巴氏新小绥螨杀螨肽NbX-4及其应用

摘要

本发明公开了一种巴氏新小绥螨杀螨肽NbX‑4及其应用，该杀螨肽作为全新的杀螨基因资源，具有不同于已有杀螨剂的作用方式，对拓展具有生物活性的新型杀螨基因资源，降低现有化学杀螨剂广泛使用导致的各类安全风险，减少田间化学农药的用量具有重要的科学及现实意义。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物防治领域，具体涉及一种巴氏新小绥螨杀螨肽NbX-4及其应用。

背景技术

目前广泛用于农业害螨防治的手段是化学农药，尚无杀螨效果的蛋白类活性物质。但因为农业害螨世代周期短、繁殖力强、可孤雌生殖等特点，加之化学杀螨剂在田间的长期使用，导致以二斑叶螨为代表的农业害螨抗性问题突出，二斑叶螨甚至是抗性问题最为严重的节肢动物之一，仅次于小菜蛾(Van Leeuwen T et al.Population bulksegregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of achitin synthesis inhibitor in arthropods.Proc Natl Acad Sci USA.2012；109:4407-4412.)。因此，开发高效环保的新型杀螨活性物质能够丰富农业害螨的防治手段，减少田间化学农药的用量。

作为节肢动物的天敌，蛛形纲捕食性生物体内大都具有天然杀虫(螨)活性肽(Spider toxin)，由于该类物质活性高，对非靶标生物安全，在新型杀虫活性物质的开发中受到广泛关注(King GF，et al.，Spider-Venom peptides：structure，pharmacology，andpotentialfor control of insect pests，Annu.Rev.Entomol.2013,58：475-496.)。目前发现的蜘蛛毒素的作用靶标大都在节肢动物神经系统细胞膜的多种通道和受体，如离子通道、神经配体门控通道和G蛋白关联受体等。然而当前关于蜘蛛毒素的研究主要集中在捕食性蜘蛛这类大型猎食者对昆虫的活性物质上，尚未关注蛛形纲中的微小天敌捕食螨体内的对农业害螨具有生物活性的物质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种具有杀螨效果的新型杀螨蛋白，该蛋白能够通过分子基因工程的方法大量表达或通过转基因技术在作物中表达，从而达到抗螨的效果。

本发明的技术方案为：巴氏新小绥螨杀螨肽NbX-4，它的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

巴氏新小绥螨杀螨肽NbX-4的基因，它的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种杀螨肽，为巴氏新小绥螨杀螨肽NbX-4的成熟肽，它的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

编码上述杀螨肽的基因。由于密码子的简并性，该编码基因可以有多种组合，优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

一种表达载体，含有编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的蛋白的基因。

SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的多肽在朱砂叶螨防治中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用生物信息学分析方法，对巴氏新小绥螨全长转录组数据库中的基因进行筛选，与现有蜘蛛毒素相关基因进行序列比对，获得巴氏新小绥螨杀螨肽候选基因，然后利用多聚酶链式反应(PCR)及Sanger法测序，获得该基因的完整序列。将该基因的成熟肽区域构建到原核表达载体pET-32a(+)中，经原核系统表达，即可获得该基因编码的杀虫肽NbX-4。制备周期短，氨基酸序列小，适合体外大规模生产，同时，该杀螨肽作为全新的杀螨基因资源，具有不同于已有杀螨剂的作用方式，对拓展具有生物活性的新型杀螨基因资源，降低现有化学杀螨剂广泛使用导致的各类安全风险，减少田间化学农药的用量具有重要的科学及现实意义。

附图说明

图1为注射CK和重组毒素NbX-4后，二斑叶螨(红)在不同时间点的死亡率，星号表示差异显著(P<0.05)；

图2为注射CK和重组毒NbX-4后，二斑叶螨(红)的死亡表型

图3质粒测序结果；

图4巴氏新小绥螨重组蛋白NBX-4SDS-PAGE电泳图；图中M为marker，1为空载，2为未诱导，3为总蛋白，4为沉淀，5为上清，6为纯化。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例中所设计的试剂和培养基配方：

(1)LB液体培养基：

在200ml去离子水中加入2g胰化蛋白胨，1g酵母提取物和2g NaCl，搅拌混匀，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min，冷却后加入抗生素置于4℃保存。

(2)LB固体培养基：

在200ml双蒸水中加入2g胰化蛋白胨，1g酵母提取物，2g NaCl和3g琼脂，搅拌混匀，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min，冷却后至50℃加入终浓度为100mg/L的氨苄青霉素，倒板，冷却后置于4℃保存。

(3)电转液：

使用时，取10×电转液(含Tris0,23mol/L，甘氨酸1.92mol/L)100ml，加入200ml甲醇，用去离子水定容至1L。如有必要可加入少量SDS(工作浓度为0.037％)

(4)封闭液：

1×TBST中加入5％的脱脂奶粉。

(5)结合缓冲液(Washing Buffer)：

0.04mM PBS，0.5M氯化钠，20mM咪唑，双蒸水定容至1L，pH7.4。

(6)洗脱缓冲液(Elution Buffer)：

0.04mMPBS，0.5M氯化钠，500mM咪唑，双蒸水定容至1L，pH7.4。

(7)氨苄青霉素(Amp，100mg/mL)：称量1g氨苄青霉素于10mL容量瓶中，用灭菌水充分混匀溶解后定容至10mL，经0.22μm的一次性滤膜过膜除菌，分装避光保存于-20℃冰箱备用；

(8)卡那霉素(Kana，50mg/mL)：称量0.5g氨苄青霉素于10mL容量瓶中，用灭菌水充分混匀溶解后定容至10mL，经0.22μm的一次性滤膜过膜除菌，分装避光保存于-20℃冰箱备用；

(9)0.02％琼脂凝胶配置：称取0.9g琼脂粉溶于45mL去离子水中，微波炉加热至沸腾，倒入一次性培养皿中待其半凝固后放置玻璃毛细血管，等完全凝固后放置于4℃冰箱备用。

(10)IPTG(24mg/mL)：称取1.2g IPTG置于50mL离心管，加入40mL灭菌水，充分混合溶解，定容至50mL。经0.22μm的一次性滤膜过膜除菌，分装保存于-20℃冰箱备用。

实施例1

利用生物信息学分析方法，对巴氏新小绥螨全长转录组数据库中的基因进行筛选，与现有蜘蛛毒素相关基因进行序列比对，获得巴氏新小绥螨杀螨肽候选基因NbX-4，该基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将其成熟肽序列(SEQ ID No.3所示)按照大肠杆菌密码子偏好性进行了密码子优化，设计出用于在大肠杆菌中表达的NbX-4成熟肽的基因序列(SEQ ID No.4所示)。将该基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中，构建出含有目的基因的pET-32a(+)-NbX4重组质粒，该毒素基因引入NcoI酶切位点。

重组质粒pET-32a(+)-NbX4的诱导表达

感受态选择Origami B(DE3)菌株，其中包含突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)(trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)(gor)基因，该感受态有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。在LB平板中挑取单个的阳性菌斑，分别加入到含有100mg/ml的氨苄青霉素和50mg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中，恒温摇床中200rpm，37℃，6h。将测序正确的菌液(图3)进行15ml扩大培养。将培养后的菌液按照1：100的比例，接种到含有100mg/ml的氨苄青霉素和50mg/ml的卡那霉素的200ml的LB液体培养基中。在220rpm，37℃条件下培养至菌液OD600值为0.6-0.8。在pET-32a(+)-NbX4重组子中加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃，150rpm，诱导表达12h；取出表达后的菌液4℃，4000rpm离心20min，弃上清，在菌体沉淀中加入0.01mM的PBS重悬，定容至20ml。之后进行超声破碎30min，运行8s，暂停8s；破碎结束之后在4℃，9000rpm，离心30min，取上清，弃沉淀(图4)。

Western Blot检测

取40μl的上清液，加入10μl的蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5min，加入1L的蛋白缓冲液到SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并加入15μl的蛋白标样。80V跑出浓缩胶，然后用120V直至蛋白样品至凝胶底部；电泳结束后，将凝胶切至适宜大小转入电转液中，并将PVDF膜浸泡于甲醇3min后转入电转液，覆盖之后进行转膜，200mA，1h。转膜结束后，将膜取出，TBST洗3次，每次5min，封闭液封闭2h-3h，室温，80r/min；封闭后将膜取出，TBST洗3次，每次10min，加入一抗(1∶2000)，孵育2h，室温，80r/min或者4℃过夜；一抗孵育结束后，将膜取出，TBST洗3次，每次10min，转入加入二抗(1∶10000)，孵育1h，室温，80r/min；二抗孵育结束后，TBST洗3次，每次10min，加入发光液，避光2min，滤纸吸干表面液体后，化学发光检测(图4)。

重组毒素pET-32a(+)-NbX4的纯化

将大量表达诱导表达破碎之后的上清液用Ni-NTA 6FF预装重力柱进行纯化。先等重力柱中保存液自由流出，加入1体积柱的Washing Buffer平衡镍柱，最大流速150cm/h。将目的蛋白全部上样完成之后用3体积柱的Washing Buffer清洗杂蛋白，最后用5ml的Elution Buffer洗脱目的蛋白(图4)。

重组毒素pET-32a(+)-NbX4浓度测定

采用考马斯亮蓝法测定目的蛋白浓度。将5×G250稀释成1×。将1×G250与目的蛋白以及PBS混合，按照4：1的比例。设置技术重复，在595nm测定吸光值。将测得吸光值带入牛血清标准曲线计算样品中的蛋白质含量，该实验中NbX-4浓度为2255μg/ml。

实施例2

生测的过程和方法

采用显微注射法测定了重组毒素NbX-4对朱砂叶螨的杀虫活性，选取个头大小相似的成螨，每个处理3个重复，每个重复选取30-50头朱砂叶螨成螨，注射前，先将螨饥饿处理12h，并将其四肢朝上整齐的固定摆放在0.02％的琼脂上。为了注射螨的过程中有受力点，通常会在琼脂制作过程中放置玻璃毛细管，使其靠在针旁。每头成螨大约注射重组毒素10nl，注射部位与生殖孔平齐，侧面靠背部区域。注射结束后，将螨挑至提前制作好的叶碟上，整个过程要轻柔，减少对螨的二次伤害。实验共分为对照组和实验组，对照组注射PBS，实验组注射重组毒素NbX-4。图1是注射NbX-4的死亡率结果，显示出该毒液肽有较好的杀虫活性。图2为注射CK和重组毒NbX-4后，二斑叶螨(红)的死亡表型。同时为了确定注射该毒液肽的致死中浓度LD

表1：NbX4对朱砂叶螨的毒力测定

注：卡方值(χ

表2：不同浓度下NbX-4对朱砂叶螨成虫的致死率

序列表

<110> 西南大学

<120> 巴氏新小绥螨杀螨肽NbX-4及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 186

<212> PRT

<213> 巴氏新小绥螨杀螨肽(Neoseiulus barkeri)

<400> 1

Met Glu Arg Leu Val Pro Phe Glu Ile Ile Leu Gly Leu Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ser Ala Leu Pro Ala Ser Leu Glu Pro Leu Pro Thr Gly Gln Ser Val

20 25 30

Leu Leu Gln Gln Leu Leu Glu Gly Arg Glu Asp Ser Leu Gln Thr Phe

35 40 45

Glu Glu Glu Ala Tyr Glu Thr Cys Arg Arg Tyr Val Ala Leu His Asp

50 55 60

Ala Gly Arg Ala Val Ala Ser Gln Ala Phe Gln Ala Gly Ser Ser Arg

65 70 75 80

Glu Ala Thr Ser Leu Met Gln Ala Asp Glu Glu Glu Pro Pro Gln Gly

85 90 95

Ala Asn Leu Ala Arg Asp Ile Arg Arg Pro Pro Ser Arg Ala Arg Thr

100 105 110

Leu Ser Tyr Arg Gly Gln Gly Glu Glu Gly Asp Phe Gly Gly Ser His

115 120 125

Asp Ala Thr Arg Ile Val Thr Ser Lys Lys Arg Ser Cys Ile Arg Arg

130 135 140

Gly Gly Ser Cys Asp Ala Arg Pro Ser Asp Cys Cys Tyr His Ser Ala

145 150 155 160

Cys Arg Cys Asn Leu Trp Gly Thr Asn Cys Arg Cys Met Arg Met Gly

165 170 175

Leu Leu Arg Arg Trp Ile Asn Gly Lys Arg

180 185

<210> 2

<211> 561

<212> DNA

<213> 巴氏新小绥螨杀螨肽(Neoseiulus barkeri)

<400> 2

atggagaggc tggtgccttt tgaaattatt cttggactct tcttgctctc ggcgttgccc 60

gcaagtctcg aaccgttgcc gaccggccaa agtgtgttgc tccaacagct gctagaagga 120

cgtgaagata gcctccagac gttcgaggaa gaagcttacg aaacctgcag acgatatgtt 180

gctctccacg atgccggtag agccgtggcc agtcaagcat ttcaagcagg atcttcgcgc 240

gaagcaacga gtttaatgca ggctgacgag gaggagcctc cacaaggagc aaaccttgct 300

agagacatca ggagaccacc atcgcgagct cggactctgt cgtaccgcgg gcaaggtgaa 360

gaaggtgatt tcggaggctc tcacgacgcg acccggatcg tcacttcgaa aaaacggagc 420

tgtatccgac gtggaggttc gtgtgacgca aggccgagcg actgctgcta tcattcagcg 480

tgcagatgca atttgtgggg cacaaactgc cgatgtatgc gcatgggcct cctgcggagg 540

tggatcaacg gcaagcgcta a 561

<210> 3

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Ser Cys Ile Arg Arg Gly Gly Ser Cys Asp Ala Arg Pro Ser Asp

1 5 10 15

Cys Cys Tyr His Ser Ala Cys Arg Cys Asn Leu Trp Gly Thr Asn Cys

20 25 30

Arg Cys Met Arg Met Gly Leu Leu

35 40

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggagctgta tccgacgtgg aggttcgtgt gacgcaaggc cgagcgactg ctgctatcat 60

tcagcgtgca gatgcaattt gtggggcaca aactgccgat gtatgcgcat gggcctcctg 120