基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法

摘要

本发明公开了一种基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法，特点是包括以下步骤：取0.1 mL功能化超顺磁性二维材料GO@SPIONs&Ab分散液和1.0‑1.4 mL含不同浓度食源性致病菌的待测样品，加入到样品瓶中混合，振摇孵育30 min，置于低场核磁共振造影剂驰豫分析仪，在35℃下采集T

说明书

技术领域

本发明涉及低场核磁共振均相检测源性致病菌的方法，尤其是涉及一种基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法。

背景技术

食源性致病菌是指可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。常见的食源性致病菌有：副溶血性弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等，传统检测食源性致病菌的方法为生化培养鉴定法，此法步骤繁琐，检测周期长，耗时费力。随着分子生物学技术快速发展，聚合酶链式反应（PCR）、DNA杂交和环介导等温扩增（LAMP）、生物芯片等方法也被应用于检测食源性致病菌，获得了较好的准确度和灵敏度，但在实际应用中也存在不少问题：假阳性几率偏高、仪器昂贵、检测成本高、检测步骤复杂、检测时间长等。因此，开发灵敏、准确、简便、快速的食源性致病菌检测方法，是迫切需求。副溶血性弧菌（VP），是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛分布于河口、沿海以及海洋等环境中，以及浮游动物、鱼类和贝类等海洋生物体内。VP被公认为是世界上最重要的食源性病原体之一，食用生的、未烹煮熟的或处理不当的海产品（尤其是贝类）后，会诱发急性肠胃炎、伤口感染、败血症等一系列疾病，严重者甚至死亡。为了应对日益增长的公共卫生和医疗诊断需求，开发快速、灵敏、准确、无损的VP现场检测方法很有意义。

传统上采用平板菌落计数法检测VP，该方法耗时长，步骤复杂，无法满足高效的现场检测要求。基于分子生物检测VP的方法，包括酶联免疫分析法（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、环介导的等温扩增（LAMP）等，虽然检测速度较快，检测准确度和灵敏度较高，但需要昂贵的仪器、复杂的检测步骤、熟练的操作人员，也不太适合现场快速检测。还有一些其他方法如比色、荧光(FIA)和电化学发光(ECL)等可以检测VP，但对样品要求较高，无法直接开展对浑浊的真实样品的分析，需要经过复杂的预处理才可进行检测，降低了现场可用性。

低场核磁共振MRSw传感器的检测原理是：在均匀的磁场中，水质子的进动频率与所处的环境密切相关，如果不同位置的水质子磁体所处环境的磁场强度不一致，其进动频率也会发生改变，相位一致性失去，驰豫时间缩短。影响的磁场包括两个主磁场，超顺磁性材料形成的局部磁场，如果主磁场均匀且一致，则T

超顺磁性是一种无相互作用或者弱相互作用的超自旋现象。因为大部分的二维材料不具有磁性，因此大量的工作集中于制造空位，元素掺杂等方式在非磁性的石墨烯或者二硫化钼材料中引入磁性，近年来，通过机械剥离，化学气相沉积、分子束外等方法发现了本征性次性二维材料，在某些特定条件下表现出超顺磁性。但是上述本征磁性的二维材料目前还处于理论研究阶段，但是有纳米离子组合而成的磁性纳米二维复合材料已经可以被制作出来。二维材料因其载流子迁移和热量扩散都被限制在二维平面内，使得这种材料展现出许多奇特的性质。其带隙可调的特性在场效应管、光电器件、热电器件等领域应用广泛；其自旋自由度和谷自由度的可控性在自旋电子学和谷电子学领域引起深入研究。目前，国内外还没有关于基于超顺磁性二维材料检测食源性致病菌的免疫传感器的制备方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度和精确性高、特异性强且操作简单快速的基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，包括以下步骤：

（1）功能化超顺磁性二维材料GO@SPIONs&Ab的合成

A．将0.5-1.5 mg/mL 氧化石墨烯（GO）分散液15-25 mL于12000 rpm离心5 min后，弃去上清液，重新分散在15-25mL无水乙醇中超声6 min，随后加入15-25 µL 浓度为0.0426M 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液，并在65-75℃磁力搅拌3-5 h，用乙醇和水反复洗涤后，分散在20ml的水中，即得到氨基化的单层氧化石墨烯(NH

B．将1-3 mL 25 wt%的戊二醛溶液加入到8-12 mL NH

（2）食源性致病菌的低场核磁共振均相免疫检测

取0.1 mLGO@SPIONs&Ab分散液和1.0-1.4 mL 含不同浓度食源性致病菌的待测样品，加入到样品瓶中混合，振摇孵育30 min，置于低场核磁共振造影剂驰豫分析仪，在35℃下采集T

步骤（2）测量参数如下：主频19.00 MHz，回波个数18000，回波时间0.6 ms，累加次数2次，等待时间5000 ms，数字增益3，模拟增益15.0 dB。

步骤（2）ΔT

所述的食源性致病菌包括副溶血性弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌。

发明原理：本发明基于磁驰豫开关传感器（MRSw）传感器原理，结合超大比表面积的GO sheet结构，构建了一种超顺磁性二维材料MRSw检测VP传感器。功能化的超顺磁性GO作为传感器的捕获单元和信号单元，通过戊二醛固载在GO上的捕获型抗体Ab具有捕获VP的功能；检测型抗体Ab可以通过抗原抗体的特异性结合，多价配体的超顺磁性GO与VP形成空间网络聚集体结构，改变周围水分子的T

本发明的免疫学原理，SPIONs与Ab通过戊二醛固定在氨基化的GO，构成兼具超顺磁性与特异性的磁性标签。当VP不存在时，片状的磁性标签均匀的分散在水中形成相对均一稳定的磁性流体；当体系中存在VP时，Ab可以利用抗原抗体的特异性结合将VP捕获，并与磁性靶标相互连接形成空间网络聚合体结构，调整VP的用量大小，可以实现空间网络聚合体大小与数量的调控，由此控制对体系中水分子T

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、样品预处理简单：LF-NMR的信号来源于磁性而非光电性质，考虑到检测环境中几乎不存在磁性物质，故LF-NMR近乎无背景干扰，甚至可以直接检测浑浊样品。检测对象为致病菌个体，无需提取DNA进行扩增，可以直接对样品进行直接检测。

2、步骤简单、提高检测效率：仅需要将制备好的MRSw传感器与致病菌进行混合，振摇条件下孵育反应30min，即可放入低场核磁共振检测仪中进行检测，检测时间为2-3min。多个样品集体检测时，孵育时间与检测时间并行，提高检测效率。

3、三重放大信号提高检测灵敏度：(1) 磁化率增强。SPIONs均匀地分散在GO表面增加了与水的接触面积，且单位质量磁性材料的磁化率增加，扩大影响的水分子范围，实现信号的一级增强。(2) 磁性信号标签SPIONs数量增加。每一个靶标物上的结合位点，对应的不是一个SPIONs，而是一张GO sheet上结合的大量SPIONs，实现信号的二级增强。(3)协同作用增强。多价SPIONs与微米级别的致病菌存在较大的尺寸差异，在形成免疫复合物时，空间位阻效应明显难以形成较大的空间网络结构，超顺磁性二维材料依托较大的表面积和优良的可塑性与靶标物形成空间网络结构的横截面积更大，故其相互作用形成的协同作用也更大，局部磁场更不均匀，T

综上所述，本发明首次制备了基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测食源性致病菌的方法，该材料为GO表面同时负载有超顺磁性纳米Fe

附图说明

图1为本发明功能化超顺磁性二维材料的制备流程图；

图2为本发明功能化超顺磁性二维材料的电镜图；

图3为本发明功能化超顺磁性二维材料MRSw检测VP传感器检测原理图；

图4为低场核磁共振检测不同VP浓度下的线性关系图；

图5为低场核磁共振检测相同浓度下不同种类细菌的传感器特异性图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

实施例1

一种基于超顺磁性二维材料的低场核磁共振均相免疫检测副溶血性弧菌的方法，如图1所示，包括以下步骤：

（1）功能化超顺磁性二维材料GO@SPIONs&Ab的合成

A．将0.5-1.5 mg/mL 氧化石墨烯（GO）分散液20 mL于12000 rpm离心5 min后，弃去上清液，重新分散在20 mL无水乙醇中超声6 min，随后加入25 µL 浓度为0.0426 M 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液，并在70℃磁力搅拌4 h，用乙醇和水反复洗涤，以除去多余的APTES，然后分散在20ml的水中，即得到氨基化的单层氧化石墨烯(NH

B．将2 mL 25 wt%的戊二醛溶液加入到10 mL NH

超顺磁性二维材料的形貌特征如图2，由图2可知二维材料表面修饰大量的SPIONs，且SPIONs的粒径均一，同时SPIONs在GO表面相对平均分布，表明此类方法合成的超顺磁性二维材料稳定性好，重现性好。此外，通过调节加入SPIONs量的多少来控制GO表面磁球的结合量和调节总体材料磁矩的大小。

（2）副溶血性弧菌的低场核磁共振均相免疫检测

取0.1 mLGO@SPIONs&Ab分散液和1.2 mL 含不同浓度副溶血性弧菌的待测样品，加入到样品瓶中混合，振摇孵育30 min，置于低场核磁共振造影剂驰豫分析仪，在35℃下采集T

测量参数如下：主频19.00 MHz，回波个数18000，回波时间0.6 ms，累加次数2次，等待时间5000 ms，数字增益3，模拟增益15.0 dB。

本研究中低场核磁共振传感器的检测原理如图3，由图3可知在均匀的磁场中，水质子的进动频率与所处的环境密切相关，如果不同位置的水质子磁体所处环境的磁场强度不一致，其进动频率也会发生改变，相位一致性失去，驰豫时间缩短。影响的磁场包括两个主磁场，超顺磁性材料形成的局部磁场，如果主磁场均匀且一致，则T

实施例2

同上述实施例1，其区别在于：（1）功能化超顺磁性二维材料GO@SPIONs&Ab的合成：将0.5mg/mL 氧化石墨烯分散液15mL于12000 rpm离心5 min后，弃去上清液，重新分散在15mL无水乙醇中超声6 min，随后加入15 µL 浓度为0.0426 M 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，并在65℃磁力搅拌5 h，用乙醇和水反复洗涤后，分散在20ml的水中，即得到氨基化的单层氧化石墨烯(NH

（2）副溶血性弧菌的低场核磁共振均相免疫检测：取0.1 mLGO@SPIONs&Ab分散液和1.0 mL 含不同浓度食源性致病菌的待测样品加入到样品瓶中混合。

实施例3

同上述实施例1，其区别在于：（1）功能化超顺磁性二维材料GO@SPIONs&Ab的合成：将1.5 mg/mL 氧化石墨烯（GO）分散液25 mL于12000 rpm离心5 min后，弃去上清液，重新分散在25 mL无水乙醇中超声6 min，随后加入25 µL 浓度为0.0426 M 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液，并在75℃磁力搅拌5 h，用乙醇和水反复洗涤后，分散在20ml的水中，即得到氨基化的单层氧化石墨烯(NH

（2）副溶血性弧菌的低场核磁共振均相免疫检测：取0.1 mLGO@SPIONs&Ab分散液和1.4 mL 含不同浓度食源性致病菌的待测样品加入到样品瓶中混合。

除上述实施例外，可将副溶血性弧菌替换为创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或沙门氏菌，以及相应的抗体，从而达到检测不同的食源性致病菌的目的。

具体实施例二

灵敏度检测

图4为低场核磁共振检测不同VP浓度下的线性关系图；以30 min为最佳孵育时间，考察了MRSw检测副溶血性弧菌VP的灵敏度，定量检测1.0×10

具体实施例三

特异性检测

MRSw传感器的特异性实验，为了模拟海水复杂的细菌环境，在最佳实验条件下，通过检测浓度为1.0×10

应用实施例

为验证本方法在实际应用中的价值，在东海海水中加入副溶血性弧菌标准溶液作为实际样品，采用加标回收的方法对海水中不同浓度的副溶血性弧菌进行了用低场核磁共振法检测，结果如表1所示，

表 1

由表1可知，本发明方法相对标准偏差（RSD）小于8.9%，回收率为93.5～108.4%，结果令人满意，表明本发明方法对于海水中副溶血性弧菌的检测结果准确可靠。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。