发明公开了东紫苏或其提取物在制备防治急性肺炎药物中的应用，所述药物为抑制肺组织支气管肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出、抑制肺部中相关炎性因子的表达、抑制血浆中相关炎性因子的表达、改善肺部炎症反应造成的病理损伤的药物。本发明的东紫苏提取物在较低剂量下均可以有效的抑制急性肺损伤模型小鼠肺组织支气管肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出，抑制炎症模型小鼠肺部和血浆中相关炎性因子的表达，有效改善小鼠肺部炎症反应造成的病理损伤；本发明的原料来自于天然产物采集方便，安全性高。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及东紫苏或其提取物在制备防治急性肺炎药物中的应用。

背景技术

研究肺部炎症反应较为理想的模型是动物急性肺损伤模型，尽管科研人员在实验室和临床对急性肺损伤进行了深入研究，其致死率依旧非常高。并且目前治疗急性肺损伤的西药的副作用较大，且易产生耐药性。为了预防或治疗急性肺炎进程，急待从天然产物中寻找得到一种安全有效预防或治疗急性肺炎的药物。

东紫苏(ElsholtiziabodinieriVaniot)是唇形科香薷属多年生草本植物，主要分布在云南、贵州及甘肃部分地区。东紫苏是传统食药两用植物，在云南又名小山茶、松毛茶等，很多少数民族地区将其枝叶泡水当凉茶饮用，有清热降火的作用，是一种天然保健饮品。另外，东紫苏味辛性平以全草入药，《全国中草药汇编》和《云南中草药》等均有记载，有解热、镇痛、止吐、消炎、抗病毒等功效。据报道，东紫苏富含三萜类、芳香油类、黄酮类等成分，其提取物具有抗氧化、抗疲劳和抗病毒活性，并且东紫苏提取物安全没有致突变作用。但目前国内外关于东紫苏提取物抗炎的研究未见有专利文献报道。本专利相关研究得到国家自然科学基金资助(批准号：32160106)。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了东紫苏或其提取物在医药方面的新用途，将东紫苏或其提取物应用在制备预防和/或治疗急性肺炎的新药物中。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的在于提供东紫苏或其提取物在制备防治急性肺炎药物中的应用，所述药物为抑制肺组织支气管肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出、抑制肺部中相关炎性因子的表达、抑制血浆中相关炎性因子的表达、改善肺部炎症反应造成的病理损伤的药物。

进一步地，所述东紫苏提取物通过以下方法制备：

(1)将东紫苏粉碎成粉末，对东紫苏粉末进行脱色：加入石油醚超声后进行抽滤，旋蒸回收石油醚，获得东紫苏残渣；

(2)将步骤(1)中的东紫苏残渣晾干，加入80％甲醇溶液超声提取后抽滤，获得东紫苏滤渣；

(3)将步骤(2)中的东紫苏滤渣中加入80％甲醇溶液进行超声提取2～ 3次，合并提取液；旋蒸提取液回收甲醇直至获得水相；将所述水相继续旋蒸浓缩得到浓缩液，将浓缩液在-20℃冰箱预冻，再用冻干机冻干即得到东紫苏 80％甲醇溶液提取物(冻干粉)。

进一步地，所述步骤(1)中，所述东紫苏粉末与石油醚的质量体积比为 1g:10mL。

进一步地，步骤(1)中所述超声为在60-70w功率下超声30～35min；所述旋蒸回收石油醚为3次。

进一步地，所述步骤(2)和步骤(3)中，东紫苏残渣与甲醇溶液的质量体积比、东紫苏滤渣与甲醇溶液的质量体积比均为为1g:10mL。

进一步地，步骤(2)和步骤(3)中所述超声提取均为在300-320w功率下超声提取30～35min。

在本发明中，所述东紫苏提取物在防治急性肺炎的药物中的浓度优选为 200mg/kg～600mg/kg。本发明对药物的剂型、药物的辅料和药物的制备方法无特殊要求，采用本领域技术人员熟知的即可。本发明预防和/或治疗急性肺炎的新药物是以东紫苏提取物为活性成分，用于制备防治急性肺炎的药物，还可以加入一种或多种药物制剂上可接受的辅料，或者与其他活性成分复配发挥协同抗急性肺炎的作用。

本发明对东紫苏或其提取物防治急性肺炎进行了系列研究。证实了东紫苏提取物可以显著抑制肺组织支气管肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出；可以显著抑制炎症模型小鼠肺部和血浆中相关炎性因子的表达；可以有效改善小鼠肺部炎症反应造成的病理损伤；总体来说有效的改善了脂多糖诱导的急性肺损伤模型小鼠的肺部炎症并提高其肺功能，对于预防或治疗急性肺炎的效果与空白对照组几乎相当。本发明提供的东紫苏或其提取物对防治急性肺炎有显著的作用，且东紫苏植物分布广泛，安全性高，价格低廉，原料易得；东紫苏或其提取物在制备防治急性肺炎药物中拥有良好的开发应用前景。

综上所述，相比于现有技术，本发明的优点在于：

1、本发明为东紫苏提取物发掘了新的医疗用途。

2、本发明通过实验发现东紫苏提取物在较低剂量下均可以有效的抑制急性肺损伤模型小鼠肺组织支气管肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出，抑制炎症模型小鼠肺部和血浆中相关炎性因子的表达，有效改善小鼠肺部炎症反应造成的病理损伤；本发明的原料来自于天然产物采集方便，安全性高。

3、本发明东紫苏提取物提取工艺简单，成本低廉，适于工业化生产和市场推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的东紫苏的液相检测结果图；

图2为本发明东紫苏提取物对小鼠支气管肺泡灌洗液细胞和蛋白的影响柱状图，其中图A表示支气管肺泡灌洗液细胞数；图B表示支气管肺泡灌洗液蛋白量；C为空白对照组；Model为LPS诱导模型组；EBEL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；EBEH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；DXM为阳性组(地塞米松)；

图3为本发明小鼠肺部炎性因子的表达量，其中图A表示小鼠肺组织中 IL-6的表达量；图B表示肺组织中IL-1β的表达量；图C表示肺组织中MPO 的表达量；C为空白对照组；Model为LPS诱导模型组；EBEL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；EBEH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；DXM为阳性组(地塞米松)；

图4为本发明小鼠血浆中炎性因子的表达量，其中图A表示小鼠血浆中 IL-6的表达量；图B表示小鼠血浆中IL-1β的表达量；图C表示小鼠血浆中 NO的表达量；C为空白对照组；Model为LPS诱导模型组；EBEL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；EBEH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；DXM为阳性组(地塞米松)；

图5为本发明小鼠肺组织切片的HE染色图，其中Control为空白对照组； Model为LPS诱导模型组；EBEL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；EBEH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；DXM为阳性组(地塞米松)。

具体实施方式

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有开展创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1

本实施例的东紫苏提取物的制备：

东紫苏全草采自云南文山，经自然晾干后打粉，得到东紫苏全草干粉。称取50g东紫苏全草干粉，加入石油醚在60w功率下超声30min，东紫苏干粉与石油醚的质量体积比为1g:10mL，然后抽滤，石油醚部分旋蒸回收，重复3次，保留东紫苏残渣。将脱色后的东紫苏残渣晾干，加入80％甲醇在300w 功率下超声30min，东紫苏与甲醇的质量体积比为1g:10mL，然后抽滤，所得东紫苏滤渣继续加80％甲醇在300w功率下超声30min，保留提取液，此步骤重复3次；然后旋蒸提取到旋蒸瓶只有水相，回收甲醇，水相继续旋蒸浓缩，接着在-20℃冰箱预冻，最后用冻干机冻干即得到东紫苏80％甲醇提取物(冻干粉)。

通过UPLC-MS/MS技术对东紫苏80％甲醇提取物的主要化学成分进行了定性分析，分析结果见图1所示。

由图1可知：东紫苏80％甲醇提取物的9种主要化学成分分别是奎尼酸(1)，绿原酸(2)，芹黄素(3)，木犀草素-7-O-芸香糖苷(Luteolin-7-O-rutinoside)(4)，芒花甙(5)，木犀草苷(6)，Cosmosiin(7)，迷迭香酸(8)，(2R)eriodictyol 7-O-(6"-3,4-dihydroxycinnamoyl)-β-D-glucopyranoside(9)。

本发明提供了上述制备方法得到的东紫苏提取物在制备急性肺炎药物中的应用。

本发明还提供了东紫苏提取物在制备通过抑制肺组织支气管肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出实现防治急性肺炎药物中的应用。

本发明还提供了东紫苏提取物在制备通过抑制肺部中相关炎性因子的表达实现防治急性肺炎药物中的应用。

本发明还提供了东紫苏提取物在制备通过抑制血浆中相关炎性因子的表达实现防治急性肺炎药物中的应用。

本发明还提供了东紫苏提取物在制备通过改善肺部炎症反应造成的病理损伤实现防治急性肺炎药物中的应用。

实施例2

本实施例为东紫苏提取物对防治急性肺炎的活性评价：

2.1急性肺部炎症小鼠模型的建立及实验过程

以C57BL/6J雄性小鼠(8周龄，重量20g左右)为研究对象，每组15 只小鼠。利用鼻灌注LPS(0.5mg/kg)方式诱导急性肺部炎症反应，构建小鼠急性肺损伤模型，造模12小时。通过灌胃实施例1得到的东紫苏80％甲醇提取物来评价其对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的防治效果；小鼠购买以后在标准环境下适应7d，小鼠按照标准饲料进行饲养。具体实验流程及分组如下：

空白对照组：灌胃给予等体积纯净水；

模型组：按体重用移液器鼻灌注LPS(0.5mg/kg)，造模12小时；

东紫苏低剂量组：连续7d灌胃给予200mg/kg东紫苏80％甲醇提取物，解剖前用LPS造模24h；

东紫苏高剂量组：连续7d灌胃给予600mg/kg东紫苏80％甲醇提取物，解剖前用LPS造模24h；

阳性对照组：在造模前1h灌胃给予10mg/kg地塞米松，然后按体重用移液器鼻灌注LPS(0.5mg/kg)，造模24h；

2.2检测活性成分对模型小鼠支气管肺泡灌洗液细胞数和蛋白含量的影响：

2.2.1取各组小鼠，气管插管，用预冷PBS灌洗支气管肺泡，取灌洗液4℃下以1500转离心5分钟，收集上清液用BCA试剂盒检测总蛋白含量；剩余细胞用预冷PBS重悬，用瑞氏-吉姆萨复合染色液(Wright-Giemsa)染色4 分钟，离心清洗去除染料，立即用血细胞计数板在显微镜下对巨噬细胞和中性粒细胞分开计数。

2.2.2实验结果：

东紫苏提取物对模型小鼠支气管肺泡灌洗液细胞数和总蛋白含量的影响：

肺泡灌洗液检验可用于评价间质性肺疾病的炎症反应分期，诊断肺部疾病。通过分析支气管肺泡灌洗液细胞数和总蛋白含量，可以对某些呼吸系统疾病进行病情分析检测，特别是发病机制的研究能起到相当重要的作用。当肺部感染、发生炎症时，会发生肺泡炎性细胞浸润，肺泡灌洗液细胞数会明显增多，肺组织支气管肺泡细胞蛋白会渗出，肺泡灌洗液总蛋白含量也会增多。

本发明通过对各处理小鼠支气管肺泡灌洗液细胞数和总蛋白含量的多少来评价东紫苏提取物对急性肺损伤模型小鼠的作用情况，结果见图2，其中图A表示支气管肺泡灌洗液细胞数，图B表示支气管肺泡灌洗液蛋白量。C为空白对照组；Model为LPS诱导模型组；EBEL为低剂量灌胃组(200mg/kg)； EBEH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；DXM为阳性组(地塞米松)；*表示 p<0.05；**表示p<0.01。

2.3检测活性成分对模型小鼠肺组织炎性因子及相关蛋白表达影响：

2.3.1取各组小鼠，无菌术取肺组织，用无菌预冷PBS冲洗后，取100mg 肺组织加900μl无菌预冷PBS在4℃下匀浆，离心取上清液，用相应试剂盒检测各组小鼠肺组织中IL-6、IL-1β、MPO表达情况。

2.3.2实验结果

炎症因子是指参与炎症反应的各种细胞因子，当肺部受到外界刺激，肺部细胞就会产生免疫应答，分泌大量的炎症因子，甚至引发更强的炎症反应。一般炎症因子有白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)等。IL-6作为一种促炎和调节免疫的多效能细胞因子，具有炎症放大作用，参与疾病的发生发展过程及机体的炎症反应和免疫应答。IL-6对肺的损伤主要是由于肺部感染造成的炎症和氧化应激刺激肺组织局部的巨噬细胞等活化，促进IL-6分泌，而IL-6可激活中性粒细胞在炎症部位的聚集，从而释放大量的酶和氧自由基，造成肺毛细血管通透性增高和肺上皮细胞的变性、坏死。IL-1β是启动炎症的信号。MPO是一种血红素蛋白，富含于中性粒细胞中,由粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并存储于噬天青颗粒内。MPO可以通过催化氧化氯离子产生次氯酸在吞噬细胞内杀灭微生物，破坏多种靶物质，对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用。

本发明通过用相应试剂盒检测各组小鼠肺组织中IL-6、IL-1β、MPO的表达情况来考察东紫苏提取物对急性肺损伤小鼠的影响，效果见图3。其中图A表示肺组织中IL-6的表达量；图B表示肺组织中IL-1β的表达量；图C表示肺组织中MPO的表达量。C为空白对照组；Model为LPS诱导模型组；EBEL 为低剂量灌胃组(200mg/kg)；EBEH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；DXM 为阳性组(地塞米松)；*表示p<0.05。

图3结果显示，东紫苏提取物能使炎症模型小鼠肺组织中IL-6表达显著降低(*，p<0.05)，IL-1β表达显著降低(*，p<0.05)，MPO表达显著降低(*，p<0.05)。说明东紫苏提取物能显著抑制炎症模型小鼠肺部相关炎性因子的表达。

2.4检测活性成分对模型小鼠血浆中炎性因子的影响：

2.4.1取各组小鼠，抗凝管眼球采血，2500转离心5分钟取上清血浆，用相应试剂盒检测各组小鼠血浆中IL-6、IL-1β、NO表达情况。

2.4.2实验结果

NO具有促炎作用，在炎症部位，NO作用于血管平滑肌细胞，升高其cGMP 水平，使血管舒张，通透性增高，以利于炎症介质和致痛物质达到作用部位，在炎症反应中增加单核细胞向炎症部位的渗入。在免疫性炎症发病进程中，体内NO水平升高可从多个途径影响病理进程。

本发明通过用相应试剂盒检测各组小鼠血浆中IL-6、IL-1β、NO的表达情况来考察东紫苏醇提物对急性肺损伤小鼠的影响，效果见图4。其中图A表示血浆中IL-6表达量；图B表示血浆中IL-1β表达量；图C表示血浆中NO 表达量。C为空白对照组；Model为LPS诱导模型组；EBEL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；EBEH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；DXM为阳性组(地塞米松)；*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图4结果显示，东紫苏提取物能使炎症模型小鼠血浆中IL-6表达显著降低(**，p<0.01)，IL-1β表达显著降低(*，p<0.05)，NO表达显著降低(**， p<0.01)。说明东紫苏提取物能显著抑制炎症模型小鼠血浆中相关炎性因子的表达。

2.5检测活性成分对模型小鼠肺组织结构的影响：

2.5.1取各组小鼠，无菌术取肺组织，用无菌预冷PBS冲洗后固定制作石蜡切片，经HE染色后显微镜下观察组织结构变化情况。

石蜡切片的制备方法：

(1)取材：新鲜肺组织用10％的福尔马林溶液固定24h以上。将肺组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；

(2)脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精 4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇I 30min，无水乙醇 II 30min，醇苯5-10min，二甲苯I 5-10min，二甲苯II 5-10min，65℃融化石蜡I 1h，65℃融化石蜡II 1h，65℃融化石蜡III 1h；

(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；

(4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm；切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片，水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

HE染色方法如下：

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min- 无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗；

(2)苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；

(3)伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

(4)脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片；

(5)显微镜镜检，图像采集分析。

2.5.2实验结果

本实验采用HE染色，对小鼠肺组织结构进行了观察，结果见图5。

由图5结果可知，东紫苏提取物能明显减少支气管肺泡间炎性渗出物，明显降低组织炎性细胞浸润，维持支气管肺泡上皮细胞完整性。说明东紫苏提取物能明显改善小鼠肺部炎症反应造成的病理损伤。

东紫苏提取物的制备方法：加入石油醚在70w功率下超声35min、或加入石油醚在65w功率下超声33min，80％甲醇超声提取为320w功率下超声提取35min或32min，其余与实施例中的一致，均可制备出防治急性肺炎可东紫苏提取物。

综上所述，东紫苏提取物可以显著抑制肺组织支气管肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出；可以显著抑制炎症模型小鼠肺部和血浆中相关炎性因子的表达；可以有效改善小鼠肺部炎症反应造成的病理损伤。本发明提供的东紫苏提取物对防治急性肺炎有显著的作用，且原料来自于天然产物，安全性高，成本低廉，适用于工业化生产和市场推广应用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。