免疫指数作为检测靶标在制备预测癌症免疫治疗预后情况的试剂盒中的应用

摘要

本发明公开了免疫指数作为检测靶标在制备预测癌症免疫治疗预后情况的试剂盒中的应用，所述免疫指数＝T

说明书

技术领域

本发明属于癌症治疗预后情况预测技术领域，具体涉及免疫指数作为检测靶标在制备预测癌症免疫治疗预后情况的试剂盒中的应用。

背景技术

恶性黑色素瘤(恶黑)是一种极具浸润性的皮肤癌症，其恶性程度高，是皮肤癌的主要死亡原因之一。近年来其发生率稳步上升。对恶黑的治疗方法取决于疾病发展的阶段，主要治疗手段有外科切除肿瘤以及术后辅助治疗以降低其复发风险。因其在放射治疗与化学治疗下的改善程度都很有限，目前针对转移性和高风险恶性黑色素瘤的治疗方案还包括靶向和免疫疗法。

肿瘤标志物是肿瘤细胞在癌变过程中，由于基因的表达水平的变化而生成或减少的抗原和其他生物活性物质，可用于肿瘤的早期诊断、分期、监测肿瘤进程、评价药物的治疗效果。当肿瘤标志物能在临床病症出现之前被检测到、或者可以用于治疗效果的实时监测时，能对肿瘤的临床治疗带来巨大影响。

目前，为了满足肿瘤的临床诊断和治疗的需求，对肿瘤免疫治疗预测的标志物的研发迫在眉睫。癌症免疫疗法副作用较少，并且表现出更好的效果，近几年来引起了人们的关注。在癌症免疫疗法中，抗PD-1免疫检查点抑制是目前最为主要的免疫疗法。抗PD-1抗体的效果已经在肾癌、头颈癌、胃肠癌、妇科癌症、恶性淋巴瘤和乳腺癌中得到证实。虽然抗PD-1抗体似乎已取得显著的临床成功，但抗PD-1抗体实际上具有一些明显的问题。在几乎所有抗PD-1抗体临床试验中，可从无进展生存期(PFS)数据中找到病情在三个月内恶化的“无效组”。同时，在抗PD-1抗体有效1年或更长时间的组中，此后几乎观察不到病情恶化，从而揭示了接近治愈的状态。这表明存在三个不同的亚组，即依照临床效果的“无效组”、“高效组”和“中间组”，但是用于其预测的生物标志物是未知的。预期成为几乎所有癌症和肿瘤中的标准疗法的抗PD-1抗体对无效组的施用约占40％，这不仅是医学问题，而且也是医学经济学的问题。

目前有一些使用免疫组化染色IHC方法来获得免疫打分(immunoscore)并通过该免疫打分进行肿瘤免疫检查点抑制剂的疗效预测的文献，同时，此类的方法可以应用在不同的癌种，包括非小细胞肺癌，结直肠癌，乳腺癌等等。但是在不同癌种计算免疫打分的方法有所不同。

《The immune contexture and immunoscore in cancer prognosis andtherapeutic efficacy》(Nature Reviews Cancer，2020)是一篇针对免疫疗效预测的生物标志物的综合评测文章，其中提到immunoscore是采用免疫组化染色的办法，对肿瘤中心及浸润边缘的CD3+，CD8+淋巴细胞进行量化，在肿瘤中心和浸润边缘分别计算一个从0到4分的5分制免疫细胞浸润度分数。

《Immunoscore encompassing CD3+and CD8+T cell densities in distantmetastasis is a robust prognostic marker for advanced colorectal cancer》(Oncotarget，2016)公开的技术方案针对晚期结直肠癌，采用免疫组化染色的方法，得到肿瘤中心和浸润边缘区域的CD3，CD4，FOXP3，CD68，CD163的表达，提出三个免疫打分的方法：Immunoscore(IS)，IS-metastatic，IS-macrophage，均有预后显著相关，其中IS-metastasis可以作为独立的预后标志物。

《Assessing PDL-1and PD-1in non-small cell lung cancer：a novelimmunoscore approach》(Clin Lung Cancer，2017)，公开的技术方案采用免疫组化染色，量化了非小细胞肺癌的原发灶和转移淋巴结组织内PD-L1和PD-1的表达，并根据该值计算出免疫打分。

发明内容

本发明的目的在于提供免疫指数作为检测靶标在制备预测癌症免疫治疗预后情况的试剂盒中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种预测癌症免疫治疗预后情况的试剂盒，用于检测肿瘤样本中的免疫指数。

本发明的技术方案如下：

免疫指数作为检测靶标在制备预测癌症免疫治疗预后情况的试剂盒中的应用，所述免疫指数＝T

T

APC

#CD3

#HLA-DR

#Cells为肿瘤样本的癌区ROI中的所有细胞的数目，

α为大于等于0且小于等于100的常数。

在本发明的一个优选实施方案中，所述癌症免疫治疗的方法为免疫检查点抑制剂疗法。

进一步优选的，所述癌症为恶性黑色素瘤。

在本发明的一个优选实施方案中，所述肿瘤样本为石蜡包埋切片样本、冰冻切片样本或浮动切片样本。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括能够识别并计数所述肿瘤样本的癌区ROI中的CD3阳性T细胞和HLA-DR阳性抗原递呈细胞设备。

本发明的另一技术方案如下：

一种预测癌症免疫治疗预后情况的试剂盒，包括用于检测免疫指数的试剂，其中，免疫指数＝T

T

APC

#CD3

#HLA-DR

#Cells为肿瘤样本的癌区ROI中的所有细胞的数目，

α为大于等于0且小于等于100的常数。

在本发明的一个优选实施方案中，所述癌症免疫治疗的方法为免疫检查点抑制剂疗法。

进一步优选的，所述癌症为恶性黑色素瘤。

在本发明的一个优选实施方案中，所述肿瘤样本为石蜡包埋切片样本、冰冻切片样本或浮动切片样本。

进一步优选的，所述试剂为能够同时标记CD3蛋白及HLA-DR蛋白的试剂。

上述免疫检查点抑制剂疗法包括PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂以及它们和其他药物比如化疗或抗血管生成药物的联合治疗方案。

本发明的有益效果是：本发明可以准确预测接受免疫检查点抑制剂疗法的预后情况，为恶性肿瘤患者的治疗方案的选择提供重要的参考。

附图说明

图1为本发明实施例1的。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

将本发明方法应用于对恶性黑色素瘤患者接受免疫检查点抑制剂疗法的预后预测，在对患者进行抗PD-1抑制剂免疫疗法后进行跟踪随访，根据实体肿瘤的疗效评价标准(RECIST 1.1)对患者治疗的预后情况进行评估。在此次黑色素瘤患者的队列中，共有4例非应答患者，6例应答患者。

(1)对患者的肿瘤样本(肿瘤切除手术样本，其包括肿瘤细胞和癌旁组织)进行组织处理、固定和连续切片(后续需要2片组织样本切片)。收集样本后，快速、彻底的固定或冷冻样本。最常见的方法是石蜡包埋(FFPE)，也可以选择冰冻切片和浮动切片。

石蜡包埋切片采用以下步骤。

A、将组织在10％甲醛(或者其他的固定剂)中固定12-48h。固定时间取决于组织厚度、温度及待检抗原的性质。

B、石蜡包埋。

C、切3-5μm厚的切片。

D、将切片置于SIH4/聚左旋赖氨酸包被的载玻片上，使用无黏附剂的水浴。

E、沿切片边缘吸干水。

F、将切片置于60℃烤箱中30-60min。

G、脱蜡后，将切片染色。

需要注意的是：对于富含脂肪的组织(如脑、乳腺)延长风干时间(如室温下过夜)可能增强组织切片的黏附；干燥温度超过60℃可能对某些抗原的检测产生不利影响或者增加背景染色；无论储存条件如何，延长石蜡切片的储存时间都可能降低某些抗原的免疫反应性。根据作者经验，石蜡块的切片不适合长时间储存；如果存档的石蜡切片的染色出现不一致，应该用新鲜切片重复一次实验。

冰冻切片采用以下步骤：

A、切7μm厚的未固定的冰冻切片。

B、将切片置于SIH4/聚左旋赖氨酸包被的载玻片上。

C、将切片在空气中风干30min。

D、置于预冷至4℃的新鲜丙酮中，固定20min。

E、室温风干切片至少15min。

F、将切片染色。

需要注意的是：100％乙醇可替代新鲜丙酮使用；固定剂的选择取决于组织中要染色的目的抗原；未染色的载玻片可以用铝箔包裹，-20℃保存。当准备染色时：打开铝箔，取出载玻片并恢复至室温，用保存之前相同的固定剂进行后固定至少30s，风干切片，在缓冲液中再水化5min，然后进行染色；未染色载玻片的稳定性取决于抗原性质，一些抗原很不稳定必须涂片后立刻染色

(2)对冷冻切片FFPE样本，分别进行免疫组织化学染色(IHC)，标记CD3和HLA-DR蛋白。具体染色过程如下：

A、对切片进行脱蜡和水化，使得后面抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先将样本放在60度恒温箱烘烤20min，然后立即将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min。水化用梯度乙醇浸泡(由高到低100％，95％，70％各5min)。

B、用3％过氧化氢对灭活内源性POD进行灭活(时间10min左右)。

C、利用常规的高压修复、微波修复或酶消化方法进行抗原修复。

D、滴加正常山羊血清、BSA或小牛血清封闭液进行血清封闭(室温20min)，防止非特异性抗体结合，并减少背景和潜在的假阳性结果。

E、滴加一抗混合液(CD3：CD3重组兔/鼠单克隆抗体试剂，HLA-DR：HLA-DR重组兔/鼠单克隆抗体试剂)50μl，室温静置1小时或者4℃过夜。

F、使用酶标记的二抗HRP/DAB对切片进行显色。滴加二抗40-50μl，室温或37℃静置1小时，然后，在显微镜下掌握染色程度。

G、利用苏木精复染2min，形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。

H、利用中性树胶对染好的切片进行封片，以便更好保存。

注：对有条件的实验室，该步骤可以采用多重染色技术(multiplex IHC)，在一张切片上同时染多个蛋白，节省样本使用量。

(3)根据预后标签分子标志物CD3和HLA-DR，在癌区ROI对CD3+T细胞，HLA-DR+抗原递呈细胞进行细胞计数。

在传统病理学诊断中，病理医生根据其掌握的病理学诊断知识和临床经验对IHC图像进行人工解读。该方法对医生的诊断经验要求较高，且诊断结果容易受到图像本身特性的干扰，误差大，主观性强，耗时多。因此，可以引入计算机技术和图像处理算法对免疫组化图像进行定量分析。

本实施例使用计算机图像处理算法，按照如下步骤对IHC图像进行处理：

A、图像预处理：图像预处理步骤包括去噪，去除背景区域、得到组织区域。首先通过消除热像素点的办法去除噪声。然后将图像按照固定大小分成像素块，对每一个像素块计算其像素值的均值和方差，根据图像上所有像素块的统计值，根据自适应阈值算法，将像素块分为背景区域“0”或组织区域“1”。将原图按照像素块大小比例缩小，使在缩小后的图像上，每个像素块由一个像素点表示。在缩小后的图上进行膨胀运算子(dilation)和侵蚀运算子(erosion)的操作，再将其放大到原图大小；去除背景区域后，得到与原图像同等大小的二值图像，其像素值为“1”表示组织区域，“0”表示背景区域。本实施例用图像处理软件ImageJ完成对IHC的图像预处理操作。

B、癌区分割：在组织区域进行图像分割，得到癌区和正常组织区域。本实施例采用预训练好的基于深度学习网络U-Net的癌区分割模型进行癌区分割。分割后得到与原图像同等大小的三值图像，其像素值为2表示癌区，1表示正常组织区域，0表示背景区域。

C、肿瘤样本的癌区中ROI目标区域的选取：本实施例仅对样本的特定区域而非整个癌区进行阳性细胞计数，从而提高了检测对免疫应答结果的预测能力。特别的，本实施例仅在特定的肿瘤的浸润边缘区，即在肿瘤细胞和正常组织的分界线和分界线上向肿瘤中心方向延伸1-2mm左右的距离之间的肿瘤区域，作为细胞计数的ROI，在该区域内进行阳性细胞计数。

D、细胞分割：在癌区内进行细胞分割。本实施例采用预训练好的基于深度学习网络U-Net的细胞分割模型进行细胞分割。

E、定量与阳性细胞计数：对IHC图像，通过颜色去卷积，对其两种蛋白标志物，分别计算出它们的染色图像。本实施例通过ImageJ的颜色去卷积功能(Image-＞Color-＞ColorDeconvolution)进行颜色去卷积。

F、根据细胞分割的结果，对癌区的每一个细胞，其在某蛋白标志物的染色图像上所覆盖的所有像素点的值的平均值做为该细胞的该蛋白的表达量。本实施例采用ImageJ的IHC Profiler插件进行阳性细胞计数。

(5)按免疫指数(IS)对步骤(4)获得的结果进行判读：

免疫指数＝T

T

APC

#CD3

#HLA-DR

#Cells为肿瘤样本的癌区ROI中的所有细胞的数目。

判读时，病理医师应首先判断切片整体中存活肿瘤细胞的大致数量，然后计算切片中的存活于肿瘤细胞区域中各种细胞的大致数量，并最终汇总计算IS值。若组织面积过大，无法全面地一次性计算两种阳性细胞数量，可人为地将组织分为若干个存活肿瘤细胞等量区域(该区域中大致含有相同量的存活肿瘤细胞数)，分别计算每个区域的IS值，最终通过计算平均数来确定整个组织的IS值。

将IS值作为预测值，IS越大，说明预后越好(如图1所示)。最后采用规定的阈值对IS进行二值化，从而提供一个患者分组的办法。α可以根据经验或者已知疗效数据的其他数据集作为参考而选取。根据免疫指数IS对患者进行分组，在本实例中本实施例仅采取阈值比较的方法，以后也可以拓展为采用其他数学模型，比如逻辑回归，以IS的值作为特征，预测该患者对免疫治疗的响应。在本实施例中，本实施例选取参数α＝7，并根据发现集的数据所计算出来的IS值，设定对患者分组的IS的阈值为50时，即可以在区分发现集样本的应答组和不应答组时，灵敏度和特异性都达到100％(见图1a)。根据IS值中位数划分IS高和IS低的两组，两组患者的总生存期(见图1b)和无进展生存期(见图1c)有显著差异。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。