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2022-09-16
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/68 专利申请号:2022104396572 申请日:20220425
实质审查的生效
技术领域
本发明属于核辐射损伤检测技术领域,具体涉及Hp蛋白在构建辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂中的应用。
背景技术
由于核能源在军事、工业等多方面应用日益广泛,发生大规模核事故的风险也随之上升,而事故一旦发生会在短时间内产生大量急性放射损伤病人。根据现有研究及临床实践,不同剂量电离辐射可引起不同类型的急性放射病,治疗方案和预后也有明显不同。所以在事故发生早期能否对大规模的伤员及时进行受照剂量评估及伤情分类,尤其是对重症伤员的早期识别是引导医务人员及时制定救治方案,减少伤亡的关键因素。
由于事故的突发性,受照人员通常没有随身携带物理剂量计,所以对于核事故后批量伤员的伤情分类和剂量评估主要依赖于生物剂量估算技术。已经得到应用的辐射生物剂量估算的方法主要有淋巴细胞染色体畸变分析、淋巴细胞计数分析、淋巴细胞γ-H2AX分析等。其中染色体畸变分析方法被称为辐射生物剂量估算“金标准”,该方法具有较好的特异性与较高的准确性,但其实验方法复杂,对操作人员有较高的要求,而且需要对细胞进行48小时的培养才能进行标本制备和分析,检测范围仅限于0.1Gy-6Gy(Abe Y,Yoshida MA,Fujioka K,et al.Dose-response curves for analyzing of dicentric chromosomesand chromosome translocations following doses of 1000mGy or less,based onirradiated peripheral blood samples from five healthy individuals.J RadiatRes.2018;59(1):35-42.)(Jang MA,Han EA,Lee JK,et al.Dose Estimation CurvesFollowing In Vitro X-ray Irradiation Using Blood From Four Healthy KoreanIndividuals.Ann Lab Med.2019;39(1):91-95.)。近年来,染色体分析技术实现了细胞收获、制片及分析的自动化,解决了标本制备和分析人工操作通量低的问题,但是仍然需要48小时细胞培养,剂量上限仍然未突破6Gy。6Gy以上剂量电离辐射可导致人体明显造血功能抑制,通常需要造血因子应用和造血干细胞移植治疗(Nanduri LSY,Duddempudi PK,YangWL,et al.Extracellular Vesicles for the Treatment of Radiation Injuries.FrontPharmacol.2021;12:662437.)(Chu C,Gao Y,Lan X,et al.Stem-Cell Therapy as aPotential Strategy for Radiation-Induced Brain Injury.Stem Cell Rev Rep.2020;16(4):639-649.)(Diaz MF,Horton PD,Dumbali SP,et al.Bone marrow stromal celltherapy improves survival after radiation injury but does not restoreendogenous hematopoiesis.Sci Rep.2020;10(1):22211.)。由于目前辐射剂量估算技术的局限性,无法准确判断患者是否需要造血干细胞移植(HSCT),常常最佳时机或过度医疗导致资源浪费。事故后迅速准确的重症损伤评估对于造血干细胞移植等治疗措施的应用具有重要的指导意义。
电离辐射引起外周血淋巴细胞数剂量依赖性下降,照射后12-48小时范围内的淋巴细胞计数分析用于辐射损伤伤员的分类。该方法速度快、操作简单,但是该方法不适用于照射后12小时以内(Thierens H,Vral A.The micronucleus assay in radiationaccidents.Ann Ist Super Sanita.2009;45(3):260-264.)(Benderitter M,Durand V,Caux C,et al.Clearance of radiation-induced apoptotic lymphocytes:ex vivostudies and an in vitro co-culture model.Radiat Res.2002;158(4):464-474.)(Pandey BN,Kumar A,Ali M,et al.Bystander effect of conditioned medium fromlow and high doses of gamma-irradiated human leukemic cells on normallymphocytes and cancer cells.J Environ Pathol Toxicol Oncol.2011;30(4):333-340.)。故而,探索基于分子层面的辐射生物剂量计是应对核事故后大批量伤员早期伤情分类的关键。虽然现有研究已报道的潜在分子标志物包括代谢物小分子,编码与非编码RNA,细胞因子,趋化因子和其他蛋白质等,但真正经过方法学、体内外效应研究和临床相关研究验证得到广泛认可的分子标志物只有外周血淋巴细胞γH2AXx Foci分析。γ-H2AX是DNA双链断裂标志分子,照射后数分钟即可出现明显的γ-H2AX foci,1h左右达到高峰,而后逐渐下降,检测窗口期很短,而且γ-H2AX foci分析操作较为复杂,检测通量不高,故而其应用受到很大限制(Reitsema TJ,Banath JP,MacPhail SH,et al.Hypertonic salineenhances expression of phosphorylated histone H2AX after irradiation.RadiatRes.2004;161(4):402-408.)(Andrievski A,Wilkins RC.The response of gamma-H2AXin human lymphocytes and lymphocytes subsets measured in whole bloodcultures.Int J Radiat Biol.2009;85(4):369-376.)(Wang Z,Hu H,Hu M,et al.Ratioof gamma-H2AX level in lymphocytes to that in granulocytes detected usingflow cytometry as a potential biodosimeter for radiation exposure.RadiatEnviron Biophys.2014;53(2):283-290.)。
炎症反应是辐射的典型病理生理反应,可加剧电离辐射的直接作用,从而导致组织损伤。作为一种外源性刺激,机体受到电离辐射后早期(数小时-1天),机体出现急性期反应,一些急性期蛋白出现快速增加,通常在照射后24h开始回落。同时,电离辐射可以引起造血、免疫、肠道等放射敏感组织细胞发生细胞凋亡、坏死等,尤其是遭受大剂量照射后,在体内诱发全身的炎症反应失调,即“细胞因子风暴”,表现为高水平的促炎细胞因子,如IL-1β、IL-6、IL-18和TNFα。炎症反应和血小板活性失调的累积全身效应可导致多器官衰竭和死亡,这是辐射重症患者致死的重要因素。而造血干细胞移植(HSCT)/间充质干细胞(或基质)细胞(MSCs)是治疗急性放射损伤重症患者的重要治疗手段,已被证明可以有效缓解放射诱导造血综合征,肠道综合征以及脑损伤与肺损伤。目前是否进行干细胞治疗主要依赖于受照剂量的评估、骨髓病理分析及综合的临床表现。能否从辐射诱导的急性期反应和DAMP过程发现早期损伤和重症损伤标志分子,并有效指导重症伤员的救治与愈后评估,非常值得探索。
结合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)又称触珠蛋白,是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白,广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他体液中。结合珠蛋白作为一种急性期蛋白,主要由肝脏合成和分泌,在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用(Baumann H,Gauldie J.The acute phase response.ImmunolToday.1994;15(2):74-80.)。早在20多年前,就有研究报道Hp在4Gy全身γ射线照射后的C57BL/6和CBA/Ca小鼠血骨髓中表达水平显著增加反映出持续的急性期反应。但Hp作为致死性照射损伤标志分子的研究未见报道,Hp蛋白用于急性放射损伤后骨髓移植技术选择的标志分子也未见报道。
发明内容
本发明针对如何预测或评估待测个体辐射致死性的问题,提供了Hp蛋白在构建电离辐射后致死性预测模型中的应用。
进一步地限定,所述预测模型的因变量为致死指标,所述致死指标为待测个体接受电离辐射后,体内Hp蛋白含量的二次增加。
进一步地限定,所述二次增加是指在待测个体接受电离辐射后,体内Hp蛋白含量首次增加后下降,然后再次迅速增加。
进一步地限定,所述电离辐射的强度为8Gy以上。
本发明还提供了Hp蛋白在制备评估或预测电离辐射后致死性的试剂盒或试剂中的应用。
进一步地限定,所述应用将待测个体经辐射后Hp蛋白含量的二次增加作为所述试剂盒的靶向检测指标。
进一步地限定,所述二次增加是指在待测个体接受电离辐射后,体内Hp蛋白含量首次增加后下降,然后再次迅速增加。
进一步地限定,所述电离辐射的强度为8Gy以上。
本发明还提供了Hp蛋白在制备评估电离辐射药物药效和/或预后的试剂盒或试剂中的应用。
进一步地限定,所述电离辐射的强度为8Gy以上。
本发明还提供了Hp蛋白在构建评估或检测重症辐射损伤骨髓移植时机的模型中的应用。
本发明还提供了Hp蛋白在制备评估或检测重症辐射损伤骨髓移植时机的试剂盒或试剂中的应用。
本发明的有益效果:
本发明首先通过全身和局部照射小鼠模型发现小鼠的血浆Hp水平在全身照射3小时后迅速升高,具有显著的剂量依赖性,在6-24小时达到峰值,然后回落,但照射后2天的血浆Hp水平仍显著高于正常小鼠。多元线性回归分析结果表明,血浆Hp可预测照射后3天内的照射剂量,尤其是在照射早期。随后的局部照射实验证实,受照小鼠血浆Hp主要来源于肝脏、心脏和胸腺组织,与辐射损伤程度密切相关。来自鼻咽癌患者的临床样本证实,Hp对人体也具有放射敏感性。因此,暴露后小鼠血浆Hp浓度的变化具有很强的敏感性和时间-剂量效应,可用于事故早期患者的分类。此外,Hp作为血浆蛋白,更易于在事故现场进行快速检测,检测窗口比γ-H2AX宽,在大型事故的医疗救援中更具价值。
本发明还发现致死剂量为10Gy的辐射导致小鼠淋巴细胞数量急剧下降。然而,临床上广泛使用的辐射防护剂氨磷汀对淋巴细胞计数的下降没有抑制作用。其他血液学指标(白细胞、红细胞、血小板)也不受氨磷汀的影响。血浆Hp浓度分析表明,剂量低于6Gy时,血浆Hp在剂量依赖性达到最高点后下降到正常水平,恢复时间随剂量的增加而延长。在暴露于8Gy和10Gy的小鼠中,Hp在辐射后3小时增加2倍,在暴露后1天达到峰值,第2天开始下降,随后在第3天或第5天再次上升,然后继续增加,直到死亡。我们还发现氨磷汀能有效地抑制10Gy剂量照射后小鼠血浆Hp浓度的二次升高。在氨磷汀预处理后死亡的唯一一只小鼠中,血浆Hp浓度的变化与未处理组一致,显示第二次升高,并持续升高直至死亡。这些结果表明,血浆Hp浓度第二次升高与小鼠死亡密切相关,可作为辐射致死性损伤的早期特异性指标。此外,血浆Hp浓度的动态变化与辐射效应密切相关,而不是由照射剂量决定的。血浆Hp浓度可直接反映电离辐射损伤程度。因此,与淋巴细胞计数的剂量依赖性下降相比,通过血浆Hp变化识别致命辐射损伤更为准确和直观。此外,血浆Hp更便于快速检测。作为电离辐射致死性损伤的早期生物标志物,具有绝对优势和广阔的应用前景。
由于血浆Hp浓度可以有效识别致命的辐射损伤,我们进一步探讨血浆Hp浓度是否可以作为移植治疗需要的指标。在致死照射后不同时间将骨髓细胞移植到小鼠体内。照射后30天内小鼠存活率、体重和血象分析表明,10Gy组小鼠均在照射后11天内死亡,10Gy-1d-T组小鼠存活率为100%。随着移植时间的延长,10Gy-3d-T-1和10Gy-5d-T-1两组中都有一些小鼠死亡,存活率分别为83%和67%。在增加移植细胞数量后,10Gy-3d-T-2、10Gy-5d-T-2和10Gy-5d-T-3组小鼠的存活率提高到100%。对小鼠体重和血象的检测表明,骨髓移植后小鼠体重和淋巴细胞的恢复与移植时间和移植细胞数量成正比。移植越早,移植细胞数量越多,恢复越明显。这些结果表明,即使在致死剂量照射(照射后5天)后血浆Hp显著二次增加,骨髓移植仍能有效保护小鼠免于死亡。体重、血象等基本生理指标恢复良好。这是现有的生物剂量计无法实现的,血清Hp在严重急性辐射损伤患者的临床治疗中起着重要作用。
此外,目前对严重急性放射损伤(SARI)患者HSCT治疗后造血恢复指标的检测也取决于绝对淋巴细胞数和骨髓细胞血液试验的恢复。我们的研究表明,尽管外源性骨髓细胞移植在短时间内刺激了小鼠血浆Hp的增加,但在后期,它可以促进小鼠ARS的恢复并抑制血浆Hp。致死剂量照射后1、3和5天,骨髓移植也能显著抑制血浆Hp浓度的升高。致死剂量照射后第1、3、5天移植不同数量的骨髓有核细胞,可保护小鼠免于死亡,并显著抑制血浆Hp的升高。照射后第1天移植小鼠的血浆Hp浓度没有出现第二次升高;照射后第3天移植的小鼠的血浆Hp浓度呈现轻微的秒级升高,照射后第11天降至正常。骨髓干细胞移植,尤其是照射后第5天,能保护小鼠免于死亡,抑制Hp的持续升高,照射后第14天Hp的持续升高显著降低。淋巴细胞绝对数作为骨髓移植造血恢复的主要指标,明显滞后于Hp的变化。照射后第1天移植的小鼠的淋巴细胞数量在照射后20天才恢复,而其他组的淋巴细胞数量在照射后25天才开始恢复。分析表明,移植前后血浆Hp的动态变化与淋巴细胞恢复的时间动态相似。这些结果表明,血浆Hp的变化与小鼠移植后状态密切相关,提示血浆Hp的恢复可作为小鼠移植后愈合的直接指标。虽然淋巴细胞数量恢复较早,但恢复缓慢,在临床试验中不显著。通常在照射后20天达到临床安全指标。因此,移植后血浆Hp的降低是骨髓移植成功与恢复的更敏感、更有效的指标。
附图说明:
图1为小鼠不同取血方式及放置不同时间Hp浓度对比结果图;其中,图1中的A为ELISA检测雌性C57BL/6J小鼠不同方式取血血清或血浆Hp浓度结果表;图1中的B为取血后放置不同时间小鼠血清或血浆Hp浓度结果图,n=3,数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,Student’s-t检验,P>0.05为两组之间比较无显著性差异,放置不同时间后血清和血浆Hp水平均无显著性差异;
图2为雌性C57BL/6J小鼠全身照射后的各指标分析结果图;其中图2中的A、B、C、D、E、F分别为存活率、体重、淋巴细胞数、白细胞数、血红蛋白和血小板数的统计结果图,生存率的P值由log-rank(Mantel-Cox)检验确定,其他数据经SPSS 21.0软件分析服从正态分布,以均数±标准差(Mean±SD)表示,Student’s-t检验用于分析10Gy组与对照组之间的差异,n=8,*P<0.05;****P<0.0001为差异具有统计学意义;
图3为小鼠全身照射血浆Hp时间及剂量响应范围结果图;其中图3中的A为雌性C57BL/6J小鼠不同辐射剂量照射下,不同时间后的Hp浓度检测结果;图3中的B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L分别为不同剂量照射,暴露后-3、0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、7、11和14天后Hp的剂量响应情况;
图4为小鼠全身照射后0.125、0.25、0.5、1、2和3天Hp浓度与照射剂量的相关性分析结果图;
图5为小鼠全身照射Hp脏器组织来源图;其中,图5中的A为正常小鼠各脏器HpmRNA表达量检测结果图;图5中的B为8Gy照射后1天各脏器Hp mRNA表达量检测结果图,数据经SPSS 21.0软件分析服从正态分布,以均数±标准差(Mean±SD)表示,Student’s-t检验用于分析照射组与对照组之间的差异,n=8,*P<0.05;**P<0.01为差异具有统计学意义;
图6为小鼠体内局部照射(PBI)Hp表达情况图;其中,图6中的A为局部照射小鼠屏蔽方式:PBI-1和PBI-3遮挡C57BL/6J小鼠的肝脏,在相应的PBI-2和PBI-4组中暴露肝脏,Hp,结合珠蛋白;PBI,部分身体照射;TBI,全身照射;图6中的B为局部照射小鼠的存活率、体重、淋巴细胞数统计结果,生存率的P值由log-rank(Mantel-Cox)检验确定,数据为每组n=8只小鼠的平均值±SD,Student’s-t检验用于分析全身照射组与对照组之间的差异;图6中的C为局部照射小鼠的白细胞数、血红蛋白和血小板数统计结果,数据分析同淋巴细胞;图6中的D为ELISA检测TBI组和PBI组在10Gy照射后0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、7、11和14天的Hp检测结果,数据为每组n=8只小鼠的平均值±标准差,Student’s-t检验用于分析照射组与对照组之间的差异,*P<0.05;**P<0.01为差异具有统计学意义;
图7为血浆Hp水平区分致死与非致死性辐射的分析结果图;其中图7中的A为小鼠的存活率、体重、淋巴细胞数、白细胞数、血红蛋白和血小板数统计结果,生存率的P值由log-rank(Mantel-Cox)检验确定,数据为每组n=8只小鼠的平均值±SD,Student’s-t检验用于分析实验组与对照组之间的差异,*P<0.05;**P<0.01,***P<0.001;****P<0.0001为差异具有统计学意义,A,氨磷汀;Hp,结合珠蛋白;图7中的B为在照射后-3、1、2、3、5、7、11和14天,在0Gy、0Gy+A、10Gy、10Gy+A照射的雌性C57BL/6J小鼠中使用ELISA测定Hp结果图,数据表示每个组平均值±SD,每组n=8(10Gy后11天n=1),**,P<0.01;图7中的C为ROC曲线图;
图8为重度辐射损伤小鼠骨髓移植后血浆Hp浓度的变化结果图;其中,图8中的A为致死性照射小鼠全骨髓移植的示意图;图8中的B为小鼠的存活率、体重统计结果图,生存率的p值由log-rank(Mantel-Cox)检验确定,除10Gy-3d-T-2(n=5)外,数据为每组n=6只小鼠的平均值±SD,经Student’s-t检验具有统计学意义,*,P<0.05;**,P<0.01;图8中的C为小鼠淋巴细胞数、白细胞数、血红蛋白和血小板数统计结果图,数据分析方法同体重,*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001,图8中的D为用ELISA法测定了0Gy、0Gy+T、10Gy、10Gy-1d-T、10Gy-3d-T-1、10Gy-3d-T-2、10Gy-5d-T-1、10Gy-5d-T-2、10Gy-5d-T-3照射雌性C57BL/6J小鼠不同时间的Hp结果图,除10Gy-3d-T-2(n=5)外,数据为每组n=6只小鼠的平均值±SD,经Student’s-t检验具有统计学意义,*,P<0.05;**,P<0.01;图8中的E为10Gy、10Gy-1d-T、10Gy-3d-T-2、10Gy-5d-T-3照射雌性C57BL/6J小鼠不同时间淋巴细胞和Hp的比较结果图;T,移植;A,氨磷汀;Hp,结合珠蛋白;
图9为鼻咽癌放疗后血清Hp的变化趋势图;其中图9中的A为20例鼻咽癌患者放疗前后Hp浓度的散点图(Student’s-t检验用于分析放疗后与放疗前之间的差异,**,P<0.01为差异具有统计学意义);图9中的B为ROC曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明。本发明所使用的药品、试剂、仪器、设备等如无特殊说明,均可通过商业化途径购买获得,涉及的PCR扩增等分子生物学实验操作如无特殊说明,均为本领域常规实验操作或依照相应试剂的产品说明书进行。
下述实施例中所用的实验动物为:SPF级雌性C57BL/6J小鼠(8周龄),购买自北京斯贝福生物技术有限公司,在军事科学院军事医学研究院(北京)饲养。小鼠在特定的无病原体,控制温度、湿度(温度保持18-23℃;湿度为40%-60%),12/12小时的光/暗循环下被置于统一的笼子中,实验前饲养至少一周,体重19-21g。动物的护理和处理按照《中国AMMS实验动物护理和使用指南》进行,所有动物实验均经北京放射医学研究所(北京)动物护理和使用委员会批准,编号为IACUC-DWZX-2020-551。
本发明所述的急性反应期蛋白Hp,鼠源Hp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;人源Hp的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;氨基酸序列如SEQID No.4所示。
以下实施例涉及的主要试剂见表1。
表1实施例中涉及的主要试剂
实施例1:动物模型照射实验
1、全身照射、局部照射和样品采集
全身照射:对于全身照射Hp时间和剂量响应范围的研究,小鼠被限制在透明的有机玻璃盒中,在军事科学院军事医学研究院放射医学研究所钴源室,以68.6cGy/min的剂量率使用60Coγ射线,单次照射剂量分别为0.2、0.5、1、2、4、6、8和10Gy。照射后-3、0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、7、11和14天采集尾静脉血样,用ELISA法检测Hp的动态变化。照射后-3、0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、7、11、14、20、25和30天采集尾静脉血样,观察血象变化,同时检测体重及观察存活率。
局部照射:腹腔注射0.4mg/kg水合氯醛麻醉小鼠,麻醉后使用医用胶布粘住四肢及腹部于有机玻璃板上,铅砖置于屏蔽部位前,使用60Coγ射线以68.55cGy/min的剂量率将其部分身体暴露于单剂量10Gy照射。于照射后-3、1、2、3、5、7、11和14天采集尾静脉血样,用ELISA法检测Hp的动态变化。照射后-3、1、2、3、5、7、11、14、20、25和30天采集尾静脉血样,观察血象变化,同时检测体重及观察存活率。
上述实验涉及的具体方法如下:
(1)小鼠尾静脉连续取血及血浆分离:
尾静脉连续取血,固定器固定小鼠,在小鼠尾巴末梢静脉处用刀片横切口(每次取血完成后无菌干棉球按压止血),用20μL移液器吸5μl加入含1000μL PBS的EP管中,轻轻混匀,4℃5000rpm离心5min,轻轻吸上清转移至5个新EP管中,-80℃冰箱保存,以备酶联免疫吸附实验检测Hp浓度。
(2)外周血血象检测:
固定器固定小鼠,在小鼠尾巴末梢静脉处用刀片横切口,用20μL移液器从尾静脉采集20μL血液,加入480μL稀释液中,在照射后不同时间,检测血象。
(3)小鼠脏器解剖:
小鼠颈椎脱臼处死,浸泡于75%酒精中消毒,摘取肝脏、肺脏、心脏、胸腺、骨髓、脾脏、肩胛下皮下脂肪、肾脏、肾上腺、脑、卵巢、大肠、小肠,置于1.5mL离心管中,-80℃保存备用。
(4)酶联免疫吸附试验(ELISA):
Hp酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒操作方法按说明书进行。
(5)小鼠脏器总RNA提取:
取1颗酒精浸泡后的无菌不锈钢珠,用去离子水冲洗3遍,晾干加入2mL EP管中,从-80℃冰箱将小鼠脏器组织放到EP管中,加入1mL Trizol,进行组织研磨(50次/s,研磨5min),然后离心(3500rpm离心5min)去除组织碎片沉淀,将800μL悬液转移到新的EP管中,然后提取RNA。用紫外分光光度计法(A260/A280)对RNA样本进行浓度和纯度的检测。从RNA样品中各吸取1μL原液,分别测定其在260nm和280nm波长处的吸光度,A260/A280均在1.8-2.0之间,说明提取的RNA样品的纯度比较好,可以进行下一步实验。余下样品直接用于实验或置于-80℃保存备用。
2、氨磷汀预处理小鼠
小鼠10Gy照射前0.5h腹腔注射150mg/kg氨磷汀,然后用60Coγ射线单剂量照射10Gy,剂量率为69.45cGy/min。从尾静脉采集血样,用ELISA检测Hp在照射后-3、1、2、3、5、7、11和14天,以及-3、1、2、3、5、7、11、14、20、25和30天用血细胞计数仪检测血象,同时观察其体重及存活率。
3、小鼠尾静脉骨髓移植
在无菌操作台,用含有10%胎牛血清的D-Hank’s缓冲液从供体小鼠股骨中冲洗出全骨髓细胞,并用40μL细胞过滤器过滤。小鼠应用60Coγ射线以66.87cGy/min的剂量率照射10Gy后,第1天(10Gy-1d-T,8×10
结果如下:
(1)小鼠不同取血方式及放置不同时间Hp浓度对比
为了初步明确不同方式取血小鼠血清或血浆Hp浓度有无差异,我们采用了3种取血方式:(1)眼球取血:1.5mL 4℃放置1h离心取上清;(2)尾静脉取血:60μL 4℃放置1h离心取上清;(3)尾静脉+PBS:尾静脉取血5μL加入1mL PBS离心取上清,分别检测了雌性C57BL/6J小鼠血清或血浆Hp浓度,每组3只小鼠。结果如图1中的A所示,眼球取血、尾静脉取血及尾静脉+PBS,Hp的表达量无显著差异(P>0.05)。接下来,我们检测了小鼠血清或血浆在放置不同时间后Hp浓度有无差异,ELISA检测取血后-80℃放置1、2、3、4、5、6、7天小鼠血清或血浆Hp浓度,每组3只小鼠。结果如图1中的B所示,眼球取血和尾静脉+PBS,Hp的表达量无显著差异(P>0.05)。血清和血浆放置1~7天Hp表达水平无明显变化,提示后续实验可以采用取微量血加入PBS中,并且放置-80℃,1~7天不影响血清和血浆Hp的表达水平(P>0.05)。
(2)小鼠全身照射血浆Hp时间与剂量响应范围
为了探索不同辐射损伤程度小鼠不同时间点血浆Hp浓度的响应范围,我们通过ELISA方法检测了0、0.2、0.5、1、2、4、6、8和10Gy全身照射后-3、0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、7、11和14天的雌性C57BL/6J小鼠血浆Hp的浓度。同时,为了评估小鼠全身照射效果,我们同时观察小鼠-3、0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、7、11、14、20、25和30天体重、血象和存活率,作为雌性C57BL/6J小鼠全身照射模型。
小鼠全身照射模型:
图2中的A展示了0、0.2、0.5、1、2、4、6、8和10Gy全身照射30天内雌性C57BL/6J小鼠的存活情况,0、0.2、0.5、1、2、4、6Gy组小鼠全部存活;8Gy组从照后第11天开始死亡,照后第12天半数致死,至第16天全部死亡;10Gy组从照后第8天开始死亡,第9天半数致死,第11天全部死亡。图2中的B展示了各剂量组小鼠的体重动态变化情况,0、0.2、0.5、1、2、4、6Gy组体重呈缓慢上升趋势;8Gy组体重从照后3h开始下降,并且持续下降,至16天全部死亡达到最低;10Gy组从照后3h开始下降,持续下降,至第11天全部死亡达最低;且在每个时间点,小鼠体重都与照射剂量呈反比,即照射剂量越大体重越小。图2中的C展示了外周血淋巴细胞变化情况,8Gy和10Gy组外周血淋巴细胞从3h开始下降,并持续下降,直至死亡;其他照射组在下降到最低后逐渐恢复,照射剂量越大淋巴细胞越低,恢复的时间越晚。白细胞计数的变化规律同淋巴细胞数(图2中的D);血红蛋白和血小板下降较晚,在低剂量照射后存活组在下降到最低后逐渐恢复,高剂量照射后死亡组持续下降,直至死亡(图2中的E和F)。综上所述,小鼠全身照射模型构建成功。
小鼠全身照射Hp浓度的时间与剂量响应范围:
图3中的A整体展示了雌性C57BL/6J小鼠0、0.2、0.5、1、2、4、6、8和10Gy全身照射后-3、0.125、0.25、0.5、1、2、3、5、7、11和14天的血浆Hp浓度变化,图3中的B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L分别展示了小鼠照射后不同时间血浆Hp浓度剂量响应,表2展示了Student’s-t检验比较照射组与对照组小鼠血清Hp浓度的P值及变化倍数。血浆Hp水平检测结果表明,在电离辐射的早期,Hp的浓度在各剂量均有响应,并且以剂量依赖的方式增加,剂量越大,Hp升高的越早,恢复的越晚(图3中的A和表2)。0.2Gy和0.5Gy组在照后2天和3天升高,但没有统计学差异。在1Gy和2Gy照射组中,Hp在12小时增加,在第2天达到峰值,在第3天恢复正常。4Gy组在6h开始升高,第1天达到高峰,第2天下降,第5天恢复正常。Hp浓度在亚致死剂量6Gy辐射后6h升高,第1天达到峰值,第2天下降,第11天恢复正常。致死剂量(8Gy和10Gy)照射后3h,Hp浓度即增加2倍,且与正常对照组相比有统计学差异,1天达到较高水平后,2天轻度下降,3天或5天二次回升,并持续增加直至死亡,而非致死照射组在达到峰值后或早或晚逐渐恢复正常,提示Hp水平可能与小鼠的死亡相关。
数据经SPSS 21.0软件分析服从正态分布,以均数±标准差(Mean±SD)表示,Student’s-t检验用于分析照射组与对照组之间的差异,n=8,P值及变化倍数见表2。
表2 Student’s t-test检验比较照射组与对照组Hp浓度的P值及变化倍数
(3)小鼠血浆Hp作为剂量估算生物标志物的可行性分析
如前所述,我们的研究确定了血浆Hp在照射后呈剂量依赖性增加,表明其作为辐射生物标志物的潜在用途。为了探讨血浆Hp水平是否可以作为小鼠辐射剂量的预测指标,我们采用线性回归分析了照射后0.125、0.25、0.5、1、2和3天Hp浓度与辐射剂量之间的相关性。除第2天外,相关系数均在0.9以上,6h和12h的相关系数最高,为0.99。表明Hp可作为预测电离辐射暴露的潜在指标(见图4)。
(4)小鼠全身照射Hp脏器组织来源(加血清ELISA结果)
为了探索放射后小鼠血浆Hp升高的脏器组织来源,我们通过qPCR检测了雌性C57BL/6J小鼠在8Gy照射后1天肝脏、肺脏、心脏、胸腺、骨髓、脾脏、肩胛下皮下脂肪、肾脏、肾上腺、脑、卵巢、大肠、小肠的Hp mRNA表达。如图5中的A所示,正常小鼠肝脏中Hp mRNA表达最高,其次是肺、脂肪、卵巢、骨髓、心脏、肾上腺和胸腺。如图5中的B所示,8Gy照射后1天肝脏、胸腺和心脏Hp mRNA分别升高3.62、34.85、3.05倍,卵巢下降0.52倍,且均与正常对照组相比有统计学差异。
(5)小鼠体内局部照射(PBI)Hp表达情况
为了探索小鼠在局部照射后血浆Hp有无响应,我们对小鼠进行了局部照射。如前所示,肝脏是正常小鼠和8Gy TBI后Hp的主要来源(见图5),屏蔽肝脏后Hp有没有响应,采用四种PBI模式:头部和胸部暴露(PBI-1)、头部和胸部隐藏(PBI-4)、下腹部和后腿隐藏(PBI-2)、下腹部和后腿暴露(PBI-3)(见图6中的A)。同时建立了局部照射小鼠模型,观察了30天内的存活率,体重与外周血血象(见图6中的B)。TBI组小鼠11天开始出现死亡,16天全部死亡,其他组没有死亡。TBI组小鼠体重持续下降,直至死亡,PBI组体重在短暂下降后,呈缓慢上升趋势。照射组小鼠外周血淋巴细胞1d开始明显下降,跟照射面积负相关;白细胞数跟淋巴细胞相似;TBI组小鼠外周血血小板数和血红蛋白下降时间较晚,在照射后5天开始明显下降,且持续下降,而PBI组在短暂下降后逐渐恢复(见图6中的C)。另外,我们通过ELISA对辐射后不同时间点(-3、1、2、3、5、7、11和14天)暴露于0Gy(对照组)和10Gy PBI的C57BL/6J小鼠的血浆Hp浓度进行定量。TBI组小鼠Hp变化规律同图3中的A 10Gy组,在1天明显升高后,第二天稍微下降,随后二次升高,并持续升高,直至死亡。而局部照射后,尽管肝脏作为产生Hp的主要组织被屏蔽,无论遮挡肝脏还是暴露肝脏,小鼠血浆Hp均升高,并且与照射面积呈正相关(见图6中的D),变化规律同相应组别外周血淋巴细胞。充分说明HP的变化可以反应全身的损伤状态,可以作为小鼠电离辐射损伤的生物标志物。
(6)Hp作为放射损伤致死性生物标志物的实验研究
前面图3中的B结果显示,致死剂量照射后3天小鼠血浆中Hp浓度出现再次升高。为进一步探索血浆Hp水平的变化与急性照射致死损伤之间的关系,我们在10Gy TBI照射前半小时对小鼠腹腔注射了一种临床常用的辐射防护剂氨磷汀,分析氨磷汀在提高致死照射小鼠存活率的同时,是否可以解除血浆中Hp的二次升高。结果如图7中的A,30天存活率分析发现,所有暴露于10Gy致死剂量照射的小鼠在12天内死亡,而照射前采用氨磷汀预处理组小鼠只有一只死亡。照射后小鼠体重和血象分析发现,氨磷汀预处理可以减轻照射小鼠体重下降,促进体重恢复,但是不改变淋巴细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等辐射敏感指标的下降(图7中的A)。小鼠血浆Hp水平动态变化和相应存活时间详见图7中的B和表3。10Gy组血浆Hp在照后第1天升至较高水平(1172.18μg/ml),第2天降低(546.72μg/ml),随后再次持续升高直至死亡,而10Gy照射前采用氨磷汀预处理的小鼠血浆Hp水平在照射后第1天达到最高水平后开始下降,其中7只照后30天内存活小鼠没有出现Hp的二次增加,持续下降至正常水平,而1只小鼠在照射后12天死亡,而这只小鼠的Hp水平与单纯10Gy照射组小鼠Hp水平变化规律一致,出现明显的二次增加。这些结果进一步表明,照射后3-5天小鼠血浆Hp的二次增加可作为预判小鼠是否存活的有用指标。ROC曲线结果显示小鼠血浆Hp可以用于区分非致死性和致死性辐射(图7中的C,曲线下面积(AUC)为0.80,P=0.0491)。
表3 10Gy和10Gy+A组小鼠血浆Hp水平的动态变化及对应的死亡时间
(7)Hp作为重症辐射损伤骨髓移植时机选择和治疗效果评估的分子指标
骨髓移植是治疗急性放射损伤重症患者最重要临床手段。一般来讲,辐射损伤后越早进行移植,疗效越显著。然而,受限于目前辐射剂量估算技术,无法准确判断患者是否需要移植,且骨髓移植需要合适的供体配型,需面临移植后排异等不良反应,所以筛选必要的患者进行移植至关重要。基于血浆Hp浓度可以有效识别致死性放射损伤,我们希望进一步探索血浆Hp浓度是否可以作为患者进行移植治疗必要性的指标。在照射后第1、3、5天分别对10Gy照射小鼠尾静脉回输不同数量的全骨髓细胞(图8中的A)。而后,对照射后30天内各组小鼠存活率、体重和外周血象进行分析,结果如图8中的B和图8中的C所示,10Gy照射组小鼠在照射后12d内全部死亡,10Gy-1d-T、10Gy-3d-T-1、10Gy-3d-T-2、10Gy-5d-T-1、10Gy-5d-T-2和10Gy-5d-T-3组骨髓移植均有效提高了小鼠存活率,促进体重和血象等指标恢复。其中10Gy-1d-T存活率100%,10Gy-3d-T-1和10Gy-5d-T-1组均有少数小鼠死亡,存活率分别为(83%和67%)。当增加移植细胞数量后10Gy-3d-T-2、10Gy-5d-T-2和10Gy-5d-T-3组小鼠存活率均提高至100%。这些结果表明,根据照射小鼠血浆Hp的变化选择骨髓移植时机,可以有效救治致死剂量照射小鼠(图8中的D)。
骨髓移植可以有效加快照射后小鼠体重和血象恢复。同时,淋巴细胞等指标的回升也是骨髓移植成功,照射损伤开始恢复的重要指标。接下来,我们分析血浆中Hp水平是否可以用于评估照射小鼠骨髓移植治疗效果。结果显示,在照射后给予骨髓移植可以有效促进10Gy照射后Hp水平恢复,移植时间越早、移植细胞数量越多,Hp恢复到正常水平的的速度越快,与外周血淋巴细胞恢复的时间动态相似(图8中的E),提示Hp可以作为骨髓移植治疗效果的辅助指标。
表4与前一时间点比较后,与Hp浓度的双尾Student’s-t检验相关的P值
实施例2:鼻咽癌患者的照射实验
如前所示,在小鼠模型中,在TBI和PBI后的分类相关剂量范围内,血浆Hp是一种灵敏而稳健的辐射指标。接下来我们探索了Hp在人体中的响应,对18名NPC患者血清进行了测试。
鼻咽癌患者的放射治疗及血清获取:
18例鼻咽癌患者放疗前后采集血清。所有患者均在南方医科大学签署书面知情同意书。所有标本均取自广东省教育厅高水平大学建设基金资助的南方医科大学临床研究启动项目(LC2016PY015),具体信息见网址https://www.clinicaltrials.gov/。伦理委员会的机构审查委员会(编号NFEC-2018-013)批准了患者资格、样本采集、操作和储存程序的所有要求。鼻咽癌患者受6MV-X射线束照射鼻咽部及其淋巴引流区,如鼻后窝、鼻旁窦、咽旁间隙、颅底和颈部。放疗剂量为鼻咽部70Gy,颈部63Gy。患者的血样于放疗前3-7天及放疗后1-4天收集,3000rpm,4℃离心10min分离血清,并在-80℃下保存以备应用。
数据统计分析:
采用单因素方差分析(ANOVA)Bonferroni多重比较检验确定多组间的显著性;两组采用Student’s-t检验/双尾检验;采用多元线性回归分析确定Hp水平作为TBI和PBI辐射剂量的预测因子;受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC)用于分析生物标志物能否区分两组不同样本;生存曲线采用对数秩检验分析。结果均以平均值±标准差(SD)表示。显著性差异为P值<0.05,P值<0.01。
实验结果:
(1)鼻咽癌患者放疗前后血清Hp表达情况
对18名NPC患者血清进行了测试,检测结果见表5。在放疗后表现出较高的血清Hp浓度(如图9中的A),放疗后的血清Hp中位浓度(4108μg/mL)显著高于治疗前(2015μg/mL)。我们采用接受者操作特性曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析18名NPC患者血清中Hp是否可作为放疗患者的潜在诊断生物标志物。结果如图9中的B所示,ROC曲线下面积(AUC)为0.80,P=0.0033(如图9中的B),Hp可以用于区别放疗前和放疗后患者血清。因此,鼻咽癌患者血清中Hp可以作为放疗患者的潜在诊断生物标志物。
表5 18例鼻咽癌患者的临床参数和相应的血清Hp浓度
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> Hp蛋白在构建辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4045
<212> DNA
<213> 鼠源
<400> 1
tgcaaacaca gaaatggagg aggaggggaa ggaggaggag gaggagaagg aggaggaggt 60
ggtggtggtg gtggtgggat aaaacccctg aggcataaag ggctcggccg gagtcagcac 120
agcccagccc ttccagagag aggcaagaga ggtccacgat gaggtgagtc cacagcccac 180
gcttcccact ttgagtacac cgagtataag tctacgggga gaggtgagaa gctgggatgc 240
aggaaccagg ctgatgagct aaccttctgt gggagttaag cctgcagcct gcaggccaca 300
cacagctgag gacaactgtg aacgcagtgc aacacagaac tgctgtatac ttacctaaag 360
cattaggaga tttttttttt ttttttggtc ttgtaacttg actatgcact ttgagtgtga 420
atcttgtcat gctaaaattt tagtgacacc atcaaggtga ccactttttt tttttttaat 480
caaaatagaa agactttgaa ggtagcgaaa agactagaag cacagtgttc agaagaactt 540
cctgactggt cagcatgtgc aggcaactgg gtagcattta agtgtggtct gtgtaccaat 600
gatggccaca gtcataggtt aggaagacag acagttttct ggcattcttg ggcttgatat 660
gcaatccttt aaaggcaaat acctatgaag taataggaac aaccacatat gatacggtat 720
gtatgtatgt atgtatgtat gtatgtatgt agcatgtatg tatgcatgca tgtatgtagc 780
atgtatgtat gtagcatgta tgtatgtatg tatgtagcat gtatgtatgt gtgtatgatg 840
tgtgtatgta tgtagcatgt atgtatgtat gtatgtatga tggtgcacac ccagggattc 900
caaaagctga ggcagggtga gtctgggagt tcaggagttt gcgaaaagcc taggcaaaga 960
atgggactgt gacttaagaa caacaacagc gactatgaca aattaaacat caaaaccacc 1020
tttttattat gggaaatttc caaaagtgag aatagcaaaa taaactatag ccgtcatctt 1080
taagttagtt acagtgtcct aacaatgtct tcatagcccg gtacttaatg gatgggagca 1140
gaggcctccc ctcgcaggac ctcgggggtc accactgtgc cctgggcctc ctctccactc 1200
cactcttttc ccacctccca cttctcagct tttttttgag ataggcacag cacaggctgt 1260
ggtcaaagcc ccgatcctcc tgcctctgtg ccagagtgtg gagagctggg atggcacata 1320
tactgccaca ctggcggtgc tttccttcct ctgtcacagt ggtccctttc taagcttcta 1380
caaaattccc ttcttgtgca tctggagttt gctgaagcat gggtggggtg ggtagcaagc 1440
agttctttgg tcttagcatc ttgttctctt cctttagtat ctgcttaatg gaaagtgtgt 1500
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttt tgtgtacatg catgcatgta tgtaaggaga 1560
tcacatgtac aaggagacca accccactcc ctcttgccat ttctctacag agccctggga 1620
gctgttgtca ctctcctgct ctggggtcag ctttttgctg tggagttggg caatgatgcc 1680
atggactttg aaggtgagtc tctggggttc cccaggagct acacacccca gctcagctga 1740
gccccagtct ggccacatca gtcccacact gtattaagga agacccagat cctcttctcg 1800
cctagatctt tgaggcctcc ctttctcagc ttccattcgg gtgcgaggga gtctggtgct 1860
cagggcagct ccgtctgctg acgtttcaca gagagccatc ggagcaccca cagccttttt 1920
ctggcttctt tttctcggca gatgacagct gcccaaagcc cccagagatt gcaaacggct 1980
atgtggagca cttggttcgc tatcgctgcc gacagttcta cagactacgg gccgaaggag 2040
atggtaaggc tgggatgagc acccctgcat ctacacccct ggccctgttt gatgggtggg 2100
gctggggtac ctggccagaa acttctcgag tactgcctcg aaccagggga ataagattcg 2160
aatcaagttc ttgtcttctg gtggtggtct ttccaccaaa cttaacttgt ctcagcttcc 2220
tgttttgtct tgttaagggg ctacaatccc ctggcccctg ttgcttggga gtgtagtctt 2280
tatcaacgat gtcctgcagc ctacacgcat gacagtttct aacttcttcc tgcccaattc 2340
tttaatccct aggccagatt cattttctct gatctcatct ccttttgctt caggggtgta 2400
caccttaaac gacgagaagc aatgggtgaa cacagtcgct ggagagaaac tccccgaatg 2460
tgaggcaggt gggtgttgag ctctcagagc atggggttaa aatgtggccg tgttcccctt 2520
gtgtggcctg ggtcagagag aaccagagct ggcaaaggag gagggacagg atccctcccg 2580
gacagctcaa tgccatgccc atttaggcta aggggggttg gctgagtcag ctgcttccca 2640
cggagatgcc ctccatccag aacacctgct cacagagcct tggttgaagg gaaagagggc 2700
accacaccct aggaaggacc aggccaggga ggaaacaaca gaagctgaac ccacaagggc 2760
taaggcaggg tctgggaaca actgggactc ccgcattctg tagctctcct ctcttcagcc 2820
caacttcagc tatcagtttg ggttatctgt tttcacatct gtaaaatctg tgtttctgcc 2880
ggtgccgctg cagggtgcat gtatgtatgt atgtatatta gcttatcagc caggagtttt 2940
aaaagcttag tcacttagtg tataaatgcc agaaatgtga ggacgagcag gtggtaaggg 3000
ctgagtgttc acagactgtc gggtgtggaa gcagcggtgg ctgatgcttc caggggctct 3060
gtaggtgggg cctgctctgg actgctgctc atacccctcc ctcccccctc cctccctccg 3120
cagtgtgtgg gaagcccaag caccctgtgg accaggtgca gcgcatcatc ggtggctcta 3180
tggatgccaa aggcagcttt ccttggcagg ccaagatgat ctcccgccac ggactcacca 3240
ccggggccac gttgatcagt gaccagtggc tgctgaccac ggccaaaaac ctcttcctga 3300
accacagcga gacggcgtca gccaaggaca tcacccccac cctaacgctc tacgtgggga 3360
aaaaccagct ggtggagatt gagaaggtcg ttctccaccc caaccactcc gtggtggata 3420
tcgggctaat caaactcaag cagagggtgc ttgtaaccga gagagtcatg cctatctgcc 3480
tgccttccaa agactacata gcaccaggcc gtgtgggcta cgtgtctggc tgggggcgga 3540
acgccaactt tagatttacc gatcgtctca agtatgtcat gctgcctgtg gccgaccagg 3600
acaagtgtgt ggtgcactat gagaatagta cagtgcccga gaagaaaaac ttgacgagtc 3660
ccgttggggt ccagcctatc ttgaacgagc acaccttctg tgctggcctc accaagtacc 3720
aggaagacac ctgctacggt gacgccggca gtgcctttgc cattcatgac atggaggagg 3780
acacctggta cgcagctggg atcctgagct ttgacaagag ctgcgctgtc gctgagtatg 3840
gtgtgtacgt gagggcgacc gacctgaagg actgggttca ggaaaccatg gccaagaact 3900
agttcagggc tcactagaag gctgcacatg gcagggcagg ctgggagcca tggaagaggg 3960
ggaagtggaa gggttgggct atactctgat gggttctagc cctgcactgc tcagtcaaca 4020
ataaaaaaat gtgctttgga cccat 4045
<210> 2
<211> 347
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 2
Met Arg Ala Leu Gly Ala Val Val Thr Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu
1 5 10 15
Phe Ala Val Glu Leu Gly Asn Asp Ala Met Asp Phe Glu Asp Asp Ser
20 25 30
Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala Asn Gly Tyr Val Glu His Leu Val
35 40 45
Arg Tyr Arg Cys Arg Gln Phe Tyr Arg Leu Arg Ala Glu Gly Asp Gly
50 55 60
Val Tyr Thr Leu Asn Asp Glu Lys Gln Trp Val Asn Thr Val Ala Gly
65 70 75 80
Glu Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys His Pro
85 90 95
Val Asp Gln Val Gln Arg Ile Ile Gly Gly Ser Met Asp Ala Lys Gly
100 105 110
Ser Phe Pro Trp Gln Ala Lys Met Ile Ser Arg His Gly Leu Thr Thr
115 120 125
Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asp Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn
130 135 140
Leu Phe Leu Asn His Ser Glu Thr Ala Ser Ala Lys Asp Ile Thr Pro
145 150 155 160
Thr Leu Thr Leu Tyr Val Gly Lys Asn Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys
165 170 175
Val Val Leu His Pro Asn His Ser Val Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys
180 185 190
Leu Lys Gln Arg Val Leu Val Thr Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu
195 200 205
Pro Ser Lys Asp Tyr Ile Ala Pro Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly
210 215 220
Trp Gly Arg Asn Ala Asn Phe Arg Phe Thr Asp Arg Leu Lys Tyr Val
225 230 235 240
Met Leu Pro Val Ala Asp Gln Asp Lys Cys Val Val His Tyr Glu Asn
245 250 255
Ser Thr Val Pro Glu Lys Lys Asn Leu Thr Ser Pro Val Gly Val Gln
260 265 270
Pro Ile Leu Asn Glu His Thr Phe Cys Ala Gly Leu Thr Lys Tyr Gln
275 280 285
Glu Asp Thr Cys Tyr Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Ile His Asp
290 295 300
Met Glu Glu Asp Thr Trp Tyr Ala Ala Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys
305 310 315 320
Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Arg Ala Thr Asp Leu
325 330 335
Lys Asp Trp Val Gln Glu Thr Met Ala Lys Asn
340 345
<210> 3
<211> 6551
<212> DNA
<213> 人源
<400> 3
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gagaaggggg agaagtgagc tagtggcagc ataaaaagac cagcagatgc cccacagcac 120
tgctcttcca gaggcaagac caaccaagat gaggtgggtc cacagctttc cctcctgcct 180
ttcctctggt tctttatttc agtctttttt gcatacatcg gtagagatgc agaaatagaa 240
caaagaaacg ggcaaatggg ctaaattata gtgaaccaaa gggcttagtg tgttaaatct 300
tctccttttc tgcatccata gaagacagtg ctgctgtctt tcccaggaga taagatttac 360
tctcaggagt gtctttttcc ttcaggttac atttttgact ttatagggta tgtcatcagc 420
tcccgtggta ggcttcctgg catcctgagt atatttatta gcagatattt tcctctttaa 480
aaatgtacaa taaggaagac taatagtaac acatttgaat gacacaatta attgactagt 540
acctgggata cacactaata cctgggatac atctaattaa ggcacttaga tcttataaaa 600
ataaacactt tttgaaatgt tgaaataata agactagaaa cttttttttt ttttgagatg 660
gagtctcgct ttgtcaccag gctgcagtgc agtggcatga tctcggctca ctgcaacctc 720
cacctcccag gttcaagtga ttctcctgcc tcagcctccc aggtagctgg gactacaggc 780
gtgcgccact atgcccacct aatttttgta tttttagtag agacgggctt tcaccatgtt 840
ggccaggatg acctcgatct cttgacctcg tgatctgcct gccttggcct cccaaagtgc 900
tgggattaca ggcatgagcc accgtgtctg gcctagaaac tattttaata gaagcaagta 960
gtgcccgaat ggttggcatt tgttagtgag atggtgaact ggcagacggc acctgtgggt 1020
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tacaaccccc ttctctgaca tttccatgat gggtggtgct gaggtgattc gccagaaagt 2220
tcgttgctct ccttggagcc aggagattta gattctaata agcgttttgt cgccagtagc 2280
catggccctt tgggcagact aacttttgtc agcctcaagt tttctgtttt gttaagggga 2340
ggcgatgcca tgcagcctac ctcatgtaaa tctcagagtc acatttacat ctccagcaga 2400
tgtgggaaaa gaaggaatgc tgatgatgat gtcaccctca cctagtgagt cttgctgtcc 2460
tggcactgct ctaagggctt tatacttatt tgctcactta gtcctcacag tatccctctg 2520
aacagagttt attgttttca ctttgctgat aaggaaactg aggcacagac aggttgagta 2580
tcttgcccaa attcaggcag cctgtaagag gcagagtcag gatttgaacc ctgagccctc 2640
cctgtactgc ttggctgtga ccgccatgac cacagtgtgt tctgctgggc ttaactggtg 2700
tccaggcact tggcttccag cacagcactc tttcccttcc tccttctcat attctctctc 2760
ctttctccct tcctgtctgc ctcctttctt cttcttcttt ttaattcttc tccttaaatg 2820
ccttctcact ctgctctggg tgcagacttg acttttcctt tggctcattt cttgcctttt 2880
gtttcaggag tatacacctt aaatgataag aagcagtgga taaataaggc tgttggagat 2940
aaacttcctg aatgtgaagc aggtgggtgc tgagcactga gcacttaaga gagcaggcag 3000
gcgtccagcg gggaacgtcc tagaggcaca gccttccagt gcggcttcct ctgagcacac 3060
aagagccagg aggagggatg tgggagaacc gcagctggcc agggagagac ttaagcagtt 3120
aggtgatgac tccctaaggg tcaccaaggg tcttgttcat tggggcctga agggcactgg 3180
ctgaatccac tgtcggcact gcccacagat caggagagcc tgtgcataca gagagcctgc 3240
tagaaagccc tgggtctaag gagaagcaag ctccagggag aacaagtcaa ggaatgacat 3300
aaaatcttaa tccatggaag cctagcagga ggctggacat gggctggaac tcctgcttct 3360
cgttattagg aggagctgtt gctctctcct ttcattctca gaaccagagg caaagaccca 3420
gcctcttctg ctcttactgg tgtggaaatg ccaacctgcc tcgtattaac tgcaccatct 3480
acaaaatctg agctccagcc agtgctgctc tagattcatc tttctttaga gagaatgaat 3540
tattgtagcc cctagccctt tcaatgaatt tcagggaatt gtggaaattc ctttattggg 3600
ataattgttt aaaaataata cagttcgcga gcttctattc ggggtggaag gagattgatg 3660
tgcagagcag ctcccgctca tctgactttt cacggttcac tgggaacaat ttccaaatag 3720
caaactctct ggcttctctc tctttgcaga tgacggctgc ccgaagcccc ccgagattgc 3780
acatggctat gtggagcact cggttcgcta ccagtgtaag aactactaca aactgcgcac 3840
agaaggagat ggtaagatgt ggacaactgt ctccatgccc tacatacaac ccccttctct 3900
gacatttcca tgatgggtgg tgctgaggtg attcgccaga aagttcgttg ctctccttgg 3960
agccaggaga tttagattct aataagcgtt ttgtcgccag tagccatggc cctttgggca 4020
gactaacttt tgtcagcctc aagttttctg ttttgttaag gggaggcgat gccatgcagc 4080
ctacctcatg taaatctcag agtcacattt acatctccag cagatgtggg aaaagaagga 4140
atgctgatga tgatgtcacc ctcacctagt gagtcttgct gtcctggcac tgctctaagg 4200
gctttatact tatttgctca cttagtcctc acagtatccc tctgaacaga gtttattgtt 4260
ttcactttgc tgataaggaa actgaggcac agacaggttg agtatcttgc ccaaattcag 4320
gcagcctgta agaggcagag tcaggatttg aaccctgagc cctccctgta ctgcttggct 4380
gtgaccgcca tgaccacagt gtgttctgct gggcttaact ggcatccagg cacttggctt 4440
ccagcacagc actctttccc ttcctccttc tcatatactc tctccttttc cccttccttt 4500
ttgtcccctt ttcctcttcc ttttagttct tctctttaaa tgccttctca ctctgcacgg 4560
ggtctagact tgacttctcc tttggctcac ttcttgcctt ttgtttcagg agtgtacacc 4620
ttaaacaatg agaagcagtg gataaataag gctgttggag ataaacttcc tgaatgtgaa 4680
gcaggtgggt gctgagcact taagagagca ggcaggcgtc cagcggggaa cgtcctagag 4740
gcacagcctt ccagtgcggc ttcctctgag cacacaagag ccaggaggag ggatgtggga 4800
gaaccgcagc tggccaggga gagacttaag cagttaggtg atgactccct aagggtcacc 4860
aagggtcttg ttcattaggg cctgaagggc actggctgaa tccattgtct acatcgccca 4920
cagattagga gagcctgtgc atacagagag cctgctagag agccctgggt ctaaggagaa 4980
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ctcctttcat tctcagaaca agaggcaaag gcccagcctc ttctgctctt actggtgtgg 5160
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tgcagcggat cctgggtgga cacctggatg ccaaaggcag ctttccctgg caggctaaga 5700
tggtttccca ccataatctc accacaggtg ccacgctgat caatgaacaa tggctgctga 5760
ccacggctaa aaatctcttc ctgaaccatt cagaaaatgc aacagcgaaa gacattgccc 5820
ctactttaac actctatgtg gggaaaaagc agcttgtaga gattgagaag gttgttctac 5880
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atgagagagt gatgcccatc tgcctacctt caaaggatta tgcagaagta gggcgtgtgg 6000
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tctgtgctgg catgtctaag taccaagaag acacctgcta tggcgatgcg ggcagtgcct 6240
ttgccgttca cgacctggag gaggacacct ggtatgcgac tgggatctta agctttgata 6300
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tgtggtttga agctgatggg tgccagccct gcattgctga gtcaatcaat aaagagcttt 6540
cttttgaccc a 6551
<210> 4
<211> 406
<212> PRT
<213> 人源
<400> 4
Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu
1 5 10 15
Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly
20 25 30
Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val
35 40 45
Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly
50 55 60
Val Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly
65 70 75 80
Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro
85 90 95
Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys
100 105 110
Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn
115 120 125
Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu
130 135 140
Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln
145 150 155 160
Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln
165 170 175
Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile
180 185 190
Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His
195 200 205
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Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro
225 230 235 240
Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val
245 250 255
Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr
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Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala
275 280 285
Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala
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Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu
305 310 315 320
Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu
325 330 335
His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr
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Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr
355 360 365
Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala
370 375 380
Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln
385 390 395 400
Lys Thr Ile Ala Glu Asn
405
机译: 蛋白酶抗原的制备方法,用于不同来源的稀壁蛋白或提取物中的蛋白酶捕获;用于确定来自不同来源的ProteaIn生物流体竞争性抑制物的捕获免疫测定过程;分离诊断中感兴趣的抗原的过程;微生物,植物或动物的提取物和/或生物流体中蛋白酶的检测和定量过程;植物或动物的菌毛,提取物和/或生物体液中蛋白酶抑制物的检测和定量的过程。诊断试剂和诊断试剂盒的制备过程
机译: 用于定量测定食品中麦醇溶蛋白的测试试剂盒制备麦醇溶蛋白标准溶液的方法,该试剂盒和所制备的麦醇溶蛋白标准溶液。
机译: 血清型8的蓝舌病病毒的VP2衣壳蛋白,具有该蛋白的组合物或化合物在制备试剂或试剂盒中的用途,所述试剂或试剂盒用于体外诊断动物中BTV病毒的感染。牛的