用数据非依赖性采集质谱分析生物分子样品的方法和设备

摘要

本发明公开了一种用于分析生物分子样品的质谱方法，所述质谱方法包括：提供包括含生物分子的样品的混合物的多路复用样品；洗脱样品，通过数据依赖性采集(DDA)或数据非依赖性采集(DIA)获取所述多路复用样品的MS2光谱；由通过DDA获取的所述MS2光谱形成光谱库；将片段离子的峰与MS2光谱中的片段离子的峰进行匹配，以找到匹配的生物分子；根据多个保留时间中的每个保留时间时的所述DIA MS2光谱确定每个匹配的生物分子的总丰度；根据DIA MS2光谱确定来自质量标签的相应报告离子的丰度；以及基于所述丰度和所述匹配的生物分子在多个保留时间内的对应保留时间时的所确定的总丰度，对每个分别标记的含生物分子的样品中的所述生物分子的相对丰度进行去卷积。

说明书

技术领域

本公开涉及质谱法领域。本公开的各方面涉及使用质谱法定量生物分子，具体是但不仅限于生物分子，如肽和蛋白质。本公开适用于基于质谱法的蛋白质组学领域。

背景技术

数据非依赖性采集(DIA)是质谱法中的一种分析模式，特别是在基于MS的蛋白质组学中。在DIA中，选择特定m/z范围内的所有前体离子种类并进行碎裂以生成片段离子(也被称为产物离子)。然后在MS/MS(也被称为MS2)扫描中对片段离子进行质量分析，由于前体离子的共同碎裂，这会产生复杂的MS2质谱图。已尝试对共同碎裂进行去卷积，如以下中描述的：Peckner等人,频谱：用于对数据非依赖性采集质谱法蛋白质组学的靶向分析的线性去卷积(Specter:linear deconvolution for targeted analysis of data-independentacquisition mass spectrometry proteomics),《自然方法(Nature methods)》第15卷,第5期(2018),371。然而，DIA的主要优点是“缺失”峰的数量少，这是MS2分析的替代方法数据依赖性采集(DDA)中的一个重大问题，因为DDA中前体选择的随机性。DDA方法利用在MS1(前体离子)扫描中获取的数据来基于预定标准选择一种或多种特定离子种类，用于碎裂和随后的MS2分析。由于用于选择特定前体离子的m/z范围更窄，但代价是没有选择每个前体，这会产生更简单、更具体的MS2质谱图。用于从DDA中的MS1分析中选择离子种类的预定标准可以包括以下中的一项或多项：峰强度、电荷状态(z)、质荷比(m/z)、峰包含/排除列表或同位素模式。

当实验涵盖大量非依赖性样品时，伴随DIA的少量“缺失值”特别重要，其中任务是比较样品之间的蛋白质丰度。作为实例，如果需要将100个样品与随机分布在检测到的蛋白质中的每个样品中的1％的缺失值进行比较，那么所有蛋白质中的平均0.99

基于MS的蛋白质组学领域的最新发展是使用质量标签(也被称为质量标记)，所述质量标签可切割地附接到相关的所关注分子。所谓的同量异序标签用于对生物大分子例如蛋白质、肽、核酸和核苷酸的鉴定和定量。使用串联质量标签(TMT)标记的特定方法例如在以下中描述：WO 01/68664A2和Thompson等人《分析化学(Anal.Chem.)》2003,75,1895-1904。TMT含有四个区或部分，即质量报告子区或部分(M)、可切割连接子区或部分(F)、质量标准化区或部分(N)和蛋白质反应性基团(R)。TMT集中的所有标签(也被称为通道)的化学结构均相同，但各自含有在不同位置处经取代的同位素，使得质量报告子和质量标准化区在每个标签中具有不同分子质量。然而，标签的组合M-F-N-R区域具有相同的总分子量和结构，使得在色谱或电泳分离期间和在单一MS模式下，无法区分标记有不同标签的分子。在MS/MS(MS2)模式下碎裂时，从肽骨架的碎裂中获得序列信息，并且同时从标签的碎裂中获得定量数据，从而产生质量报告离子(参见https://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝Tandem_mass_tag&oldid＝882091680)。

在典型的自下而上蛋白质组学工作流程中，蛋白质样品被酶消化以产生肽。每个经消化的样品都被衍生或标记有来自一组同量异序标签的不同同位素变体。然后将标记的样品混合，通常以相等的比例混合，并在一次液相色谱法-MS(LC-MS)实验运行中同时进行分析。由于标签是同量异序的并且具有相同的化学性质，同位素变体在MS1(前体)扫描中以相同的m/z值显示为单个复合峰，具有相同的液相色谱法(LC)保留时间。在LC-MS分析中的MS2扫描期间，碎裂的肽会产生序列特异性片段离子(也被称为产物离子)。片段离子用于确定肽序列，并且标签的报告离子的相对丰度反映了组合的单独样品中的肽的相对比率。因此需要MS2扫描来检测标签的报告离子。同量异序标记(如TMT标记)相对于其它定量技术的一个关键益处是多重能力和相关的增加吞吐量。在一次LC-MS运行中同时组合和分析若干个样品的能力消除了分析多个数据集的需要，并且消除了运行到允许的差异。

在DIA MS分析的情况下，多路复用会出现问题，例如，在使用TMT标记时，由于来自由于DIA中通常使用的MS2质量选择窗口较宽(例如10-20m/z单位(Th))而同时碎裂的不同(肽)前体的TMT报告离子信号重叠。图1以6重TMT多路复用样品的实例示意性地展示了这一点。在上图中，示出了作为色谱保留时间(RT)函数的若干种肽的丰度(I)。表示为1、2和3的三种肽被示出具有重叠的洗脱峰，包含在时间t

相比之下，在DDA分析中，MS2选择窗口可以是0.8m/z单位或更窄，这在实践中减轻了重叠问题并允许样品多路复用。因此，DDA可以分析10-16个TMT多路复用样品。然而，如上文所描述的，这种吞吐量的增加是在DDA中实现的，代价是MS2光谱中丢失值的数量增加。

因此，能够将DIA用于多重同量异序标记的样品(TMT标记的样品)以实现TMT工作流程的高通量和DIA固有的低丢失质谱数据数量两者，同时解决来自不同前体的报告离子信号的重叠的问题。针对上述背景，作出了本公开。

发明内容

本公开提供了一种根据所附权利要求的质谱方法。

一方面，本公开提供了一种用于分析生物分子样品的质谱方法，所述质谱方法包括：

提供包括含生物分子的样品的混合物的多路复用样品，其中所述含生物分子的样品分别用质量标签进行标记；

当所述含生物分子的样品的所述多路复用样品或另一种质量标记的混合物从液相色谱装置中洗脱时，通过数据依赖性采集(DDA)获取所述多路复用样品或另一种质量标记的混合物的MS2光谱；

当所述多路复用样品从所述液相色谱装置中洗脱时，通过数据非依赖性采集(DIA)获取所述多路复用样品的MS2光谱；

由通过DDA获取的所述MS2光谱形成光谱库，所述光谱库包括表示多个质量标记的生物分子的分子离子和其片段离子以及所述生物分子的保留时间(即洗脱时间)的多个MS2光谱；

将通过DIA获取的所述MS2光谱中的片段离子的峰与所述光谱库的所述MS2光谱中的片段离子的峰进行匹配，以找到匹配的生物分子；

根据通过DIA在多个保留时间中的每个保留时间(即跨所述多路复用样品的洗脱的保留时间)处获取的所述MS2光谱确定每个匹配的生物分子的所有质量标签的总丰度，优选地通过将通过DIA获取的MS2光谱中的匹配的生物分子的片段离子和分子离子的峰强度相加；

根据通过DIA在所述多个保留时间时获取的所述MS2光谱确定源自所述质量标签的相应报告离子的丰度；以及

基于所述相应报告离子的所确定的丰度和所述匹配的生物分子在所述多个保留时间内的对应保留时间时的所有质量标签的所确定的总丰度，对每个含生物分子的样品中的生物分子的相对丰度进行去卷积。

在优选的实施例中，所述生物分子是肽，优选地通过消化蛋白质产生的肽。

在优选的实施例中，所述含生物分子的样品是消化的单细胞蛋白质组的样品。

在优选的实施例中，所述质量标签是串联质量标签(TMT)。

在优选的实施例中，形成所述光谱库包含处理通过DDA获取的所述MS2光谱，其包括以下中的一项或多项：

(i)去除表示对生物分子不具有特异性的离子的峰；

(ii)使所述光谱去同位素；

(iii)将所述生物分子的片段离子的峰装仓到多个m/z仓中，并在每个仓中保留最强峰；

(iv)去除重复光谱。

在优选的实施例中，所述光谱库包括经鉴定的生物分子和未经鉴定的生物分子两者的质谱。

在优选的实施例中，所述光谱库中的经鉴定的生物分子的质谱是通过以下获得的：首先在通过数据依赖性采集(DDA)获取的MS1光谱中找到峰，在通过DDA获取的所述MS2光谱中找到与所述MS1光谱中的峰相关的片段离子的峰，并且基于MS1中的峰和片段离子的相关峰鉴定所述生物分子的结构。

在优选的实施例中，在所述MS1光谱中找到峰包括鉴定所述MS1光谱中的预期属于生物分子的同位素簇。

在优选的实施例中，经鉴定的生物分子的光谱库中的质谱仅包括由经鉴定的结构支持的片段离子的相关峰。

在优选的实施例中，所述生物分子的经鉴定的结构不支持的相关片段离子用于表示所述光谱库中的未经鉴定的生物分子。

在优选的实施例中，未经鉴定的生物分子包括源自暗蛋白质组的肽(暗蛋白质组肽)。

在优选的实施例中，在匹配步骤中，将所述光谱库中的质谱各自与通过DIA在库质谱的保留时间周围的保留时间窗中获取的所述质谱进行匹配。

在优选的实施例中，所述方法进一步包括为所述光谱库中的每个质谱在所述保留时间窗中的每个时间点时计算一系列概率评分，并且基于所述一系列概率评分从所述匹配中去除多个光谱。

在优选的实施例中，所述一系列概率评分包括光谱匹配评分、所有匹配的片段离子的总强度和/或匹配的片段离子的数量。

在优选的实施例中，将片段离子和任选地分子离子的峰强度相加以确定每个生物分子的丰度包括计算在保留时间间隔内通过DIA获取的MS2光谱中的片段离子的匹配峰的强度总和。

在优选的实施例中，确定每个生物分子的洗脱顶点，并且在所述顶点的任一侧通过DIA获取的预定数量的MS2光谱用于确定所述保留时间间隔。

在优选的实施例中，所述方法进一步包括通过所述保留时间间隔中的时间点为每个匹配的片段离子的强度拟合峰形模型，优选地为高斯(Gaussian)模型，并且去除相关性低于所述模型的阈值的片段离子。

在优选的实施例中，所述方法进一步包括计算通过DIA获取的所述MS2光谱中的所有匹配的片段离子峰的中值强度，并且使每个片段离子强度与中值相关，其中去除相关性高于阈值的片段离子。

在优选的实施例中，根据所述报告离子的丰度对所述生物分子的相对丰度进行去卷积包括使用一组线性方程。所述组中的每个线性方程优选地针对(不同的)相应的保留时间(即针对不同的MS2光谱)构建。

在优选的实施例中，每个线性方程使所述含生物分子的样品之一的报告离子的丰度与所述含生物分子的样品中的生物分子中的每个生物分子的丰度的线性组合相关，其中所述样品中的每个生物分子的丰度表示为所述生物分子对于所有质量标签的总丰度，即在所有含生物分子的样品中，乘以所述含生物分子的样品中的所述生物分子的相对丰度。

在优选的实施例中，每个线性方程使所述相应报告离子的所确定的丰度与所述含生物分子的样品中的每个含生物分子的样品中的所述生物分子在相应保留时间时的丰度的线性组合相关，其中所述样品中的每个样品中的每个生物分子的丰度表示为所述生物分子的所述所确定的总丰度乘以所述样品中的所述生物分子的所述相对丰度。

优选地，为样品中的N个匹配的生物分子构建一组M个线性方程(N通常<10,000)，其中M≥N*X，其中X是MS2扫描的数量(对于特定的DIA窗口)或相应报告离子的数量。优选地，获取的DIA MS2扫描的总数量为M，或至少为M。在优选的实施例中，根据所述报告离子的所述丰度对所述生物分子的相对丰度进行去卷积包括对矩阵求解，例如对线性方程求解。在优选的实施例中，去卷积包括构造矩阵，其中第一矩阵(M1)包括所述相应报告离子的所确定的丰度作为列，其中所述保留时间对应于行，并且第二矩阵(M2)包括所述(相应)匹配的生物分子的所确定的总丰度作为列，其中所述保留时间对应于行。第三矩阵(M3)包括每个含生物分子的样品中的所述生物分子的所述相对丰度。所述第三矩阵可以包括每个含生物分子的样品中的所述生物分子的所述相对丰度作为列，其中所述(相应)生物分子对应于行。通过对公式M1＝M2*M3求解，可以找到每个含生物分子的样品中的生物分子的相对丰度。

在一些实施例中，所述含生物分子的样品之一是其它样品的合并样品，并且对所述报告离子的所述丰度进行去卷积包括在每个生物分子的洗脱或保留时间内，基于所述生物分子的所述所确定的丰度，拟合线性函数，所述线性函数使单独报告离子的丰度与所述合并样品的报告离子的丰度相关。

本公开的另一方面提供了一种在控制器控制下的质谱仪，其中所述控制器被配置成使得所述质谱仪可操作以执行根据本公开的方法的步骤。具体地，本公开提供了一种用于分析生物分子样品的质谱仪，所述质谱仪包括：电离源，所述电离源用于产生由色谱装置提供的所述生物分子的前体离子；质量选择器，所述质量选择器用于选择所述前体离子的质量范围；碎裂装置，所述碎裂装置用于使由所述质量选择器选择的前体离子碎裂以产生片段离子；质量分析器，所述质量分析器用于对所述前体离子和所述片段离子进行质量分析；以及控制器，所述控制器被配置成使所述质谱仪执行根据本公开的方法的质谱方法。

本公开的另一方面提供了一种计算机程序，所述计算机程序在由计算机的一个或多个处理器执行时，使所述一个或多个处理器执行根据本公开的方法，通常通过控制所述质谱仪执行根据本文中的本公开的质谱方法。因此，所述计算机优选地是所述质谱仪的所述控制器的一部分。所述计算机程序可以存储在计算机可读介质上以供所述处理器执行，例如存储在闪存驱动器、硬盘驱动器等上。因此，本公开还提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序在由计算机的一个或多个处理器执行时使所述一个或多个处理器控制质谱仪根据本公开的方法执行质谱方法。

下文将主要使用肽作为生物分子的实例来展示本公开，例如已经源自蛋白质的肽。然而，本公开不限于肽并且可以与其它生物分子一起使用。因此，本文中的术语生物分子涵盖例如肽、蛋白质、核酸、核苷酸和其它此类生物分子。具体地，本公开可以扩展到对选自以下的生物分子的分析：生物聚合物、蛋白质、肽、多肽、氨基酸、碳水化合物、糖、脂肪酸、脂质、维生素、激素、多糖、磷酸化肽、磷酸化蛋白质、糖肽、糖蛋白、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷、寡核苷、DNA、DNA片段、cDNA、cDNA片段、RNA、RNA片段、mRNA、mRNA片段、tRNA、tRNA片段、单克隆抗体、多克隆抗体、核糖核酸酶、酶、代谢产物和/或类固醇。所分析的样品可以包括至少2个、5个、10个、20个、50个、100个、500个、1000个、5000个或10,000个不同生物分子。

附图说明

图1示出了共同洗脱TMT标记的肽的色谱图(上图)、MS1光谱(中图)和MS2光谱(下图)的示意性实例。

图2示出了根据本公开的方法的流程图。

图3示出了两种共同隔离的肽A和B的质量色谱图、MS2光谱以及其相应的TMT强度。

图4A示出了两种肽A和B的洗脱曲线。

图4B示出了与两种肽A和B的实际TMT丰度相比，去卷积的TMT报告离子丰度。

图5A示出了50个标记肽的模拟色谱图。

图5B示出了去卷积的TMT丰度值与图5A的色谱图中每个TMT通道的每个肽的真实TMT丰度值相比的绘图。

图6示出了质谱仪的示意图，所述质谱仪适用于执行本公开的方法。

图7示出了用于对已知背景前体进行定量的TMT去卷积的结果。

图8示出了用于对已知“掺入”前体进行定量的TMT去卷积的结果。

图9示出了来自使用本公开的方法去卷积的DDA分析和DIA两者的背景肽(左侧)和“掺入”肽(右侧)的倍数变化的变异系数(CV)绘图。

图10示出了就DDA(顶部)和使用本公开的方法进行去卷积的DIA(底部)两者的相关系数R

具体实施方式

现在将参考附图描述根据本公开的各个实施例。这些实施例旨在说明本公开的各种特征，而并非旨在限制本公开的范围。应当了解，可以对这些实施例作出变化，但这些变化仍落入所附权利要求的范围内。

本公开的实施例涉及用于分析生物分子样品的质谱法。本公开提供了一种用于分析生物样品，并且具体是生物分子的质谱方法，所述方法包括分析包括含有生物分子的(单独)样品的混合物的多路复用样品，其中所述样品已经分别被质量标记。图2展示了根据本公开的方法100的流程图。在步骤102中，提供质量标记的多路复用样品。更详细地，所述方法包括提供包括含生物分子的样品的混合物的多路复用样品的步骤，其中在所述多路复用样品中，样品分别用单独的(即独特的/不同的)质量标签进行了质量标记。含有生物分子的单独样品优选地分别用与一组同量异序质量标签不同的同量异序质量标签进行标记。这意指同一样品中的每个生物分子都使用相同的质量标签进行质量标记。当使用如下文所描述的MS2质量扫描进行碎裂和分析时，来自同一样品的每个生物分子都会产生相同(唯一)的报告离子。然后可以混合质量标记的样品以形成多路复用样品。质量标记的样品通常以相等的比率混合以形成多路复用样品。在下文的大部分描述中，生物分子将被展示为肽，但如上所述，本公开不限于肽。因此，下文对肽的提及可以理解为包含适当地对其它生物分子(核酸、核苷酸(多核苷酸和寡核苷酸))的提及。每个含生物分子的样品含有多个不同的生物分子。在每个含生物分子的样品中，生物分子的身份可以基本上相同，但其丰度可以不同。通常，含生物分子的样品共同具有超过90％、95％、99％、99.5％或99.9％的其生物分子。单细胞蛋白质组学实验中的样品通常就是这种情况，其中所有单细胞蛋白质组的肽都相同，但丰度不同。

质量标签可以是串联质量标签(TMT)。所述一组同量异序质量标签可以具有所述组中的X个质量标签，例如X＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等；对于可商购获得的质量标签组，X通常为2到16、或2到11或2到10，例如X可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。因此，被标记和混合的单独样品的数量可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等，但通常在2到16或2到10的范围内。

生物分子样品通常是肽样品。肽样品通常由自下而上的蛋白质组学工作流程提供，其中蛋白质样品被酶消化以产生肽样品。每个单独的(消化的)样品优选地被标记或标记有来自同量异序标签组的质量标签的不同同位素变体。然后质量标记的样品通常以相等的比率混合以形成多路复用样品。然后使用液相色谱法-MS(LC-MS)分析多路复用样品，如下文所描述的。

在本文所描述的方法的一些实施例中，在使用一组X质量标签制备并包括X个样品的多路复用样品中，样品是单独的肽样品，通常由单独的蛋白质样品的消化形成。本公开例如适用于其中单独蛋白质样品构成来自单细胞的蛋白质组(每个蛋白质样品是来自单细胞的蛋白质组)的实施例中。

在本文所描述方法的一些其它实施例中，也适用于单细胞蛋白质组学分析，在使用一组X个质量标签制备的多路复用样品中，多路复用样品中的多个样品1到(X-1)是由单独蛋白质样品的消化形成的单独肽样品，并且多路复用样品中的第X个样品是单独样品1到(X-1)的池。第X个(合并)样品可以用于其它样品的归一化。单独肽样品可以是单细胞蛋白质组的消化物。在单细胞蛋白质组的情况下，第X个(合并)样品，也被称为“载体蛋白质组”或“大通道”，可以稀释到N个细胞的等效物(N可以是1到500或更多，但更优选地N为5到200、5到100或5到50。据报道推荐值为N～20(Cheung,T.K.等人“定义单细胞蛋白质组学的载体蛋白质组限制(Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics)”《自然方法》,第18卷(2020),76-83)。在一些实施例中，N≤X。例如，在TMT-10(即10重TMT集)多路复用样品中，TMT通道中的9个通道可以表示单独样品，如单细胞蛋白质组，并且第10个通道可以表示其它9个样品的合并样品，从而反映了大量蛋白质组。第10个TMT通道可以用于对其它9个通道进行归一化，并且可以制备或稀释为相当于N个细胞(例如N≤20，特别是如上文所描述的N～20，或N≤10)。

使用液相色谱法-MS(LC-MS)分析多路复用样品。由于标签是同量异序的并且具有相同的化学特性，因此在具有相同液相色谱保留时间(RT)的MS1(前体)扫描中，在多路复用样品中用同位素变体标记的特定肽段显示为相同m/z值的下单个复合峰。在LC-MS分析中的MS2(即MS/MS)扫描期间，碎裂的肽会产生结构特异性片段离子(也被称为产物离子)。片段离子用于确定肽序列，并且质量标签的报告离子的相对丰度反映了组合的单独样品中的肽的相对丰度(比率)。因此需要MS2扫描来检测标签的报告离子。

随着特定肽的色谱峰随时间(从色谱装置/色谱柱中)洗脱，源自肽的报告离子以及其结构特异性片段离子两者的MS2分析中的丰度开始与肽丰度成比例变化。对于每个给定的报告离子(质量标签通道)，此比例或比例系数取决于用给定质量标签进行标记的特定(单独)样品中的洗脱肽的相对丰度，即相对于其在其它标记的样品中的丰度。这可以在本公开中用于提取特定(单独)样品中的肽的单独相对丰度(即，与其它样品中的丰度相比)。然而，在DIA中，由于来自不同(肽)前体的报告离子信号由于在DIA中使用的MS2质量选择窗口通常较宽(例如10-20m/z单位(Th))而重叠，因此多路复用样品出现问题。本公开解决了从DIA获得的质谱法数据中的来自不同的、共同碎裂的(肽)前体的报告离子信号的去卷积。

LC-MS分析优选地包括使用数据依赖性采集(DDA)获取含肽的样品的MS2质谱，通常在DIA分析之前，如图2的步骤104所示。此DDA分析可以包括通过多路复用样品的DDA获取MS2质谱。作为对分别标记的单独样品的多路复用样品进行DDA的替代，DDA分析可以包括使用含肽的样品的另一种混合物的数据依赖性采集(DDA)来获取MS2质谱。此类其它混合物还优选地用同量异序质量标签(TMT)进行质量标记，使得所述混合物中的肽具有与其在多路复用样品中相同的保留时间。当使用时，其它混合物优选地包括与多路复用样品相同比率的含肽的样品(例如，每个含肽的样品的等比率)。在一些实施例中，其它混合物可以与多路复用样品不同地标记，例如所述混合物可以用单个质量标签来标记，而不是包括多路复用样品的相应质量标签。然而，其它混合物的一个或多个质量标签是或来自与多路复用样品的质量标签相同的质量标签的同量异序组。例如，其它混合物可以是其它样品的合并样品，任选地包括(比多路复用样品)更高浓度的生物分子以在质谱中提供更高强度的峰，这对于形成光谱库是有用的。例如，在本文所描述的一些实施例中，其它混合物可以是第X个(合并)样品。

通过DDA获取的MS2质谱可以用于提供光谱库或数据库。因此，LC-MS分析可以包括从液相色谱装置(如色谱柱)中洗脱(标记的)多路复用样品(通常其一部分)或含肽的样品的其它(标记的)混合物，并且通过当从液相色谱装置中洗脱多路复用样品或其它混合物时对所述多路复用样品或其它混合物进行数据依赖性采集(DDA)来获取MS2质谱。在利用单独样品的合并样品的实施例中，可以对合并样品进行DDA分析。

当样品洗脱时，DDA包括多个(重复)分析循环。每个DDA循环包括一组：MS1(前体离子)扫描，然后是多个(数据相关)MS2扫描。优选地记录MS1扫描和MS2扫描中的每一个的保留时间(RT)。MS1扫描覆盖了样品中的肽的所关注质量范围。MS1扫描中获取的数据用于选择一种或多种特定离子种类以进行碎裂和随后的MS2分析。可以用于从MS1分析中选择离子种类的预定标准可以包括以下中的一项或多项：峰强度、电荷状态、质荷比(m/z)或同位素模式和/或峰包含/排除列表中的离子种类的存在。例如，可以使用前N个标准，其中选择基于强度的前N个离子种类(N可以是任何合适的数字，例如5、10、20、50、100或更高)，连同峰包含和/或排除列表一起。DDA质量分析的质量选择窗口可以是1m/z单位或更窄，或0.8m/z单位或更窄。

MS2质谱含有与源自肽的结构的片段离子(结构特异性片段离子)相对应的片段离子峰和与源自附接到肽的(TMT)质量标签的报告离子相对应的报告离子峰。通常，未碎裂的肽的前体离子峰也存在于光谱中。通过DDA质量分析获取的MS2质谱优选地用于形成肽的光谱库，包括从MS2光谱中提取的前体特异性片段离子峰，如下文更详细描述的。

LC-MS分析包括使用数据非依赖性采集(DIA)获取多路复用样品的MS2质谱，如图2的步骤106所示。在优选地首先进行DDA分析的实施例中，因此另外进行DIA。DIA和DDA在单独的运行中进行。优选地，DIA在DDA之后进行。因此，LC-MS分析包括从液相色谱装置(如色谱柱)中洗脱(标记的)多路复用样品(通常其一部分)并且通过当从液相色谱装置中洗脱标记的多路复用样品时对所述标记的多路复用样品进行数据非依赖性采集(DIA)来获取MS2质谱。DIAMS2质谱含有与源自在质量隔离(选择)窗口中隔离的肽的结构的片段离子(结构特异性片段离子)相对应的片段离子峰和与源自附接到肽的(TMT)质量标签的报告离子相对应的报告离子峰。通常，未碎裂的肽的前体离子峰也存在于光谱中。

当样品洗脱时，DIA包括多个分析循环。每个DIA循环包括一组(数据非依赖性)MS2扫描。DIA MS2扫描的(前体)质量隔离窗口的宽度大于DDA MS2扫描的(前体)质量隔离窗口的宽度，通常至少大2x、5x、10x或20x。例如，DIA MS2扫描的质量隔离窗口的宽度可以在2m/z单位到25m/z单位、或5到20m/s单位或10到20m/z单位的范围内，例如宽度为2、4、6、8、10、15、20或25m/z单位。通常，使用10m/z单位宽度窗口或20m/z单位宽度窗口。质量隔离窗口可以具有固定或可变的宽度，通常是固定的。DIA MS2扫描的质量隔离窗口可以相对于相邻窗口重叠或不重叠。DIA MS2扫描组基本上覆盖了多路复用样品中的肽的所关注质量范围(例如，MS1扫描的宽度，其可以为例如大约200到2000m/z单位、或300到1500m/z单位或400到1200m/z单位)。记录每次DIA MS2扫描的保留时间(RT)。DIA MS2光谱中表示的肽可以在使用光谱库或数据库的常规步骤中找到。用TMT标记的肽获取的肽光谱库和数据库尚未公开可用。现有库通常是用无标记方法获取的(例如肽质谱库、MassIVE-KB肽光谱库)。本发明方法的优选库方法包括使用来自如现在描述的DDA分析的数据。

通过DDA质量分析获取的MS2质谱优选地用于形成包括来自通过DDA获取的MS2光谱的多个肽和其片段离子的质谱数据(MS2质谱)的光谱库，如步骤108所示。因此，光谱库包括从MS2光谱中提取的肽前体特异性片段离子。光谱库通常含有多个肽前体中的每一个：肽的m/z值(来自MS1“调查”光谱和/或MS2分离窗口)和来自MS2扫描的其特异性片段的m/z。光谱库通常进一步含有多个肽(和相关片段离子)中每个肽的RT。

可以通过数据库搜索和/或从头测序在DDA MS2光谱中鉴定肽。例如，带有Andromeda搜索引擎的MaxQuant可以用于创建光谱库，尽管可以使用任何合适的搜索引擎。与特异性经鉴定肽前体相关的经鉴定片段离子(例如来自数据库搜索)包含在库中(经鉴定的肽)。DDA分析中的一些隔离的和碎裂的前体离子可能无法使用数据库搜索来鉴定，例如源自所谓的暗蛋白质组的那些。与未经鉴定的前体相关的片段离子优选地也包含在光谱库中(作为未经鉴定的肽)。如果不包含未经鉴定的肽，则可能会导致在后续步骤中出现偏置的去卷积TMT强度。在一些实施例中，广泛数据库搜索和从头测序的组合的使用可以允许鉴定和创建用于在DDA分析中触发MS2扫描的大多数(例如>80％)肽的光谱库。

用于光谱库的DDA光谱优选地经受一个或多个处理步骤或整理以清理光谱。在一些实施例中，DDA MS2光谱中的非特异性片段离子(不与肽前体相关联)可以从包含在光谱库中去除。这可以包含以下中的一个或多个，优选地全部：(TMT)质量标签报告离子、互补(TMT)质量标签离子、y1前体片段和剩余的前体离子。在库中包含片段离子之前，DDA MS2光谱优选地是去同位素的，例如通过应用在以下中发表的算法：Yuan,Z.、Shi,J.、Lin,W.、Chen,B.和Wu,F.X.基于特征的串联质谱去同位素方法(Features-based deisotopingmethod for tandem mass spectra.)《生物信息学进展(Adv.Bioinformatics)》2011,(2011)。可以使用其它去同位素方法，如Decon2LS(N.Jaitly、A.Mayampurath、K.Littlefield、J.N.Adkins、G.A.Anderson和R.D.Smith,“Decon2LS：用于高分辨率质谱法数据的自动处理和可视化的开源软件包(Decon2LS:an open-source software packagefor automated processing and visualization of high resolution massspectrometry data)”,《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》,第10卷,文章87,2009)以及ICR2LS(C.Masselon、L.Pasa-Tolic、S.W.Lee等人,“使用多路复用串联质谱法从大型数据库中鉴定胰蛋白酶肽：模拟和实验结果(Identification of tryptic peptides fromlarge databases using multiplexed tandem mass spectrometry:simulations andexperimental results)”,《蛋白质组学(Proteomics)》,第3卷,第7期,第1279-1286页,2003)，其使用THRASH算法(D.M.Horn、R.A.Zubarev和F.W.McLa erty,“大分子高分辨率电喷雾质谱的自动还原和解释(Automated reduction and interpretation of highresolution electrospray mass spectra of large molecules)”,《美国质谱学会杂志(Journal of the American Society for Mass Spectrometry)》,第11卷,第4期,第320-332页,2000)。

在一些实施例中，片段离子，即在去除非特异性片段离子和去同位素之后保留在光谱中的那些，被装仓到多个m/z范围中，优选地具有相等的m/z宽度，跨所关注的前体质量范围分布。确定每个仓中具有最高强度的片段离子的峰，并且为库保留多个强度最高的离子，因为所述离子最有可能是前体特异性的。去除其它片段离子峰。光谱库的管理还可以包括去除重复的MS2光谱。因此，在一些实施例中，重复的光谱库条目被去除。例如，比较给定保留时间窗(例如2分钟)内的并且前体离子m/z差异在预定公差范围内(例如104ppm)的所有光谱，并给出光谱匹配评分。如果匹配评分高于预定阈值(即匹配比阈值更接近)，则为库保留更强烈的光谱。许多用于确定匹配评分的方法是本领域已知的。这方面的优选匹配评分是以下中描述的Hyperscore：Searle,B.C.等人色谱图库通过与数据非依赖性采集质谱法改进肽检测和定量(Chromatogram libraries improve peptide detection andquantification by data independent acquisition mass spectrometry.)《自然通讯(Nat.Commun.)》9,1–12(2018)。

因此，在特定实施例中，形成光谱库可以包含处理通过DDA获取的MS2光谱，其中所述处理包括以下中的一项或多项：

(i)去除表示对生物分子不具有特异性的离子的峰；

(ii)使所述光谱去同位素；

(iii)将生物分子的片段离子的峰装仓到多个m/z仓中，并保留预定数量的最强峰；

(iv)去除重复光谱。

在LC-MS数据中，通常有许多肽在DDA MS2质谱中未鉴定，但相对丰富，例如源自暗蛋白质组。在一些情况下，此类肽的数量可以高达总数的25-30％。这些肽对整体质量标签(TMT)报告离子强度有贡献，但由于其特定MS2片段离子未知，因此对其贡献进行去卷积是一个问题。

为了解决此问题，现在描述一种优选的方法。光谱库中经鉴定肽的质谱是通过以下获得的：首先在通过数据依赖性采集(DDA)获取的MS1光谱中找到峰，然后基于保留时间(在公差范围内)在通过DDA获取的MS2光谱中找到与MS1光谱中的峰相关的片段离子的峰，并且随后基于MS1中的峰和片段离子的相关峰鉴定肽的结构。如上文所描述的，基于肽的相关前体和片段离子峰鉴定肽通常包括搜索数据库或库。MaxQuant是此类数据库的一个实例，但其它数据库也可用。MS2光谱可以首先进行去同位素，从而简化了光谱。通常，前体肽离子(例如来自MS1光谱)是从光谱中找到的，并且与每个前体相关的片段离子被鉴定。在一些实施例中，MS1(调查)光谱(来自样品的DDA质量分析)可以用于鉴定同位素簇或可能属于肽(例如，基于肽的m/z和z的合适或预期同位素簇的肽)的峰分布。因此，在MS1光谱中找到峰通常包括鉴定MS1光谱中的预期属于肽的同位素簇。对于每个经鉴定的同位素簇，基于保留时间找到与其相关的片段离子(在DDA光谱中)。在一些情况下，同一个片段离子可能与不止一个经鉴定的同位素簇相关，例如因为前体离子的不同电荷状态。这不是问题，因为在此阶段，片段的相关列表可能很广泛，并且含有假阳性片段，随后可以对所述假阳性片段进行清理。然后可以使用所发现肽前体的MS1数据和相关片段离子的组合或使用其它方法来鉴定肽(即结构/序列)。优选地，经鉴定的肽的光谱库中的质谱仅包括由经鉴定的结构支持的片段离子的相关峰。优选地，从形成光谱库的经鉴定的肽的质谱中去除不被经鉴定的结构支持的片段离子的相关峰。如上所述，除了经鉴定的肽之外，通常还有多个未经鉴定的肽(例如来自暗蛋白质组)。这些也可以优选地用于去卷积。经鉴定的肽的结构不支持的相关片段离子可以用于表示光谱库中未经鉴定的肽。在一种方法中，对于经鉴定的肽，可以检查相关片段离子的列表，并且仅保留由经鉴定的肽结构/序列支持的那些(与那些经鉴定的肽相关联)。对于未经鉴定的肽，检查相关片段离子的(每个)列表，并且仅独特的且与同时洗脱鉴定的肽无关的那些被保留为表示未经鉴定的肽。例如，从给定的相关片段离子列表中，独特且与任何同时洗脱的经鉴定的肽无关的那些片段离子用于表示未经鉴定的肽。然后，经鉴定的肽和未经鉴定的肽，即其片段离子，均可以用于质量标签(TMT)报告离子的丰度的去卷积。

用于肽鉴定问题的另一种实用方法包括使用(非常广泛的)数据库搜索连同使用如PEAKS(生物信息学解决方案公司(Bioinformatics Solutions Inc))等软件进行从头测序的组合，接受任何命中。在一些实施例中已经发现这允许为在DDA中触发MS2扫描的所有肽的>80％创建光谱库，并且使用这些来对报告离子丰度中的肽丰度进行去卷积。另一种方法是使用如MSFragger等搜索工具进行开放修改搜索(例如A.T.Kong等人,《

本公开特别适用于单细胞蛋白质组学(SCP)，即其中多路复用样品中的单独样品均源自单个细胞，即单细胞蛋白质组。因此，在特定实施例中，多路复用混合物的样品各自包括通过消化单细胞蛋白质组产生的肽。可以假设所有单细胞蛋白质组中的肽的身份都相同，但其丰度不同。在SCP中，主要目标是基于同一组蛋白质或肽在细胞中的丰度对细胞进行亚群分化。细胞亚群的分离或分化(即，将细胞分组成不同的亚群)可以通过确定其特征图谱(即其同一组蛋白质或肽的丰度图谱)并将具有类似图谱的细胞分组来进行。因此，在测量SCP中相对肽丰度方面的不准确只会导致细胞亚群的不太清楚的分化，这可能仍然足以进行亚群分化。因此，在一些实施例中，来自单细胞蛋白质组的DIA获得的MS2数据中的肽鉴定任务可以限于DDA获得的前体m/z、RT和片段离子库。

在细胞亚群鉴定之后，将清楚哪些肽在此类分化中贡献最大(本文中被称为“亚群特异性肽”)，之后通过旨在分析对亚群进行表征的这些亚群特异性肽的靶向方法可以再次进行单细胞蛋白质组分析(对另一个细胞群体，其可以仍含有相同的亚群)。此外，众所周知，对于亚群分化，分析数百个最丰富蛋白质的丰度通常就足够了。因此，以中等准确度鉴定和定量的能力，例如≤1000个蛋白质或≤10,000个肽，在大多数情况下就足以满足SCP的要求。

相应地，在本公开的一个方面，提供了一种细胞分化的方法，所述方法包括根据本公开的质谱法方法。单细胞样品，即含有单细胞蛋白质组的样品，可以被消化以产生含肽的样品。样品可以分别进行质量标记(TMT)和混合以形成多路复用样品，用于通过质谱法方法进行分析。确定去卷积的报告离子丰度。

DIA MS2质谱含有与源自洗脱肽的结构或序列的片段离子(结构特异性片段离子，也被称为序列特异性片段离子)相对应的片段离子峰并且同时含有与源自附接到洗脱肽的质量标签的报告离子相对应的报告离子峰。使用报告离子的相对丰度来定量已多路复用的相应样品中的相对肽丰度并且因此定量相应蛋白质丰度的一个问题是，用于DIA的质量隔离窗口相对较宽(例如10-20m/z单位)意味着报告离子强度或丰度通常是多个共同碎裂的肽(所谓的嵌合质量标签光谱)的结果。因此需要对来自多个共同碎裂的肽的(TMT)报告离子强度进行去卷积。

可以使用光谱库从DIA MS2光谱中发现或鉴定肽，即与光谱库中的肽匹配，优选地以上文描述的方式从多路样品的DDA质量分析中获得的光谱库，如图2的步骤110所示。此方法解决了缺乏公开可用的TMT标记的光谱库的问题。在替代方案中，可以将现有的TMT标记的样品转换为光谱库。将来也有可能使用计算机模拟生成的DIA库。然而，此类方法将不包含来自暗蛋白质组的未经鉴定的片段离子，这已被发现有利于混合TMT信号的成功去卷积。

由于DIA MS2光谱中的肽的(结构特异性)片段离子，峰与(DDA)光谱库中的MS2光谱中的片段离子的峰匹配。因此，DIA光谱可以与库光谱相匹配，并且因此找到DIA光谱中的肽。因此，从DIA MS2光谱的片段离子峰中找到或鉴定肽的步骤包括将DIA MS2光谱的片段离子与光谱库的片段离子匹配(即，将DIA MS2光谱中的片段离子峰与库光谱中的峰进行匹配)。优选地，每个库(MS2)光谱与DIA光谱相匹配。DIA MS2片段离子与库片段离子之间的匹配可以通过本领域已知的多种方法来确定，以便找到最接近的匹配。匹配通常基于DIA中的片段离子(的峰)相对于库光谱的m/z(质量误差)差异。任选地，可以在匹配的确定中使用其它因素，例如，保留时间的差异、前体m/z的差异等。以此方式，肽在DIAMS2光谱与光谱库中的MS2光谱之间进行匹配。

在将DIA MS2光谱的片段离子与(DDA)光谱库中的片段离子匹配之前，优选地比对其保留时间。保留时间比对方法是本领域公知的。例如，可以提取前体(MS1)峰，例如用Dinosaur工具(Teleman,J.、Chawade,A.、Sandin,M.、Levander,F.和

在优选的实施例中，库(MS2)质谱各自在保留时间窗中与DIA质谱匹配，优选地在库光谱的保留时间周围(优选集中在库光谱的保留时间上)的定义的保留时间窗。优选地，这是基于校正的(比对的)保留时间。对于典型的LC-MS实验，每个库(DDA)光谱可以在几分钟，优选地为1到5分钟或2到4分钟的保留时间窗，如3分钟保留时间窗(即跨越库光谱保留时间两侧的1.5分钟)内与每个DIA光谱进行匹配。如果片段离子(即其峰)位于彼此的预定质量公差内，例如10ppm公差，则所述片段离子优选地匹配。公差极限可以是，例如，15ppm或更少、10ppm或更少或5ppm或更少。如果DIA光谱中的多个片段离子被鉴定为在公差范围内匹配，则质量误差最低的片段离子通常被进一步视为匹配。在一些实施例中，除了质量误差之外，片段离子峰的匹配还可以基于另外的标准，例如强度误差和/或保留时间误差。在一些实施例中，为了评估真正匹配的概率，对于每个库光谱，可以在保留时间窗中的每个时间点时计算一系列(即两个或更多个)概率评分(每个DIA MS2光谱在相应的时间点时被获取)。因此，在定义的保留时间窗中，每个(DDA)库光谱都会针对每个DIAMS2光谱进行评分。评分可以用于确定肽的洗脱曲线。在一个实例中，这一系列概率评分可以包含光谱匹配评分，例如“超评分”(Searle等人，上文)、所有(匹配的)片段离子的(强度)总和(总和强度)和/或匹配的片段离子的数量。概率评分系列可以用作用于从进一步处理中去除多个光谱匹配的标准，即从匹配中的进一步考虑中去除光谱(例如从确定下文描述的“片段离子总和”中去除，并且因此从定量去卷积中去除报告离子丰度)。作为基于一系列概率评分从进一步处理中去除光谱匹配的实例，从考虑中去除具有小于阈值的最大匹配评分(超评分)并且优选地具有小于阈值数量的匹配的片段的所有光谱匹配。例如，在一个实施例中，可以去除最大超评分<2和少于3个匹配的片段离子的所有光谱匹配。

为了对质量标签报告离子的丰度进行定量去卷积，对于每个匹配的库光谱(即每个匹配的肽)，确定DIA光谱中的匹配的(即结构特异性)片段离子的强度总和(本文中本称为“片段离子总和”)。此总和，优选地包含分子离子强度，表示所述肽的(总)肽丰度。因此，所述方法包括确定每个发现的肽的丰度，所述丰度由光谱库中的与通过DIA获取的一个或多个MS2光谱相匹配的MS2质谱表示，如步骤112所示。此丰度是通过将通过DIA获取的MS2光谱中的片段离子的匹配峰的强度相加来确定的。优选地，计算强度总和包括计算在定义的保留时间间隔内的DIA MS2光谱中的片段离子的匹配峰的强度总和。片段离子总和表示用于根据报告离子对肽的相对丰度进行定量去卷积的肽前体丰度。

优选地，为了对质量标签报告离子的丰度进行定量去卷积，为确定每个肽的丰度的定义的保留时间间隔确定最佳值(“最佳保留时间间隔”)，即用于确定片段离子总和。因此，所述方法优选地包括确定用于对报告离子(质量标签)丰度进行去卷积的最佳保留时间(RT)间隔(针对每个肽)的步骤。此最佳时间间隔可以以不同方式确定。

在一种方法中，确定每个(匹配的)肽的洗脱顶点，并且顶点的任一侧的多个DIAMS2光谱随后用于定量，即对报告离子的去卷积。以此方式，确定洗脱的顶点并且最佳时间间隔基于顶点(例如集中在所述顶点上)。可以以不同的方式找到顶点。在一些实施例中，找到顶点是基于为每个DIA MS2光谱计算另外的评分的。此类评分可以基于片段离子的匹配评分(例如超评分)和总强度。此类评分可以基于任何概率评分的组合。可以计算多个(通常是若干个)时间窗上的评分的滚动中值。例如，在一个实施例中，首先可以基于以下公式计算多个(通常是若干个)时间窗上的滚动中值，如：超评分

此步骤序列可以进一步细化。例如，峰形模型，如高斯模型，可以任选地拟合每个(匹配)片段离子通过时间间隔中的(MS2光谱的)时间点的强度，并且具有相关性的片段离子，例如R

用于确定最佳RT间隔的替代方法可以用于其中多路复用样品中的第X个样品是第1到第(X-1)个单独样品的池的实施例中。对最佳RT的确定包括在肽的色谱洗脱峰内选择保留时间(RT)间隔，所述间隔含有所有肽的(匹配的)结构特异性片段离子的强度(丰度)总和与合并样品的质量标签通道中的报告离子的丰度之间的最佳相关性。因此，首先，对于每个经鉴定的肽，在肽的色谱峰洗脱的RT窗口内，确定每个DIA MS2光谱的所有序列特异性片段的总和。然后，计算所述总和与RT窗口内的多个时间间隔中的每个时间间隔的第X个质量标签通道(即合并样品)中的报告离子的丰度之间的相关性，优选地线性相关性，如皮尔逊(Pearson)相关性，并且间隔(含有至少3个连续的MS2光谱)被选择，以提供最高的相关性。然后使用所选间隔计算片段离子总和(如上文所描述的)。

根据每个DIA MS2质谱，可以确定质量标签报告离子的丰度(强度)，如图2的步骤114所示。从而针对DIA MS2光谱确定每个报告离子的丰度，优选地针对每个DIA MS2光谱确定每个报告离子的丰度。优选地，相同的DIA MS2光谱用于报告离子丰度，所述报告离子丰度用于对片段离子的匹配的峰的强度求和以计算肽丰度。优选地，从光谱中提取每个报告离子的丰度作为预期单同位素报告离子质量周围的窄窗口(例如±0.003m/z单位(Th)窗口)中的最强峰。

报告离子的丰度可以基于肽的所确定的丰度(来自每个肽的片段离子总和)进行去卷积，如步骤116所示。这使得能够确定每个含肽的样品中的每个肽的相对丰度。这种对单独含肽的样品中的肽丰度的定量是分析的期望结果。本公开可以进一步包括根据肽鉴定而鉴定蛋白质和/或根据肽丰度确定蛋白质丰度的步骤。因此，可以对来自共同碎裂的肽对MS2光谱中的报告离子丰度的单独贡献进行去卷积。因此，本公开能够将每个MS2光谱中的总(嵌合)报告离子丰度去卷积为由多个共同碎裂的肽中的每个共同碎裂的肽产生的报告离子丰度。具体地，从DIA数据中的报告离子去卷积的肽丰度对于单细胞蛋白质组学(SCP)目的而言足够准确。例如，从报告离子去卷积的肽丰度足够准确，可用于细胞亚群分化。可以将这些去卷积的丰度例如存储在计算机存储介质和/或例如以用户可读的形式输出，如在视频显示单元上。

在优选的实施例中，报告离子的丰度在数学上被去卷积。例如，一组线性方程用于对报告离子的丰度进行去卷积。可以构建和求解所述一组线性方程以找到多路复用样品的含肽的样品中的每个(匹配的)肽的相对丰度。线性方程可以使用矩阵求解。线性代数基于以下原理：给定报告离子的丰度(表示含肽的样品中的给定含肽的样品中的所有肽的丰度)可以表示为给定保留时间下给定含肽的样品中的每个肽的丰度的线性组合。进而，给定样品中的每个肽在给定保留时间时的丰度可以表示为所有样品(即所有质量标签(已通过本文所描述的方法确定))的肽的(总)丰度，乘以给定样品中的肽的相对丰度或分数丰度(即给定样品中的肽的丰度相对于其它样品中的丰度)。给定样品中的肽的相对丰度或分数丰度因此可以通过对方程求解从报告离子丰度去卷积。因此，在优选的实施例中，每个线性方程使含肽的样品之一的报告离子的丰度与所述含肽的样品中的每个肽的丰度的线性组合(在给定的保留时间)相关，其中所述样品中的每个肽的丰度表示为所有质量标签(即在所有含肽的样品中)的肽的(总)丰度，乘以所述含肽的样品中的肽的相对丰度。每个报告离子的丰度可以根据DIA MS2光谱确定，即针对每个保留时间。所有质量标签，即在所有含肽的样品中的每个肽的(总)丰度同样可以从光谱(如所描述的片段离子总和)还针对每个保留时间确定。因此，可以求解方程以找出每个含肽的样品(报告离子)中的每个肽的相对丰度。实际上，对于包括产生相应报告离子的多个不同标签的多路复用样品，每个方程可以使多个相应报告离子在相应保留时间时的丰度与(匹配的)肽的(总)丰度(即所有含肽的样品中的(匹配的)肽的丰度)的线性组合相关。

方程1a、1b和1c中示出了构建此类线性方程系统的简单实例，对于多路复用样品中的单个串联质量标签通道126(m/z 126)，其中两个肽A和B共同洗脱并且在DIA MS2扫描中被共同隔离和碎裂)：

TMT126(t1)＝pepA(t1)*TMT126(A)+pepB(t1)*TMT126(B) (1a)

TMT126(t2)＝pepA(t2)*TMT126(A)+pepB(t2)*TMT126(B) (1b)

TMT126(t3)＝pepA(t3)*TMT126(A)+pepB(t3)*TMT126(B) (1c)

其中：

TMT126(t1)是126质量标签报告离子在保留时间t1处的丰度；pepA(t1)是肽A在时间保留t1处的(总)丰度；pepB(t1)是肽B在时间保留t1处的(总)丰度；TMT126(A)是用126质量标签进行标记的样品中的肽A的相对丰度或分数丰度；TMT126(B)是用126质量标签进行标记的样品中的肽B的相对丰度或分数丰度；并且t2和t3分别是指保留时间t2和t3。

在特定实施例中，多个报告离子从分别被多路复用的质量标记的样品中测量并且这些报告离子的丰度被去卷积。可以为每个相应的保留时间构建单独的线性方程。每个方程使报告离子在相应保留时间时的丰度与所有质量标签(即所有含肽的样品)的(匹配)肽在相应保留时间时的(总)丰度的线性组合相关(等同)。所有质量标签的每个肽的(总)丰度可以表示为每个含肽的样品中的肽的丰度的线性组合。因此，每个方程使报告离子的所确定的丰度与含肽的样品中的每个含肽的样品中的肽在相应保留时间时的丰度的线性组合相关(等同)。对于每个样品，每个样品中的每个的肽的丰度可以表示为所有样品中的肽的所确定的(总)丰度乘以所述样品中的肽的相对丰度或分数丰度。

因此，对报告离子的丰度的去卷积可以包括使用相应报告离子的所确定的丰度和在多个保留时间的对应保留时间时的生物分子的所确定总丰度来确定每个含生物分子的样品中的每个匹配的生物分子的相对丰度或分数丰度。

通常，可以为N个肽构建一组M个线性方程(N通常<10,000；M＝DIA MS2扫描次数；M≥N*X，其中X是MS2扫描次数(对于特定DIA窗口)，其中每个肽具有X个单独的组分(因此，N个肽有X个独立参数，因此总共有X*N个独立参数)。每个方程将报告离子之一的丰度与每个肽的总丰度(如根据每个肽的片段特异性离子总和确定的)联系起来。

根据一些优选的实施例，可以通过构造两个矩阵来求解具有线性代数的去卷积。第一矩阵包括所有报告离子丰度(强度)作为列(即每个报告离子在矩阵的单独列中具有其丰度)和所有DIA光谱保留时间作为行(即每个保留时间是单独的行)。第二矩阵包括所有(总)肽丰度作为列(即每个肽在矩阵的单独列中具有其丰度)和所有DIA光谱保留时间作为行(即每个保留时间是单独的行)。例如，在上文的简化情况下，对于单个TMT通道126和两个肽A和B，线性方程1a、1b和1c可以以矩阵形式书写：

第一矩阵

包括报告离子丰度作为列(单列，因为有单个TMT通道)和DIA光谱保留时间作为行。

第二矩阵

包括肽丰度作为单独的列和DIA光谱保留时间作为行。

对矩阵代数求解找到第三(最终)矩阵的值

其给出了TMT通道126中肽A和B的去卷积的相对丰度。

此类矩阵的另一个简化实例在表1中以单个TMT通道的示意图数据，并且以三个肽A、B和C示出。

两个TMT通道126和127以及两个肽A和B的简化实例需要找到四个参数：TMT126(A)，其是用126质量标签进行标记的样品中的肽A的相对丰度或分数丰度；TMT126(B)，用126质量标签进行标记的样品中的肽B的相对丰度或分数丰度；TMT127(A)，用127质量标签进行标记的样品中的肽A的相对丰度或分数丰度；以及TMT127(B)，用127质量标签进行标记的样品中的肽B的相对丰度或分数丰度。这四个参数需要四个(或更多个)方程才能找到其值，所述值可以用矩阵表示为：

从上文可以看出，在优选的实施例中，从报告离子的丰度对每个含肽的样品中的肽的相对丰度进行去卷积包括对矩阵求解，例如对线性方程求解。在优选的实施例中，去卷积包括构造矩阵，其中第一矩阵(M1)包括所述相应报告离子的所确定的丰度作为列，其中所述保留时间对应于行，并且第二矩阵(M2)包括所述(相应)匹配的肽的所确定的总丰度作为列，其中所述保留时间对应于行。第三矩阵(M3)包括每个含肽的样品中的所述肽的所述相对丰度。所述第三矩阵可以包括每个含肽的样品中的所述肽的所述相对丰度作为列，其中所述(相应)肽对应于行。通过对公式M1＝M2*M3求解，可以找到每个含肽的样品中的肽的相对丰度。

为了对嵌合报告离子丰度进行去卷积，可以使用最小二乘回归。在一个实施例中，已使用有界变量最小二乘算法的Stark-Parker实施方案(Stark,P.B.和Parker,R.L.有界变量最小二乘法：算法和应用(Bounded-Variable Least-Squares:an Algorithm andApplications.)

参考图3提供了所述方法的图示。6重TMT标记的多路复用样品通过LC-MS进行分析。同位素峰簇通过质谱图中的重叠洗脱曲线进行鉴定(RT对m/z)。在洗脱期间的特定DIA隔离窗口202中，两种不同的肽A和B被共同隔离和共同碎裂。从共同碎裂的嵌合DIA MS2光谱204中，观察到表示单独样品中的肽丰度的六个报告离子(标记为c1、c2、c3、t1、t2、t3)，但每个观察到的报告离子丰度(强度)206是来自肽A和肽B的报告离子的聚集体。期望确定的是每个样品中的肽A和B的单独丰度。这些可以使用窄隔离窗口找到，如DDA扫描中使用的那样，以单独隔离每个肽。示出了肽A的报告离子丰度208，示出了肽B的报告离子丰度210。可以看出，单独肽的报告离子丰度208和210的组合给出了共同碎裂的DIA光谱的报告离子丰度206。

图4A示出了肽A和B的所计算的洗脱曲线。如在洗脱曲线上所示的时间t1、t2和t3处，肽A和肽B对总报告离子丰度的相对贡献不同。在时间t1处，肽A和B的丰度大约相同，但在时间t2和t3处，肽B的丰度更高，并且因此对总报告离子丰度的贡献相对较高(由每个时间时的报告离子丰度的绘图示出)。来自每个洗脱肽的肽丰度对报告离子丰度的此类时变贡献用于构建上文描述的一般形式的线性方程系统，例如如上文方程1a、1b和1c所示。通过根据DIA MS2光谱确定每个保留时间时每个报告离子的丰度，连同确定每个保留时间时每个肽的(总)丰度一起，可以求解线性方程以对每个报告离子丰度进行去卷积并且因此确定每个样品中的每个肽的相对丰度。图4B示出了去卷积的TMT报告离子丰度(强度)反映了真实的TMT丰度。图4B右侧上的TMT通道c1、c2、c3、t1、t2、t3的一组报告离子丰度适用于肽A，左侧上的一组报告离子丰度适用于肽B。在每个TMT通道中，示出了两种丰度。每个TMT通道中的左侧丰度是反映样品中的肽的相对丰度的真实TMT强度，并且右侧丰度是通过求解线性方程得到的去卷积的TMT强度。两种丰度，真实的和去卷积的，是相同的。

参考图5A和5B示出了使用线性方程去卷积的更复杂的计算机模拟实例。图5A示出了50种标记肽的模拟色谱图(强度对保留时间，任意单位)。DIA MS2分析以3秒(秒)循环模拟，即每3秒扫描一次每个窗口。对于101个数据点的5分钟RT窗口，每个肽采样11个数据点。通过求解线性方程应用去卷积方法，在每个肽的每个TMT通道中，去卷积的TMT丰度值给出了真实的TMT丰度值，如图5B中的绘图所示。

在一些实施例中，可以采用不同的方法对报告离子丰度进行去卷积。例如，此类方法适用于所描述的实施例，在所述实施例中，使用一组X个质量标签(例如X为2到16)制备多路复用样品，并且在多路复用样品中的用标签1到(X-1)标记的样品是单独肽样品，通常由对单独蛋白质样品的消化形成，并且多路复用样品中的第X个样品是单独样品1到(X-1)的池。单独肽样品可以是单细胞蛋白质组的消化物。在单细胞蛋白质组的情况下，第X个(合并)样品可以稀释到相当于N个细胞(N≤X)。例如，在TMT-10(即10重TMT集)多路复用样品中，TMT通道中的9个通道可以表示单独样品，如单细胞蛋白质组，并且第10个通道可以表示其它9个样品的合并样品，从而反映了大量蛋白质组。将第10个TMT通道稀释到相当于N个细胞(N≤10)。假设单独报告离子的丰度与肽特异性片段离子的丰度成线性比例。对于每个肽，肽的色谱峰(例如其上升斜率)可以根据(DIA)MS2光谱中的肽特异性片段离子的丰度鉴定。然后，对所述肽的报告离子丰度的去卷积可以通过拟合线性函数来执行，所述线性函数使单独报告离子的丰度与第X个(例如第10个)样品(即合并样品)中的报告离子的丰度相关。因此，可以将线性函数拟合到绘图中，其中“y”轴是单独报告离子的丰度，“x”轴是第X个标签通道(合并样品)中的报告离子的丰度。相应单独报告离子的线性相关的斜率表示相应单独样品中的肽的相对丰度。优选地通过忽略交点来确定斜率，由此去除与相同RT间隔中的其它肽重叠的大部分信号。因此，对所述报告离子的所述丰度进行去卷积可以包括在每个肽的基于所述肽的所确定的丰度的洗脱(保留)时间内，拟合线性函数，所述线性函数使单独报告离子的丰度与所述合并样品的报告离子的丰度相关。用于对报告离子丰度进行去卷积的此方法比使用线性方程和矩阵系统更简单，即数学上的复杂性更低，但准确度较低，尤其是对于低丰度肽。然而，其仍然适用于许多单细胞蛋白质组学(SCP)目的，其中从报告离子去卷积的肽丰度足够准确，可用于细胞亚群分化。

本公开使得能够根据DIA数据中的报告离子确定单独含肽的样品中的单独肽的相对丰度。根据肽的丰度，可以确定肽源自其的蛋白质的丰度。具体地，肽或蛋白质丰度对于单细胞蛋白质组学中的细胞亚群分化来说足够准确。这允许鉴定样品之间的肽或蛋白质差异。

在特定实施方案中，本公开的方法可以进一步包括根据所确定的肽或蛋白质变异确定生物学状态。例如，可以知道一个样品或一组样品来自健康样本，而另一个样品或一组样品组来自患病样本。在另一种情况下，可以知道一个样品或一组样品来自男性样本，而另一个样品或一组样品组来自女性样本。因此，所确定的肽变异可以用于确定给定样品的生物学状态(例如健康或患病；男性或女性等)。因此，所述方法还可以包括根据所确定的变化来评估疾病状态。所述方法还可以包括找到疾病的标志物(如随疾病状态变化的肽或蛋白质)。

从前述可以看出，根据本公开的用于分析生物分子样品的质谱方法的实施例是在来自多路复用样品的质谱(数据非依赖性采集)中对质量标签(即报告离子)的质谱数据进行去卷积的方法。

根据本公开，可以使用在控制器控制下的质谱仪，其中所述控制器被配置成使得所述质谱仪可操作以执行根据本公开的方法的步骤。所述质谱仪可以包括：电离源，所述电离源用于产生由色谱装置提供的所述生物分子的前体离子；质量选择器，所述质量选择器用于选择所述前体离子的质量范围；碎裂装置，所述碎裂装置用于使由所述质量选择器选择的前体离子碎裂以产生片段离子；质量分析器，所述质量分析器用于对所述前体离子和所述片段离子进行质量分析；以及控制器，所述控制器被配置成使所述质谱仪执行根据本公开的方法的质谱方法。所述控制器优选地包括计算机。然后优选地提供了一种计算机程序，所述计算机程序在由所述计算机的一个或多个处理器执行时使所述一个或多个处理器执行根据本公开的方法，通常通过控制所述质谱仪执行根据本文中的本公开的质谱方法。所述计算机程序可以存储在计算机可读介质上以供处理器执行，例如存储在闪存驱动器、硬盘驱动器等上。

根据本公开，可以使用任何合适类型的质谱仪，但优选地使用能够进行高分辨率质谱法和精确质量测量的质谱仪。使用高分辨率质谱法，可以测量生物分子和其片段的精确质量。可以使用任何能够通过DDA和DIA用LC-MS进行质量分析的质谱仪。优选的实例包含包括以下任何类型的质量分析器的质谱仪：轨道静电阱质量分析器(例如来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的Orbitrap

适用于执行本公开的方法的Orbitrap

质谱仪300进一步包括：源注入光学器件310，前体离子通过所述源注入光学器件。源注入光学器件310包括：毛细转移管308、电动离子漏斗312；透镜314；注入扁极(flatapole)316和弯曲的离子导向器318。四极质量选择装置(质量过滤器)320允许在比来自电离源的前体离子的全质量范围更窄的可变质量隔离窗口中选择前体离子的质量范围。四极质量选择装置320也可以被操作以传输全质量范围的前体离子，例如用于调查扫描(在MS1模式下)。被配置成施加轴向捕获电压的弯曲线性离子阱(C-阱)330累积离子以注入到Orbitrap

可以使用计算机执行许多特征或步骤。具体地，许多步骤可以通过操作安装在计算机中的专用数据处理软件来实现。具体地，可以使用计算机执行以下步骤：形成光谱库；将获取的质谱中的峰与光谱库中的峰进行匹配以找到光谱匹配；根据所获取的光谱确定丰度；以及对报告离子的丰度进行去卷积。计算机因此优选地包括：库形成单元，所述库形成单元被配置成形成光谱库；匹配单元，所述匹配单元被配置成将获取的质谱中的峰与光谱库中的峰进行匹配以找到光谱匹配；丰度单元，所述丰度单元被配置成根据获取的光谱确定丰度；以及去卷积单元，所述去卷积单元被配置成对报告离子的丰度进行去卷积。库形成单元、匹配单元、丰度单元和去卷积单元中的每一个可以以数据处理软件的程序模块的形式提供。

在实施例中，计算机可以包括：存储介质、存储器、处理器、一个或多个接口(如用户输出接口、用户输入接口和网络接口)，其例如通过一个或多个通信总线连接在一起。

存储介质可以是任何形式的非易失性数据存储装置，如硬盘驱动器、磁盘、光盘、ROM等中的一种或多种。存储介质可以存储一个或多个计算机程序，包含根据本公开的程序。

存储器可以是适合于存储数据和/或计算机程序的任何随机存取存储器(存储单元或易失性存储介质)。

处理器可以是适合于执行一个或多个计算机程序(如存储在存储介质上和/或存储器中的那些)的任何数据处理单元，其中的一些可以包含根据本公开的实施例的一个或多个计算机程序或在由所述处理器执行时，使所述处理器执行根据本公开的实施例的方法的计算机程序。处理器可以包括单个数据处理单元或并联、单独或与彼此合作操作的多个数据处理单元。处理器在实施用于执行本公开的实施例的数据处理操作时可将数据存储到存储介质和/或存储器，和/或从其中读取数据。

可以提供接口，所述接口为用于在计算机与计算机外部或可从计算机去除的装置之间提供接口的任何单元。外部装置可以是数据存储装置，例如，光盘、磁盘、固态存储装置等中的一个或多个。接口因此可以根据从处理器接收的一个或多个命令而从外部装置存取数据，或将数据提供到外部装置，或与外部装置介接。

用户输入接口可以被布置成从用户或操作者接收输入。用户可以通过与用户输入接口连接或通信的系统的一个或多个输入装置382如鼠标(或其它指向装置)和/或键盘提供此输入。然而，应当了解，用户可以通过一个或多个另外或替代的输入装置(如触摸屏幕)向计算机提供输入。计算机可以将通过用户输入接口从输入装置接收的输入存储在存储器中供处理器随后访问和处理，或者可以将其直接传送到处理器，以便处理器能够对用户输入相应地作出响应。

用户输出接口可以被布置成通过输出装置向用户或操作者提供图形/视觉输出。如此，处理器可以被布置成发指令给用户输出接口以形成表示期望图形输出的图像/视频信号，并且将此信号提供到连接于用户输出接口的视频显示单元(VDU)384，如监视器(或显示屏或显示单元)。

网络接口可以被布置成向计算机提供从一个或多个数据通信网络下载数据和/或将数据上传到一个或多个数据通信网络的功能。

应当了解，上文所描述的计算机系统的架构仅为示例性的，并且可以使用具有不同架构的其它计算机系统(例如，具有较少组件或具有另外和/或替代组件)。作为实例，计算机可以包括以下中的一个或多个：个人计算机；服务器计算机；膝上型计算机；等。

实例

对含有标准蛋白质与以已知比例掺入的一些其它蛋白质的混合物的真实样品执行本公开的方法。样品含有15种蛋白质：其中11种在所有样品中的丰度相同，4种在不同样品中以不同的丰度掺入。样品被消化、用TMT10标记、多路复用并通过LC-MS/MS进行分析。由此产生了具有不同掺入水平的五种条件/处理。五种条件/处理中的每一个都用2个TMT通过标记。掺入水平为：1:4、1:2、1:1、2:1和4:1，其中1:1是对照。

将多路复用样品加载在捕获色谱柱(Acclaim

以正极性进行操作的Orbitrap

为了检查DIA运行与DDA运行之间的色谱稳定性，通过应用线性相关模型比较通过Dinosaur工具(Teleman等人；《蛋白组学研究杂志》15,2143–2151(2016))提取的MS1特征并比对保留时间。对于DIA和DDA文件，TMT报告离子被提取为预期的单同位素报告质量周围±0.003Th窗口中的最高强度峰。

在R中读取DDA MS/MS数据之后，所有非特异性片段都被去除。这包含TMT报告离子、属于R或K的y1前体片段、剩余的前体离子和互补的TMT离子。应用Yuan等人公布的算法对光谱进行去同位素(《生物信息学进展》2011,(2011).)。剩余的片段被装仓到40个具有相同m/z分布的组(m/z范围从320到1500)中，确定每个仓中强度最高的片段离子，并且保留其中15个最强的片段离子，因为其最有可能是前体特异性的。这导致可鉴定和不可鉴定的光谱的“前体特异性片段”数量相同，这是无偏置下游分析所需的。使用MaxQuant进行肽鉴定。从获取的DDA MS2扫描(包含未经鉴定的扫描)中提取前体特异性片段离子以形成光谱库。除了样品中已知的15种蛋白质外，MaxQuant还发现了数百种低丰度的污染蛋白质。

为去除重复的光谱库条目，将所有光谱(在2分钟保留时间窗中并且前体离子m/z差异为10

然后执行DIA MS/MS(MS2)事件与库光谱的匹配。基于校正后的保留时间，在3分钟窗口内将每个库光谱与DIA光谱进行匹配。片段离子匹配有10ppm公差；如果在DIA光谱中鉴定出多个片段离子，则考虑质量误差最低的片段离子。为了评估真正匹配的概率，针对每个库光谱，在每个时间点时计算了一系列评分，其中包含“超评分”、所有片段离子的总和(总和-强度)，以及匹配的片段离子的数量。为了进一步处理，去除了最大超评分小于2和小于3个匹配的片段离子的所有光谱。

过渡细化按以下方式进行。首先，基于以下公式计算在3个窗口内的滚动中值：“超评分”

为了对DIA光谱中的嵌合TMT丰度进行去卷积，对如上文描述的线性方程系统求解，为此构建了两个矩阵。第一矩阵含有每个TMT报告离子强度作为列和每个光谱保留时间作为行(在预处理步骤中提取)。第二矩阵含有每个前体强度作为列和每个光谱保留时间作为行(如之前所描述的提取)。为了对嵌合TMT强度进行去卷积，使用了有界变量最小二乘算法的Stark-Parker实施方案(Stark,P.B.和Parker,R.L.有界变量最小二乘法：算法和应用)。边界被设置为0(以防前体未被标记并且可能是污染物)并且下边界和上边界分别无穷大。

去卷积的结果在图7中展示，用于对已知背景前体，即源自以相同数量添加为背景的11种蛋白质的那些背景前体进行定量。其丰度应跨5个条件而恒定。中央散点图示出了相对于log2相较于对照的倍数变化(DIA)而绘制的log2相较于对照的倍数变化(DDA)。上图和右图分别是沿x和y的倍数变化(fc)的密度图。基于密度图，基于DIA和DDA的定量产生类似的定量模式。对于背景前体，大多数片段的丰度没有示出任何变化。

去卷积的结果在图8中展示，用于对已知的“掺入”前体，即源自在每个样品中作为不同数量添加的4种蛋白质的那些前体进行定量。根据掺入比率，其丰度应集群在5个不同的簇中。基于散点图，DIA去卷积算法能够以与基于DDA的定量相比的准确度对肽片段进行定量。进一步的结果示出于图9中，所述图示出了来自使用本公开的方法的DDA分析和来自DIA分析的15种蛋白质(2个复制)的肽的倍数变化的变异系数(CV)图，标记为DIADEM(具有多路复用的去卷积的数据非依赖性采集)。左侧的CV图是已知的背景肽，右侧的CV图是掺入的肽。使用本公开的方法进行定量给出比DDA分析更低的CV。图10示出了测得的掺入丰度与已知丰度比的比较。掺入肽的所有丰度用具有已知相对丰度(“基本事实”)的线性回归(y＝ax+b)拟合。计算每个肽的相关系数R。本公开的方法和DDA的R

术语质量和m/z在本文中可互换使用，并且因此对一个的引用应被解释为包含对另一个的引用。类似地，术语扫描(scan)(或扫描(scans))和光谱(spectrum)(或光谱(spectra))在本文中可互换使用。同样，在质谱的上下文中的术语强度(intensity)(或强度(intensities))和丰度(abundance)(或丰度(abundances))可互换使用。

在本公开中描述的执行步骤的顺序不严格限于所描述的那些，使得可以以另一顺序执行步骤，除非上下文明确或暗示以其它方式指示。也就是说，在方法或过程不依赖于本文所阐述的特定步骤顺序的程度上，所述方法或过程不限于所描述的特定步骤序列。

如本文所用，包含在权利要求书中，除非上下文另外指示，否则本文中的术语的单数形式应被解释为包含复数形式，并且反之亦然。例如，除非上下文另外指示，否则本文中的单数参考物，如“一(a)”或“一个(an)”意指“一或多个”。

在整个本说明书的描述和权利要求书中，词语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”以及所述词语的变化形式(例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”等)意指“包括但不限于”，并且不意图(并且并不)排除其它成分。

应当了解，可以对本公开的上述实施例作出变化，但这些变化仍落入由权利要求所限定的本公开的范围内。除非另外说明，否则本说明书中所公开的每个特征都可以替换为用于相同、同等或类似目的的替代特征。因此，除非另外说明，否则所公开的每个特征仅是一系列的等价或相似的属性特征的一个示例。

本文提供的任何和所有实例或示例性语言(“例如(for instance)”、“如”、“例如(for example)”以及类似语言)的使用旨在仅更好地说明本公开，并且除非另外要求，否则并不指示对本公开范围的限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示实践本公开所必需的任何未要求的要素。