一种鉴定确山黑猪种质资源的特异分子身份证及其应用

摘要

本发明属于猪品种鉴定领域，涉及确山黑猪种质资源，特别是指一种鉴定确山黑猪种质资源的特异分子身份证及其应用。通过SNP分子标记对确山黑猪品种进行研究，采用生物信息学技术综合分析，并将研究结果进行初步验证，构建确山黑猪的品种特异性分子标记，可简单明了地区分确山黑猪与其他地方猪品种间的差异，可用于确山黑猪品种的真伪鉴定和遗传关系分析，为确山黑猪品种的知识产权保护提供了有效的科学依据。在确山黑猪品种鉴定评价时，只需将确山黑猪品种与已有特异性分子身份证比较分析，即可确定其是否为确山黑猪品种。这大大降低了确山黑猪种质资源鉴定评价的时间和费用，提高了确山黑猪品种鉴定评价的效率。

说明书

技术领域

本发明属于猪品种鉴定领域，涉及确山黑猪种质资源，特别是指一种鉴定确山黑猪种质资源的特异分子身份证及其应用。

背景技术

确山黑猪鬃毛粗短，体型较大，一般体长136厘米，体高70厘米左右。面部有菱形皱纹，两耳下垂，腰背平直，母猪腹部稍下垂，臀部稍下斜，尾粗长超过飞节。它最大特点是性情温顺，适宜放养。确山黑猪的中心产区在确山两部的竹沟、瓦岗、石磙河三个乡。与之相毗邻的任店、蚁蜂、胡庙、城郊、朱古洞、李新店和沁阳的大路庄老河等乡也有分布。据九个乡的调查，现有确山黑猪一万八千九百余头。

2009年3月，国家畜禽遗传资源委员会猪专业委员会专家组在驻马店市确山县对确山黑猪进行了现场考察鉴定。经审查，确山黑猪符合农业部《畜禽新品种配套系审定和畜禽遗传资源鉴定办法》中关于猪遗传资源鉴定的基本条件，同意通过初审，并报国家畜禽遗传资源委员会审批。对地方品种的有效保护和合理开发，将有助于河南省养猪业的可持续发展和家畜资源多样性的丰富。特别是对地方猪品种的特异性遗传结构和表征的研究，将有助于根据品种遗传情况制定对每个品种的保护计划，促进对地方猪品种的具体保护。保存每个品种的独特变异、基因和特征对于维持生物多样性和适应未来环境变化极为重要。因此，利用生物信息技术鉴定河南地方猪品种独特的遗传特征是准确保护地方猪种质遗传资源的重要部分。

单核苷酸多态性(single nucleotide ploymophism，SNP)标记是第三代分子标记，是指在基因组DNA序列上有单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失。SNP具有分布广泛量、高频率、低突变率等特点，广泛应用于基因组分析、生物信息自动化检测、疾病的遗传研究及畜禽育种标记等研究。

全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)是畜禽遗传资源基因组解析常用的重要方法。随着测序技术的发展，芯片测序技术成为高通量SNP分型的有力工具。与此同时，在动物受到长期的自然选择和人工选择时，会在其基因组上留下相应的遗传印记。这些遗传印记通常被称为选择信号。选择信号的研究是基于基因组到表型概念的一种研究策略。由于我国地方猪种表型记录的缺乏和种群规模小，对家畜种质特征的分析日益成为一种重要的方法。为了提供一种可以批量鉴定确山黑猪种质资源的方法，本课题组进行了长期的跟踪研究。

发明内容

为实现上述目的，本发明提出一种鉴定确山黑猪种质资源的特异分子身份证及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种鉴定确山黑猪种质资源的特异分子身份证，所述SNP位点为确山黑猪品种间等位基因频率较高的SNP位点集合。

优选的，所述SNP位点位于猪参考基因组EnsemblSscrofa 11.1版本。

进一步，所述SNP位点的集合包括CNC10010832位点、CNC10012824位点、CNC10012972位点、CNC10013000位点、CNC10013872位点、CNC10040563位点、CNC10041271位点、CNC10041332位点、CNC10041501位点、CNC10041536位点、CNC10041599位点、CNC10041838位点、CNC10042298位点、CNC10060925位点、CNC10062082位点、CNC10062105位点、CNC10062442位点、CNC10062524位点、CNC10090798位点、CNC10091437位点、CNC10091643位点、CNC10092360位点、CNC10092481位点、CNC10092509位点、CNC10092580位点、CNC10130757位点、CNC10131664位点、CNC10133552位点、CNC10141731位点、CNC10141931位点、CNC10142249位点、CNC10142250位点、CNC10151846位点、CNC10152169位点、CNC10152617位点、CNC10170559位点、CNC10170888位点、CNC10170889位点和CNC10171158位点。

优选的，所述CNC10010832位点的突变型为T/C、CNC10012824位点的突变型为T/G、CNC10012972位点的突变型为G/A、CNC10013000位点的突变型为A/G、CNC10013872位点的突变型为C/T、CNC10040563位点的突变型为T/G、CNC10041271位点的突变型为C/T、CNC10041332位点的突变型为T/C、CNC10041501位点的突变型为T/C、CNC10041536位点的突变型为C/T、CNC10041599位点的突变型为G/A、CNC10041838位点的突变型为C/T、CNC10042298位点的突变型为C/T、CNC10060925位点的突变型为C/T、CNC10062082位点的突变型为A/G、CNC10062105位点的突变型为T/C、CNC10062442位点的突变型为A/G、CNC10062524位点的突变型为A/G、CNC10090798位点的突变型为T/C、CNC10091437位点的突变型为C/T、CNC10091643位点的突变型为G/T、CNC10092360位点的突变型为T/C、CNC10092481位点的突变型为T/C、CNC10092509位点的突变型为A/G、CNC10092580位点的突变型为A/G、CNC10130757位点的突变型为G/A、CNC10131664位点的突变型为C/T、CNC10133552位点的突变型为A/G、CNC10141731位点的突变型为T/C、CNC10141931位点的突变型为C/T、CNC10142249位点的突变型为A/G、CNC10142250位点的突变型为G/T、CNC10151846位点的突变型为G/T、CNC10152169位点的突变型为G/C、CNC10152617位点的突变型为G/A、CNC10170559位点的突变型为G/A、CNC10170888位点的突变型为C/T、CNC10170889位点的突变型为T/C、CNC10171158位点的突变型为C/T。

用于识别上述的特异分子身份证的基因芯片。

上述的基因芯片在鉴定确山黑猪品种中的应用。

步骤为：

（1）采集待测猪的组织样本，并提取基因组DNA；

（2）利用基因芯片对步骤（1）的基因组DNA进行SNP分型，获得待测猪的基因型数据；

（3）利用PLINK软件将待检测猪的基因型数据与特异分子身份证上的SNP位点的基因型进行合并，再进行主成分分析。

进一步的，所述步骤（1）中基因组DNA在A260/280的光吸收比在1.8和2.0之间，浓度≥50纳克/微升。

进一步的，所述步骤（3）中SNP分型的主成分分析的结果与确山黑猪群体的遗传距离较近，且聚集为一簇时，即为确山黑猪。

本发明具有以下有益效果：

1、使用PLINK软件将待检测猪的基因型数据和以上10个品种的基因型数据合并，之后进行主成分分析及利用R语言进行结果的可视化，当待检测猪个体与确山黑猪群体的遗传距离较近，且聚集为一簇时，见图3，可以判定待检测猪为确山黑猪。

2、本发明公开了一种快速准确鉴定评价确山黑猪种质资源的方法及确山黑猪品种特异性分子身份证，通过SNP分子标记对确山黑猪品种进行研究，采用生物信息学技术综合分析，并将研究结果进行初步验证，构建确山黑猪的品种特异性分子标记，可简单明了地区分确山黑猪与其他地方猪品种间的差异，可用于确山黑猪品种的真伪鉴定和遗传关系分析，为确山黑猪品种的知识产权保护提供了有效的科学依据。在确山黑猪品种鉴定评价时，只需将确山黑猪品种与已有特异性分子身份证比较分析，即可确定其是否为确山黑猪品种。这大大降低了确山黑猪种质资源鉴定评价的时间和费用，提高了确山黑猪品种鉴定评价的效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的确山黑猪的GWAS分析结果的曼哈顿图和QQ图。

图2为本发明的确山黑猪的选择信号分析结果的曼哈顿图。

图3为本发明的确山黑猪品种特异性分子身份证的主成分分析验证图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一种筛选确山黑猪种质资源的特异分子身份证的方法，步骤为：

（1）耳样采集

试验群体为1117头猪，共10个猪品种，包括7个中国猪品种：南阳黑猪（n=10，NY），淮南猪（n=10，HN），豫农黑猪（n=1036，YN），确山黑猪（n=10，QS），莱芜猪（n=10，LWH），二花脸猪（n=10，EHL），民猪（n=6，MIN）；西方商品猪种3个：杜洛克猪（n=10，DU），大白猪（n=10，LW），长白猪（n=5，LR）。使用75%的酒精清洁猪只的耳朵，使用耳样钳剪取少量耳组织，放置在装有75%酒精的2ml离心管中，保存在-20℃冰箱。

（2）总DNA提取、质量检测及基因分型

采用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取总DNA；

采用DYY-6C型电泳仪，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测；

采用Nanodrop-2000紫外分光光度计检测DNA的浓度，保留光吸收比（A260/280）在1.8和2.0之间，浓度≥ 50纳克/微升的基因组DNA样本，用于Illumina Porcine SNP50BeadChip（北京康普森生物技术有限公司，中芯一号）进行全基因组芯片分型，具体操作为：

a、利用Tn5转座酶对样品猪建立基因文库，并进行50 K基因芯片扫描。

b、对步骤（1）中的50 K芯片和全基因组重测序结果使用Beagle进行基因型填充。

c、对所有个体通过步骤b获得的基因型填充数据进行全基因组关联分析和选择信号分析。

d、对步骤c获得的显著位点，进行品种间的等位基因频率计算，保留确山黑猪等位基因频率较高的SNP位点，该SNP位点的集合，作为确山黑猪品种特异性分子身份证。

（3）基因型数据填充及质量控制

经芯片测序共获得1,117头，51,315个SNPs。使用 PLINK软件对芯片数据进行质量控制。通过以下参数对基因型数据进行过滤：个体基因型检出率（--mind）>90%，标记基因型（--geno）检出率>95%，最小等位基因频率（--maf）>1%，最小哈代温伯格平衡（--hwe）为10-6，位于常染色体。采用隐马尔科夫模型（Hidden Markov Model，HMM）算法，在 BEAGLE软件中执行对缺失基因型的填充。

（4）全基因组关联分析筛选SNP特异位点

采用GEMMA软件进行全基因组关联分析，试验组为10头确山黑猪（case），对照组为其余9个品种（control）。其中确山黑猪的曼哈顿图见图1左和QQ图见图1右，曼哈顿图中有两条阈值线，其中实线的阈值为0.05/N（N为所使用的芯片位点个数），在实线上方的位点为全基因组显著水平，虚线的阈值为1/N，在虚线上方的位点为染色体显著水平，QQ图中的λ值越接近1，表明全基因组关联分析的结果越可信；使用班费罗尼矫正方法鉴定与品种显著相关的SNPs，该显著SNPs的集合为A组。

（5）选择信号分析筛选SNP特异位点

采用VCFtools软件进行遗传分化指数（genetic differentiation index,Fst）的计算，使用滑动窗口取均值的计算方法，结果见图2，图2中的阈值线为Fst值经排序后较大的前1%，在该阈值线以上的位点为显著位点（红色标记）。具体参数如下：滑动窗口的大小（--fst-window-size）为100,000 bp，滑动窗口的步长（--fst-window-step）为40,000 bp。将窗口按Fst值从大到小排序，定义前1%的窗口为显著窗口，再利用PLINK软件提取显著窗口内的SNPs，该显著SNPs的集合为B组。

（6）等位基因频率筛选SNP特异位点

利用PLINK软件合并A组和B组的显著SNPs，并计算每个SNP在10个品种中的等位基因频率，筛选等位基因频率在试验组的分布较其他9个品种高的SNP集合作为确山黑猪品种的特异性分子身份证。

表1确山黑猪品种的特异性分子标记集合

（7）利用PLINK软件对10个品种的上述39个SNPs进行提取，进行主成分分析验证。

（8）该39个SNP位点在鉴定确山黑猪品种中的应用，所述SNP位点位于基因组版本EnsemblSscrofa 11.1。

应用例

一种待测猪品种的鉴定方法，具体包括以下步骤：

1. 提取待检猪的耳组织样本，提取组织样本的基因组DNA，通过芯片对以上39个位点进行分型。基因组DNA送至北京康普森生物技术有限公司，进行针对地方猪的“中芯一号”（Axiom）芯片，进行SNP分型。芯片进行SNP分型的试验原理是基于连接反应，其中有两种探针发挥作用。第一种是芯片上的捕获探针，起到把目标DNA片段固定到芯片表面的作用。第二种是显色探针，负责对SNP芯片进行着色（红色和绿色荧光）。试验共进行两轮杂交。第一轮杂交，是目标DNA与芯片进行杂交，捕获探针会抓取匹配的目标DNA片段；显色探针在第二轮杂交中，杂交到DNA片段上。然后利用连接酶的识别作用，只有与目标DNA片段互补的显色探针才会被连接到捕获探针上。通过荧光标记的染色，在激光扫描下进行SNP分型，得到待测猪的基因型数据。

2. 使用PLINK软件将待检测猪的基因型数据和确山黑猪的基因型数据合并，并提取数据中的以上39个位点，之后进行主成分分析，当待检测猪个体与确山黑猪群体的遗传距离近，此时可判定待检测猪为确山黑猪。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。