一种rVSVΔG-HV在检测血清中和抗体效价中的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种rVSVΔG‑HV在检测血清中和抗体效价中的应用，rVSVΔG‑HV可以检测血清中和抗体效价，且HFRS患者恢复期血清对HTNV与rVSVΔG‑HV的中和能力相似，rVSVΔG‑HV可以代替HTNV检测血清中的中和抗体效价。本发明中的rVSVΔG‑HV可以代替HTNV检测血清中的中和抗体效价。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种rVSVΔG-HV在检测血清中和抗体效价中的应用。

背景技术

汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)为布尼亚病毒目(Bunyavirales)汉坦病毒科(Hantaviridae)的有包膜、负链RNA病毒，基因组分为三节段S、M、L，分别编码核衣壳蛋白NP，包膜糖蛋白GPC(在细胞内翻译后切割成Gn和Gc)，以及RNA依赖的RNA聚合酶RdRp。HTNV感染造成肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)，临床表现为发热、出血和急性肾功能损害。该病流行范围广、病死率高，危害极为严重。

中和抗体与病毒表面抗原结合，阻止病毒感染细胞，因此成为疫苗评价中关键指标之一。HTNV感染并不产生明显的CPE，故难以用传统的空斑减少试验检测中和抗体效价。目前，实验中和临床上检测HTNV中和抗体效价的主要方法是基于ELISA技术的微量细胞培养中和试验，该方法的缺点是操作繁琐、实验周期长(约11～12天)、结果展示不直观、难以用于检测大规模临床样本的中和抗体水平。斑点减少中和试验(FRNT)也用来检测HTNV中和抗体效价，与上述微量细胞中和试验相比，FRNT操作相对简便、实验周期也缩短(约6～7天)，但是斑点减少中和试验的耗时仍较长，仍不利于临床检测。因此，亟需开发一种特异性好、周期短的检测方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种rVSVΔG-HV在检测血清中和抗体效价中的应用，HFRS患者恢复期血清对HTNV与rVSVΔG-HV的中和能力相似，即说明rVSVΔG-HV可以代替HTNV检测血清中的中和抗体效价。

HTNV GP是诱导中和抗体的主要抗原，本课题组前期将HTNV GP的表达基因M克隆至VSVΔG-GFP载体中，获得表达HTNV GP的重组病毒rVSVΔG-HTNV M(I532K/S1094L/ΔC6)-GFP(专利申请公开号为CN113842454A)，本发明中简称rVSVΔG-HV，本发明进一步检测了HFRS患者恢复期血清分别中和HTNV与rVSVΔG-HV的能力，且比较了两者之间的相关性，表明HFRS患者恢复期血清对HTNV与rVSVΔG-HV的中和能力相似，即说明rVSVΔG-HV可以代替HTNV检测血清中的中和抗体效价。

传统的HTNV中和抗体检测试验FRNT时间较长，不利于临床及实验室中的应用。本发明中的rVSVΔG-HV中携带GFP标签，感染细胞后8h即可表达出GFP蛋白，通过对GFP阳性细胞计数，通过GFP减少中和试验计算出血清中和效价，与传统方法相比，GFP减少中和试验只需要8h，大大缩短了检测时间，便于临床及实验室的应用。

本发明提供了rVSVΔG-HV在检测血清中和抗体效价中的应用，所述血清为HFRS患者恢复期血清。

进一步地，所述rVSVΔG-HV能够代替HTNV检测血清中和抗体效价。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明中的rVSVΔG-HV中携带GFP标签，感染细胞后8h即可表达出GFP蛋白，大大缩短了检测时间，特异性好，便于临床及实验室的应用。

2、本发明检测了HFRS患者恢复期血清分别中和HTNV与rVSVΔG-HV的能力，且比较了两者之间的相关性，结果显示rVSVΔG-HV可以代替HTNV检测血清中的中和抗体效价。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1表示本发明HFRS患者恢复期血清中和HTNV的布板；

图2表示本发明10份HFRS患者恢复期血清中和HTNV的相对感染率；

其中，图A表示1-5份HFRS患者恢复期血清中和HTNV的相对感染率；

图B表示6-10份HFRS患者恢复期血清中和HTNV的相对感染率；

图3表示本发明10份HFRS患者恢复期血清中和rVSVΔG-HV的相对感染率；

其中，图A表示1-5份HFRS患者恢复期血清中和rVSVΔG-HV的相对感染率；

图B表示6-10份HFRS患者恢复期血清中和rVSVΔG-HV的相对感染率；

图4表示HFRS患者血清中和rVSVΔG-HV与HTNV的EC

图5表示HFRS患者血清中和rVSVΔG-HV与HTNV的EC

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、实验材料

HTNV病毒由本实验室保存；rVSVΔG-HV病毒由本实验室构建并保存(具体构建步骤记载于公开号为CN113842454A的专利申请中)；HFRS患者恢复期血清由唐都医院惠赠；4％多聚甲醛；Triton X-100；BSA购自YEASEN公司；1A8抗体由本实验室保存；HRP-GoatAnti mouse IgG购自生工生物有限公司；沉淀型TMB显色液购自百智生物；CYTATIONimaging reader购自Bio-Tek公司。

二、实验方法

1、FRNT检测HFRS患者恢复期血清对HTNV的中和活性

如图1所示，Vero E6接种于96孔板中培养至细胞汇合度大于90％；10份HFRS患者恢复期血清(分别标记为1，2，3，…,10)按1:20、1:60、1:180、1:540、1:1620、1:4860、1:14580、1:43740稀释至200μL，分别与等体积的200FFU HTNV混合；37℃孵育1h，使病毒与血清充分接触；96孔板弃去培养基，将病毒血清混合液按100μL/孔加入96孔板中，每个稀释度设2个复孔，同时设置HTNV感染孔；病毒血清混合液感染细胞2h，期间每隔15min轻轻晃动平板，使病毒充分感染细胞；弃上清，覆盖液按100μL/孔加入96孔板中继续培养5天；PBS洗去覆盖液，4％多聚甲醛室温固定30min；0.5％Triton X-100于室温破膜15min；PBS洗涤96孔板3次，加入3％BSA稀释的1A8，4℃过夜孵育；吸弃1A8，加HRP-Goat Anti mouse IgG，室温孵育1h；PBS洗涤3次，加100μL/孔的沉淀型TMB显色液，避光室温显色15～30min；弃显色液，板底可见深色斑点并计数。计算HTNV相对感染率(计算公式如下)：

HTNV相对感染率＝1/2(复孔1+复孔2)/病毒感染孔斑点数×100％。

2、GFP减少中和试验检测HFRS患者恢复期血清对rVSVΔG-HV的中和活性

Vero E6接种于96孔板中培养至细胞汇合度大于90％；10份HFRS患者恢复期血清(分别标记为1，2，3，…，10)按1:20、1:60、1:180、1:540、1:1620、1:4860、1:14580、1:43740稀释至200μL，分别与等体积的200PFU rVSVΔG-HV混合；37℃孵育1h；96孔板弃去培养基，将病毒血清混合液按100μL/孔加入96孔板中，每个稀释度设2个复孔，同时设置rVSVΔG-HV感染孔；病毒血清混合液感染细胞8h；弃上清，加100μL/孔的4％多聚甲醛固定液，室温固定30min；弃固定液，利用BioTek的CYTATION imaging reader扫描96孔板，并对表达绿色荧光蛋白的细胞计数；利用上述计算公式计算rVSVΔG-HV的相对感染率。

三、实验结果

1、FRNT检测HFRS患者恢复期血清对HTNV的中和活性

10份HFRS患者恢复期血清中和HTNV，计算相对感染率，并绘制曲线，如图2所示，从图中可知，患者血清可有效中和HTNV。

2、GFP减少中和试验检测HFRS患者恢复期血清对rVSVΔG-HV的中和活性

10份HFRS患者恢复期血清中和rVSVΔG-HV，计算相对感染率，并绘制曲线，如图3，从图中可知，患者血清可有效中和rVSVΔG-HV。

3、HFRS患者血清中和rVSVΔG-HV与HTNV的EC

上述患者血清中和rVSVΔG-HV与HTNV的实验中，进一步获得患者血清中和HTNV与rVSVΔG-HV的有效浓度EC

随后分析两者EC50的相关性，如图5所示，从图中可知，两者的EC

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。