一种制备珊瑚状SERS活性基底的方法、珊瑚状SERS活性基底及其应用

摘要

本发明涉及表面增强拉曼散射基底技术领域，公开了一种制备珊瑚状SERS活性基底的方法、珊瑚状SERS活性基底及其应用。本发明提供的方法制备得到的珊瑚状SERS活性基底具有很高SERS增强活性，能够用于食用色素的快速检测，并且该活性基底还具有成本低廉的优点；同时本发明提供的珊瑚状SERS活性基底便于操作更具有普适性。本发明提供的制备珊瑚状SERS活性基底的方法能够将纳米粒子制备流程化繁为简；并且能够实现检测现场的原位制备，无需储存和运输；同时该制备方法还具有重现性高、操作方便、成本低廉的优点，在现场快速检测中具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及表面增强拉曼散射基底技术领域，具体地，涉及一种制备珊 瑚状SERS活性基底的方法、珊瑚状SERS活性基底及其应用。

背景技术

近年来，随着消费者对食品安全和健康饮食的重视，食用色素的安全性 饱受争议，尽管食用色素在食品中加入的剂量微小，但人们每天都在摄入含 有各种各样含有不同色素的食物，这些色素在人体内的长期摄入和叠加摄入 都会在人体内形成积累，造成潜在的风险。

有研究表明色素是儿童产生过敏反应、患儿童多动症、影响儿童的生殖 系统的发育的主要原因之一，同时会损害海马神经的增值和抑制红细胞中酶 的活性，还会引起腹泻、中毒等症状。但这些色素色泽鲜艳、性质稳定、价 格低廉，因此仍然被广大商家喜爱并使用，并且近年来滥用食用色素的问题 依旧凸显。

因此建立一种便捷、快速、高效、灵敏的准确检测食用色素的方法是十 分重要的。而表面增强拉曼散射(SERS)就是具备以上优点的一种检测方 法。

SERS分析法由于其成本低、灵敏度高、操作简单，可进行现场、快速、 无损检测等优点，成为了一种拥有无限潜力的痕量检测方法。但目前的SERS 分析通常需要进行增强基底的预制备，而该过程普遍存在以下诸多问题：

纳米颗粒制备过程十分繁琐，比较费时，制备的不同批次的纳米颗粒的 均匀度和稳定性存在较大的差异；纳米颗粒在经过多次处理后极易出现聚沉 现象，并且储存过程中也容易发生结构和分散度的改变；增强基底的制备容 易产生咖啡环效应，从而导致其均匀度难以保证。

上述问题都将大大影响SERS分析法的重现性和可靠性，因此开发一种 能够现场快速制备的SERS基底用于目标物的快速检测具有很高的实用价值。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有制备SERS基底的方法存在的制备过程繁 琐、耗时长且制备得到的SERS基底的均匀度和稳定性均不佳的缺陷。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种制备珊瑚状SERS活性 基底的方法，该方法包括：

在保护剂和溶剂I的存在下，将硝酸银与铜片进行原位还原反应，得到 所述珊瑚状SERS活性基底；

所述保护剂为鱼精DNA(FSDNA)；所述溶剂I为水。

本发明的第二方面提供一种由前述第一方面中所述的方法制备得到的 珊瑚状SERS活性基底。

本发明的第三方面提供一种前述第二方面中所述的珊瑚状SERS活性基 底在检测食用色素中的应用。

本发明的第四方面提供一种测定食用色素含量的方法，该方法包括：

(1)在溶剂II的存在下，将半胱胺盐酸盐(CA)与食用色素进行混合， 得到混合物I；

(2)将所述混合物I与珊瑚状SERS活性基底进行接触反应；

(3)采用SERS光谱法建立标准曲线，以测定所述食用色素的含量；

其中，所述食用色素选自诱惑红色素、亮蓝色素、日落黄色素中的至少 一种；

所述珊瑚状SERS活性基底为前述第二方面中所述的珊瑚状SERS活性 基底。

相对于现有技术，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明提供的珊瑚状SERS活性基底中的银纳米颗粒呈珊瑚状均 匀地分布于铜片表面，其中的珊瑚枝杈为凹凸不平的粗糙结构，且枝杈之间 间距较小，能够发生强等离激元耦合，提供大量的SERS“热点”，从而具 有很高SERS增强活性，能够用于食用色素的快速检测，并且该活性基底还 具有成本低廉的优点；同时本发明提供的珊瑚状SERS活性基底便于操作更 具有普适性；

(2)本发明提供的制备珊瑚状SERS活性基底的方法能够将纳米粒子 制备流程化繁为简，从而极大地减少制备得到的银纳米颗粒被氧化的时间； 并且能够实现检测现场的原位制备，无需储存和运输，进而能够克服银纳米 颗粒基底易被氧化的困难；同时该制备方法还具有重现性高、操作方便、成 本低廉的优点，在现场快速检测中具有良好的应用前景；

(3)本发明提供的制备珊瑚状SERS活性基底的方法利用Ag

(4)本发明提供的测定食用色素含量的方法利用CA能够与磺酸基生 成氢键的特性，只捕获带有磺酸基的色素(弱亲和力分子)进行SERS分析， 从而极大地提高检测的灵敏度和选择性，为这类弱亲和力分子的定性定量测 定提供了新思路。

附图说明

图1是本发明提供的一种优选的SERS活性基底制备以及诱惑红色素检 测流程示意图；

图2是本发明提供的证明铜片对SERS活性基底增强能力的数据图；其 中，图2a为将银纳米颗粒从铜片上剥离粘贴至玻璃片上的实物图，图2b为 不同SERS活性基底的拉曼光谱变化图，图2c为不同SERS活性基底在 634cm

图3是本发明提供的不同种类保护剂制备得到的SERS活性基底的实物 图、SEM以及mapping图；其中，图3a为FSDNA制备得到的SERS活性 基底的实物图、SEM以及mapping图，图3b为十六烷基三甲基氯化铵制备 得到的SERS活性基底的实物图、SEM以及mapping图，图3c为聚乙烯吡 咯烷酮制备得到的SERS活性基底的实物图、SEM以及mapping图，图3d 为牛血清白蛋白制备得到的SERS活性基底的实物图、SEM以及mapping 图；

图4是本发明提供的不同保护剂用量、不同硝酸银用量以及不同原位还 原反应时间制备得到的SERS活性基底的拉曼光谱图以及在634cm

图5是本发明提供的一种优选的采用不同半胱胺盐酸盐用量、不同第一 反应时间、不同pH值以及不同接触反应时间检测诱惑红色素的拉曼光谱图 以及在1267cm

图6是本发明提供的证明SERS活性基底均匀度的数据图；其中，图6a 为十个不同批次的SERS活性基底中随机3个点中634cm

图7是本发明提供的计算SERS活性基底增强因子的拉曼光谱图；其中， 图7a为含0.1mol/L的4-MBPA水溶液的SERS活性基底G1的拉曼光谱， 图7b为含0.01μmol/L的4-MBPA水溶液的SERS活性基底G1的拉曼光谱；

图8是本发明提供的方法检测不同食用色素的SERS强度误差棒图；

图9是本发明提供的方法检测不同含量食用色素的拉曼光谱图以及标准 线性曲线图；其中，图9a1和图9a2分别为检测不同含量亮蓝色素的拉曼光 谱图和标准线性曲线图，图9b1和图9b2分别为检测不同含量诱惑红色素的 拉曼光谱图和标准线性曲线图，图9c1和图9c2检测不同含量日落黄色素的 拉曼光谱图和标准线性曲线图；

图10是本发明提供的方法检测不同实际样品中食用色素的拉曼光谱图；

图11是本发明提供的在人工尿液中对食用色素进行加标回收的拉曼光 谱图；其中，图11a为在人工尿液中对亮蓝色素进行加标回收的拉曼光谱图， 图11b为在人工尿液中对日落黄色素进行加标回收的拉曼光谱图，图11c为 在人工尿液中对诱惑红色素进行加标回收的拉曼光谱图；

图12是本发明提供的不同保护剂制备得到的SERS活性基底上的银纳 米颗粒的长度和直径分布图；其中，图12a1为牛血清白蛋白制备得到的SERS 活性基底上的银纳米颗粒的直径分布图，图12a2为牛血清白蛋白制备得到 的SERS活性基底上的银纳米颗粒的长度分布图；图12b1为十六烷基三甲 基氯化铵制备得到的SERS活性基底上的银纳米颗粒的直径分布图，图12b2 为十六烷基三甲基氯化铵制备得到的SERS活性基底上的银纳米颗粒的长度 分布图；图12c1为FSDNA制备得到的SERS活性基底上的银纳米颗粒的直 径分布图，图12c2为FSDNA制备得到的SERS活性基底上的银纳米颗粒的 长度分布图；图12d1为聚乙烯吡咯烷酮制备得到的SERS活性基底上的银 纳米颗粒的直径分布图，图12d2为聚乙烯吡咯烷酮制备得到的SERS活性 基底上的银纳米颗粒的长度分布图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这 些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各 个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点 值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视 为在本文中具体公开。

如前所述，本发明的第一方面提供了一种制备珊瑚状SERS活性基底的 方法，该方法包括：

在保护剂和溶剂I的存在下，将硝酸银与铜片进行原位还原反应，得到 所述珊瑚状SERS活性基底；

所述保护剂为鱼精DNA；所述溶剂I为水。

本发明中，SERS活性基底中的银纳米颗粒呈珊瑚状均匀地分布于铜片 表面，其中的珊瑚枝杈为凹凸不平的粗糙结构，且枝杈之间间距较小，能够 发生强等离激元耦合，提供大量的SERS“热点”，从而具有很好的SERS 增强能力。本发明的发明人通过研究还发现，将银纳米颗粒从铜片上剥离， 粘贴至玻璃片上，其SERS增强能力大大减弱；再将银纳米颗粒粘回铜片上， 其SERS增强能力得到恢复，具体结果见图2。

图2是本发明提供的证明铜片对SERS活性基底增强能力的数据图。从 图2中可以看出，银纳米颗粒与铜片之间亦存在等离激元耦合。

本发明中，发明人对不同种类保护剂进行了研究，具体结果见图3。

图3是本发明提供的不同种类保护剂制备得到的SERS活性基底的实物 图、SEM以及mapping图。从图3中可以看出，用FSDNA作为保护剂制备 得到的SERS活性基底相比于十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)以及牛血清白蛋白(BSA)所制备得到的SERS活性基底更 加均匀。

由于FSDNA为短链DNA，其具备大量能够预Cu

优选地，相对于100μL的所述溶剂I，所述保护剂的用量为12-75μg， 所述硝酸银的用量为3-6μmol。

更加优选地，相对于100μL的所述溶剂I，所述保护剂的用量为50-75μg， 所述硝酸银的用量为4-5μmol。该优选情况下，制备得到的珊瑚状SERS活 性基底具有更好的均匀度以及更优异的SERS增强活性。

优选地，所述原位还原反应的条件至少满足：温度为20-30℃，时间为 3-20min。

进一步优选地，所述原位还原反应的条件至少满足：温度为20-30℃， 时间为3-10min。该优选情况下，制备得到的珊瑚状SERS活性基底具有更 好的均匀度以及更优异的SERS增强活性。

本发明中，发明人对保护剂用量、硝酸银用量以及原位还原反应时间进 行了研究，具体结果见图4。

图4是本发明提供的不同保护剂用量、不同硝酸银用量以及不同原位还 原反应时间制备得到的SERS活性基底的拉曼光谱图以及在634cm

保护剂过多和硝酸银过少，会使得保护剂与Ag

本发明的制备方法还可以包括本领域内已知应用的各种后处理方法例 如洗涤、干燥等步骤。本发明对后处理的步骤并没有特别的限制。例如，本 发明可以采用先将原位还原反应结束后获得的珊瑚状SERS活性基底进行洗 涤并进行干燥。示例性地，所述干燥的条件可以为干燥温度30-50℃，干燥 时间0.1-2min。

如前所述，本发明的第二方面提供了前述第一方面中所述的方法制备得 到的珊瑚状SERS活性基底。

如前所述，本发明的第三方面提供了一种前述第二方面中所述的珊瑚状 SERS活性基底在检测食用色素中的应用。

如前所述，本发明的第四方面提供了一种测定食用色素含量的方法，该 方法包括：

(1)在溶剂II的存在下，将半胱胺盐酸盐与食用色素进行第一反应， 得到混合物I；

(2)将所述混合物I与珊瑚状SERS活性基底进行接触反应；

(3)采用SERS光谱法建立标准曲线，以测定所述食用色素的含量；

其中，所述食用色素选自诱惑红色素、亮蓝色素、日落黄色素中的至少 一种；

所述珊瑚状SERS活性基底为前述第二方面中所述的珊瑚状SERS活性 基底。

需要说明的是，本发明中对所述溶剂II的种类没有特别的要求。示例性 地，所述溶剂II可以为超纯水。所述超纯水是指既将水中的导电介质几乎完 全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水。

本发明中，发明人对半胱胺盐酸盐用量、第一反应时间、pH值以及接 触反应时间进行了研究，具体结果见图5。

图5是本发明提供的一种优选的采用不同半胱胺盐酸盐用量、不同第一 反应时间、不同pH值以及不同接触反应时间检测诱惑红色素的拉曼光谱图 以及在1267cm

适宜的CA用量和适宜的第一反应时间能够使较多的食用色素被CA捕 获；而适宜的接触反应时间能够使更多的“CA-食用色素”与SERS活性基 底形成Ag-S键从而固定在基底上；pH值过低时，游离的氢离子增多，会与 CA的氨基上的氢形成竞争，从而影响氢键的形成；pH值过高时，游离的氢 氧根增多会影响CA的氨基中近乎裸露的氢，从而影响氢键的形成。

根据一种优选的实施方式，相对于10μL的所述溶剂II，所述半胱胺盐 酸盐的用量为0.05-0.20μmol，所述食用色素的用量为0.001-0.1μg。

更加优选地，相对于10μL的所述溶剂II，所述半胱胺盐酸盐的用量为0.10-0.20μmol，所述食用色素的用量为0.01-0.1μg。该优选情况下，采用该 方法检测得到的食用色素的含量结果更准确。

优选地，所述第一反应的条件至少满足：在搅拌条件下进行，且搅拌的 转速为4000-5000rpm，时间为0.5-10min，pH值为2.30-6.20。

进一步优选地，所述第一反应的条件至少满足：在搅拌条件下进行，且 搅拌的转速为4000-5000rpm，时间为1-10min，pH值为2.30-5.30。该优选 情况下，采用该方法检测得到的食用色素的含量结果更准确。

优选地，所述接触反应的条件至少满足：温度为20-30℃，时间为1-30min。

更加优选地，所述接触反应的条件至少满足：温度为20-30℃，时间为 5-20min。该优选情况下，采用该方法检测得到的食用色素的含量结果更准 确。

以下将通过实例对本发明进行详细描述。

以下实例中，在没有特别说明的情况下，所使用的原料均为市售品。

在没有特别说明的情况下，本发明中的室温表示25±2℃。

半胱胺盐酸盐：牌号C804763，购自麦克林公司。

FSDNA：牌号D3159，购自Sigma公司。

硝酸银：分析纯，牌号10018464，购自国药公司。

CTAC：牌号A610332，购自生工生物工程公司。

PVP：牌号80154482，购自国药公司。

BSA：牌号A116563，购自阿拉丁公司。

4-MBPA：90％纯，购自Sigma公司。

诱惑红色素：牌号E107191，购自阿拉丁公司。

亮蓝色素：牌号E101979，购自阿拉丁公司。

日落黄色素：牌号S109563，购自阿拉丁公司。

赤藓红色素：牌号E107191，购自阿拉丁公司。

新红色素：牌号N886279，购自麦克林公司。

苋菜红色素：牌号A800746，购自麦克林公司。

靛蓝色素：牌号I104182，购自阿拉丁公司。

花青素色素：牌号C885847，购自麦克林公司。

姜黄色素：牌号C805205，购自麦克林公司。

胭脂红色素：牌号C805213，购自麦克林公司。

甜菜红色素：牌号R854445，购自麦克林公司。

甲醇：分析纯，购自Damas公司。

乙酸铵：分析纯，购自国药公司。

制备例1

室温下，将50μg的FSDNA、4μmol的AgNO

制备例2

本制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

FSDNA的用量为75μg，其余条件均与制备例1相同，制备得到珊瑚状 SERS活性基底G2。

制备例3

本制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

FSDNA的用量为12.5μg，其余条件均与制备例1相同，制备得到珊瑚 状SERS活性基底G3。

制备例4

本制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

AgNO

制备例5

本制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

AgNO

制备例6

本制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

原位还原反应的时间为10min，其余条件均与制备例1相同，制备得到 珊瑚状SERS活性基底G6。

制备例7

本制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

原位还原反应的时间为3min，其余条件均与制备例1相同，制备得到 珊瑚状SERS活性基底G7。

对比制备例1

本对比制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

将50μg的FSDNA替换为0.1μmol的CTAC，其余条件均与制备例1相 同，制备得到SERS活性基底DG1。

对比制备例2

本对比制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

将50μg的FSDNA替换为0.1μg的PVP，其余条件均与制备例1相同， 制备得到SERS活性基底DG2。

对比制备例3

本对比制备例采用与制备例1相同的流程进行，不同的是，本制备例中：

将50μg的FSDNA替换为0.15μg的BSA，其余条件均与制备例1相同， 制备得到SERS活性基底DG3。

为了证明本发明提供的珊瑚状SERS活性基底的均匀度，本发明制备了 十个不同批次的珊瑚状SERS活性基底，采用30mmol/L的CA作为信号分 子，与前述十个不同批次的珊瑚状SERS活性基底进行接触反应，反应10min 后于40℃下干燥20s，并随机选取3个点进行SERS检测；并在其一珊瑚状 SERS活性基底随机选取20个点进行SERS检测，具体测试结果见图6。其 中，所述SERS检测的具体步骤如下：

将干燥后的珊瑚状SERS活性基底采用便携式拉曼光谱仪(型号为 SEED3000，厂家为上海如海光电科技有限公司)进行检测，具体检测参数 为：638nm的激光，功率约为0.5mw，光谱扫描范围为200cm

图6是本发明提供的证明SERS活性基底均匀度的数据图。从图5中可 以看出，图6a中的十个不同批次的珊瑚状SERS活性基底的SERS强度的 RSD值为9.92％，图6b中的第1批次的珊瑚状SERS活性基底的SERS强 度的RSD值为9.39％，表明本发明提供的珊瑚状SERS活性基底均匀度和重 现性均好。

为了证明本发明提供的珊瑚状SERS活性基底的灵敏度，本发明分别采 用0.1mol/L的4-巯基苯硼酸水溶液(4-MBPA)和0.01μmol/L的4-巯基苯硼 酸水溶液作为探针分子测定SERS活性基底的增强因子，具体测试结果见图 7。其中，具体测定步骤同前：

EF＝(I

其中，I

I

C

C

图7是本发明提供的计算SERS活性基底增强因子的拉曼光谱图。从图 7可以看出，本发明提供的SERS活性基底的增强因子为1.96×10

测试例1

室温下，将1μg的诱惑红色素、0.10μmol的CA溶于10μL超纯水中， 用涡旋混匀仪以4000rpm的转速混匀20s后静置5min，并调节体系pH为5.22 得到混合物I，将所述混合物I滴于珊瑚状SERS活性基底G1上以进行接触 反应，反应10min后于40℃下干燥20s并进行SERS检测，具体测试结果见 图5。

测试例2

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

CA的用量为0.20μmol，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图5。

测试例3

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

CA的用量为0.05μmol，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图5。

测试例4

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

接触反应的时间为5min，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图5。

测试例5

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

接触反应的时间为20min，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图 5。

测试例6

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

静置的时间为1min，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图5。

测试例7

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

静置的时间为10min，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图5。

测试例8

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

体系的pH值为2.31，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图5。

测试例9

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

体系的pH值为6.20，其余条件均与测试例1相同，测试结果见图5。

测试例10

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

将诱惑红色素等重量替换为亮蓝色素，其余条件均与测试例1相同，测 试结果见图8。

测试例11

本测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本测试例中：

将诱惑红色素等重量替换为日落黄色素，其余条件均与测试例1相同， 测试结果见图8。

对比测试例1

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的赤藓红色素，其余条件均与测试例 1相同，测试结果见图8。

对比测试例2

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的新红色素，其余条件均与测试例1 相同，测试结果见图8。

对比测试例3

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的苋菜红色素，其余条件均与测试例 1相同，测试结果见图8。

对比测试例4

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的靛蓝色素，其余条件均与测试例1 相同，测试结果见图8。

对比测试例5

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的花青素色素，其余条件均与测试例 1相同，测试结果见图8。

对比测试例6

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的姜黄色素，其余条件均与测试例1 相同，测试结果见图8。

对比测试例7

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的胭脂红色素，其余条件均与测试例 1相同，测试结果见图8。

对比测试例8

本对比测试例采用与测试例1相同的流程进行，不同的是，本对比测试 例中：

将1μg的诱惑红色素替换为10μg的甜菜红色素，其余条件均与测试例 1相同，测试结果见图8。

图8是本发明提供的方法检测不同食用色素的拉曼光谱图。从图8可以 看出，本发明提供的方法检测含磺酸基的色素比检测不含磺酸基的色素时， 显示出的SERS信号要明显较强。表明本发明提供的检测食用色素的方法具 有良好的选择性。

实施例1：诱惑红色素的定量分析

a：标准曲线的绘制

室温下，分别将0.001μg、0.003μg、0.005μg、0.007μg、0.009μg、0.02μg、 0.04μg、0.06μg、0.08μg、0.1μg的诱惑红色素与0.10μmol的CA溶于10μL 超纯水中，用涡旋混匀仪以4000rpm的转速混合20s后静置5min，并调节 体系pH为5.22得到混合物I，将所述混合物I滴于珊瑚状SERS活性基底 G1上以进行接触反应，反应10min后进行SERS检测，具体测试结果见图9， 并采用origin软件进行线性拟合，得到的线性方程如下表1。

表1

b：含诱惑红色素的样品检测

将含诱惑红色素的饮料样品1(草莓鸡尾酒)和糖果样品2(草莓糖果) 进行检测。其中糖果样品2需要进行前处理，具体步骤如下：

取1颗置于50mL离心管中，加入5mL蒸馏水，超声处理20min后取 1mL液体置于1.5mL离心管中，8000rpm离心10min，取上清液备用。

将0.10μmol的CA、1μL饮料样品1(糖果样品2)与8μL超纯水用涡 旋混匀仪以4000rpm的转速混合20s后静置5min，并调节体系pH为5.22， 然后将混合液滴于珊瑚状SERS活性基底G1上以进行接触反应，反应10min 后用滤纸吸干，进行SERS检测，并根据线性方程计算出饮料样品1(糖果 样品2)中诱惑红色素的含量，具体结果见表4和图10。

为了证明本发明提供的方法对于实际样品中诱惑红色素检测的准确性， 本申请采用高效液相色谱法(HPLC法)对实际样品中诱惑红色素的含量进 行检测，具体结果见表4。

其中，高效液相色谱法的具体检测条件为：C18柱、进样量10μL、流 速1mL/min、柱温35℃、检测波长504nm、等度洗脱：甲醇：乙酸铵(0.02mol/L) ＝40:60(v：v)。

c：诱惑红色素人工尿液加标回收

采用标准加入法对人工尿液中加入的诱惑红色素进行含量检测，以评估 本发明提供的珊瑚状SERS活性基底应用于生物样品中色素的定量检测的可 靠性，具体步骤如下：

配制不同浓度的诱惑红色素：将0.25μg/mL、0.55μg/mL、0.75μg/mL、 3.50μg/mL、5.50μg/mL、7.50μg/mL浓度的诱惑红色素和10mmol/L的CA添 加到人工尿液中，得到人工尿液加标样品；取10μL人工尿液加标样品滴于 珊瑚状SERS活性基底以进行接触反应，反应10min后进行SERS检测，具 体结果见表5和图11。

实施例2：日落黄色素的定量分析

a：标准曲线的绘制

室温下，分别将0.001μg、0.003μg、0.005μg、0.007μg、0.009μg、0.02μg、 0.04μg、0.06μg、0.08μg、0.1μg的日落黄色素与0.10μmol的CA溶于10μL 超纯水中用涡旋混匀仪以4000rpm的转速混合20s后静置5min，并调节体 系pH为5.22得到混合物I，将所述混合物I滴于珊瑚状SERS活性基底G1 上以进行接触反应，反应10min后进行SERS检测，具体测试结果见图9， 并采用origin软件进行线性拟合，得到的线性方程如下表2。

表2

b：含日落黄色素的样品检测

将含日落黄色素的饮料样品3(橘子汽水)和糖果样品4(橘子糖果) 进行检测。具体检测步骤同实施例1，并根据表2中线性方程计算出饮料样 品3(糖果样品4)中日落黄色素的含量，具体结果见表4和图10。

为了证明本发明提供的方法对于实际样品中诱惑红色素检测的准确性， 本申请采用高效液相色谱法对实际样品中诱惑红色素的含量进行检测，具体 结果见表4。

其中，高效液相色谱法的具体检测条件为：C18柱、进样量10μL、流 速1mL/min、柱温35℃、检测波长481nm、等度洗脱：甲醇：乙酸铵(0.02mol/L) ＝40:60(v：v)。

c：日落黄色素人工尿液加标回收

采用标准加入法对人工尿液中加入的日落黄色素进行含量检测，以评估 本发明提供的珊瑚状SERS活性基底应用于生物样品中色素的定量检测的可 靠性，具体步骤同实施例1，具体结果见表5和图11。

实施例3：亮蓝色素的定量分析

a：标准曲线的绘制

室温下，分别将0.001μg、0.003μg、0.005μg、0.007μg、0.009μg、0.02μg、 0.04μg、0.06μg、0.08μg、0.1μg的亮蓝色素与0.10μmol的CA溶于10μL超 纯水中，用涡旋混匀仪以4000rpm的转速混合20s后静置5min，并调节体 系pH为5.22得到混合物I，将所述混合物I滴于珊瑚状SERS活性基底G1 上以进行接触反应，反应10min后进行SERS检测，具体测试结果见图9， 并采用origin软件进行线性拟合，得到的线性方程如下表3。

表3

b：含亮蓝色素的样品检测

将含亮蓝色素的饮料样品5(蓝莓鸡尾酒)和饮料样品6(蜜桃苏打) 进行检测。具体检测步骤同实施例1，并根据表3中线性方程计算出饮料样 品5(饮料样品6)中亮蓝色素的含量，具体结果见表4和图10。

为了证明本发明提供的方法对于实际样品中诱惑红色素检测的准确性， 本申请采用高效液相色谱法对实际样品中诱惑红色素的含量进行检测，具体 结果见表4。

其中，高效液相色谱法的具体检测条件为：C18柱、进样量10μL、流 速1mL/min、柱温35℃、检测波长600nm、线性梯度洗脱：其中甲醇：0-5min， 由20％至40％；5-8min，保持40％；8-10min，由40％至20％；乙酸铵(0.02mol/L)： 0-5min，由80％至60％；5-8min，保持60％；8-10min，由60％至80％。

c：亮蓝色素人工尿液加标回收

采用标准加入法对人工尿液中加入的亮蓝色素进行含量检测，以评估本 发明提供的珊瑚状SERS活性基底应用于生物样品中色素的定量检测的可靠 性，具体步骤同实施例1，具体结果见表5和图11。

表4

表5

图9是本发明提供的方法检测不同含量食用色素的拉曼光谱图以及标准 线性曲线图。通过图9可以看出，三种色素分别在0.1-1μg/mL和1-10μg/mL 之间均呈良好的线性关系。

图10是本发明提供的方法检测不同实际样品中食用色素的拉曼光谱图。 通过表4和图10的结果可以看出，采用本发明提供的SERS法与HPLC法 检测到的实际样品中的诱惑红色素、日落黄色素以及亮蓝色素的含量十分相 近，证明了本发明提供的方法能够准确检测诱惑红色素、日落黄色素以及亮 蓝色素的含量。

图11是本发明提供的在人工尿液中对食用色素进行加标回收的拉曼光 谱图。通过表5和图11的结果可以看出，采用本发明提供的SERS法对于 实际样品的检测具有良好的准确度和精密度，能够应用于生物样品中色素的 定量检测。

图12是本发明提供的不同保护剂制备得到的SERS活性基底上的银纳 米颗粒的长度和直径分布图。通过图12可以看出，相较于BSA、CTAC、 PVP，采用FSDNA作为保护剂制备得到的珊瑚状SERS活性基底上的银纳 米颗粒的直径和长度分布范围更好，使得制备得到的基底更均匀。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在 本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包 括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样 应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。