一种类器官培养用组织保存液及其制备方法

摘要

本发明公开了一种类器官培养用组织保存液，保存液的成分包括DMEM/F12培养基、青霉素‑链霉素、Y27632、HEPES和基于功能核酸的HGF模拟物。本发明采用上述的一种类器官培养用组织保存液及其制备方法，有效的刺激细胞生存、增殖，从而有助于保持其细胞活性，并且，有利于离体组织保存及后续类器官构建。

说明书

技术领域

本发明涉及离体组织保存及运输技术领域，尤其是涉及一种类器官培养用组织保存液及其制备方法。

背景技术

类器官(Organoid)是一种利用成体干细胞，在体外培养出的3D细胞培养物，与对应的人体器官具有高度相似的组织学特征，能重现器官的部分生理功能。利用患者离体肿瘤组织构建类器官，能模拟肿瘤组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

患者离体组织的活性是后续能否培养出类器官的关键。现有的组织保存方法主要有(1)超低温冻存后运输：将组织置于液氮或干冰中。(2)活细胞运输保存：将活细胞置于培养液中，于0-10℃低温保存运输。

然而，超低温冻存后运输存在成本过高，冻存-复苏过程中对细胞造成损伤等问题，不利于组织活性的保持及后续类器官的构建。而目前的活细胞运输保存方法都只适合短时间保持活性，不适用于长时间远距离运输，且其对组织活性维持能力有限，限制了类器官构建的成功率。

发明内容

本发明的目的是提供一种类器官培养用组织保存液及其制备方法，有效的刺激细胞生存、增殖，从而有助于保持其细胞活性，并且，有利于离体组织保存及后续类器官构建。

为实现上述目的，本发明提供了一种类器官培养用组织保存液，保存液的成分包括DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素、Y27632、HEPES和基于功能核酸的HGF模拟物。

优选的，青霉素-链霉素的质量浓度为0.9-1.2％，Y27632的摩尔浓度为8-12μM，HEPES的摩尔浓度为9-13mM，HGF模拟物的摩尔浓度为0.9-1.3μM。

优选的，青霉素-链霉素的质量浓度为1％，Y27632的摩尔浓度为10μM，HEPES的摩尔浓度为10mM，HGF模拟物的摩尔浓度为1μM。

优选的，基于功能核酸的HGF模拟物包括功能核酸Ap-1、Ap-2，Ap-1为如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，Ap-2为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

一种类器官培养用组织保存液的制备方法，步骤如下：

S1、按照浓度要求分别配制DMEM/F12培养基、Y-27632、HEPES、青霉素-链霉素、HGF模拟物溶液；

S2、于20mL DMEM/F12培养基中依次加入10μM Y-27632、10mM HEPES、1％青霉素-链霉素，配置成保存液A；

S3、于保存液A中加入1μM HGF模拟物，即得。

优选的，基于功能核酸的HGF模拟物制备方法如下：将功能核酸Ap-1和Ap-2的干粉分别溶于纯水配成100μM，各自取母液12μL并添加18μL缓冲液充分混匀后，配成40μMAp-1和Ap-2溶液；

将配成的溶液置于金属浴95℃加热5min，迅速放置冰上半小时，然后Ap-1和Ap-2以1:1混合，室温震荡15min，得60μL 20μM基于功能核酸的HGF模拟物。

因此，本发明采用上述一种类器官培养用组织保存液及其制备方法，有利于离体组织保存及后续类器官构建。

本发明中利用功能核酸模拟HGF的活性，将其添加于保存离体组织的保存液中，利用HGF可诱导细胞生存、增殖的能力，提高保存于其中的组织的细胞活性，有利于长时间保存及后续类器官的构建。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是小鼠原位前列腺癌组织于保存液中分别保存24h、48h的细胞活性图示；

图2是于保存液保存24h、48h后前列腺癌离体组织再培养7天后光学显微镜成像图。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。

还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。

本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。

对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。

本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。

实施例一

基于功能核酸的HGF模拟物的合成

在无菌操作台中将功能核酸(Ap-1和Ap-2)干粉溶于默克水配成100μM，取母液12μL分别加18μL缓冲液充分混匀，配成40μMAp-1和Ap-2溶液。

将40μMAp-1和Ap-2溶液分别置于金属浴95℃加热5min，快速放置冰上半小时。接着，Ap-1和Ap-2以1:1混合，室温震荡15min，得60μL，20μM基于功能核酸的HGF模拟物(Ap-1+2)。

实施例二

向20mL DMEM/F12培养基中依次加入10μM Y-27632、10mM HEPES以及1％青霉素-链霉素，配置成保存液A，保存液于4℃存放。使用前额外添加1μM HGF模拟物。

对比例一

向20mL DMEM/F12培养基中依次加入10μM Y-27632、10mM HEPES以及1％青霉素-链霉素，配置成保存液A，混匀后分装于5ml离心管中，每管2mL。保存液于4℃存放。

试验测试

一、小鼠前列腺癌组织的保存

取新鲜C57bl/6小鼠原位前列腺癌组织，切成约0.5*0.5*0.5cm

如图1，图示中1、2分别是在对比例一的保存液中24h、48h的细胞活性图，图示中3、4分别是在实施例二的保存液中24h、48h的细胞活性图，细胞活性图均与0h的细胞活性进行对比得出的统计图。根据结果分析，对比例一与实施例二的保存液中24h均可以较好地维持细胞活性，实施例二相较于对比例一的保存液细胞活性更高。对比例一的保存液可以保存48h，而在实施例二的保存液中48h后的细胞活性仍达80％，其细胞的活性大大提高。

二、小鼠前列腺癌类器官的培养

取新鲜C57bl/6小鼠原位前列腺癌组织，切成约0.5*0.5*0.5cm

待保存时间到，进行类器官培养，具体步骤如下：用预冷的PBS清洗组织。将切碎的组织块放入15mL离心管中，加入1mL 2mg/mL Collagenase II(终浓度为1mg/mL含有1％PS+10μMY-26732，用DMEM/F12稀释)，将离心管置于37℃，90rpm振荡消化1h，期间每15min用移液枪轻柔吹打使其充分消化。去除Collagenase II，加入1ml预热的DMEM/F12培养液(DMEM/F12+1％双抗+10mM HEPES)洗涤组织块后4℃250g离心5min，用培养液重悬获得的细胞，过100μm细胞过滤器，计数。

将所有细胞悬液250g 4℃离心5min，调整细胞密度为5000个/μL。取12μL 5000个/μL细胞+48μL Martrigel终浓度80％左右，取50μL将混有细胞的Matrigel滴加到预热的24孔板中，固化后加入400μL培养液进行培养。每3天换一次液，7天后观察。

将保存于对比例一和实施例二中保存液24h、48h后的前列腺癌离体组织，培养7d，使用光学显微镜进行成像。结果发现，相较于保存于对比例一的保存液24h，保存于实施例二中保存液24h的组织形成类器官的数量更多，形貌更加好看。保存于对比例一中保存液48h的组织，无法形成很好地类器官，细胞出现凋亡。而保存于实施例二的保存液48h的组织仍可以很好的形成类器官。

因此，本发明采用上述一种类器官培养用组织保存液及其制备方法，有效的刺激细胞生存、增殖，从而有助于保持其细胞活性，并且，有利于离体组织保存及后续类器官构建。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

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<212> DNA

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