一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法

摘要

本发明的一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法，包括(1)在畜禽粪便中加入混合标准工作液，静置；(2)加入乙酸乙腈溶液，涡旋、超声、震荡、离心提取；(3)加入乙腈饱和的正己烷，除去脂类物；取提取清液转移至提前装有50mg PSA和50mg C

说明书

技术领域

本发明属于畜禽粪便中微量有机污染物质残留检测技术领域，涉及一种用于畜禽粪便中抗菌药检测的方法，特别涉及一种分散固相萃取前处理结合超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)，能够高效处理并同时检测畜禽粪便中8种抗球虫药的方法。

背景技术

自我国发布“禁抗”行动以来，促生长类的抗菌药完全被禁止使用。但是在减抗和禁抗的背景下，难免有不法份子利用此特性造成抗球虫药的滥用。此外，畜禽养殖过程中球虫病的预防必不可少，抗球虫药的联合和穿梭使用，不按规定用药等都会造成此类药物的蓄积。抗球虫药很少被吸收，大多以原型排出体外，规模化养殖场的粪便大多用于农作物的灌溉，药物的残留就会随之进入生态环境。畜禽粪便机制本身是一种复杂的环境样品，有效的样品提取和净化是准确测定其中抗球虫含量的前提。因此，畜禽粪便中残留的多种抗球虫药的同时测定方法研究尤为重要。

目前，传统的抗球虫药的检测方法主要为酶联免疫吸附测定法、免疫层析试纸法及毛细管电泳法等，酶联免疫吸附测定法稳定性差，免疫层析试纸法和毛细管电泳法虽然快速且效率高，但是检测样品相对单一。因此在一定程度上制约了畜禽粪便中抗球虫药残留研究的进展。

超声萃取、HLB固相萃取柱净化前处理结合超高效液相色谱串联质谱技术UPLC-MS/MS具有应用范围广、分离效率高、特异性强和灵敏度高等优点，目前已成为有机物预处理和分析的重要方法之一。但现有的超声萃取、HLB固相萃取柱净化前处理结合超高效液相色谱串联质谱用于畜禽粪便中抗球虫药的检测时，大多由于提取方法、提取溶剂选用不合适，或固相萃取前处理条件、液相色谱条件和/或质谱条件选择不当，或多或少存在着检测结果不稳定、干扰多、检测抗生素数量和回收率有限等问题。

发明内容

本发明的目的旨在通过构建超高效液相方法检测畜禽粪便中莫能菌素、盐霉素、氯苯胍、磺胺喹噁啉、氯羟吡啶、地克珠利、尼卡巴嗪和二硝托胺的含量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法，采用超声萃取-分散固相萃取前处理结合超高效液质联用技术同时检测畜禽粪便中8种抗球虫药物，具体包括以下步骤进行：

(1)在2g±0.01g畜禽粪便中加入按需称取0.1-250μg/kg的混合标准工作液，混匀，静置20min，待提取；

(2)加入5mL 2％乙酸乙腈溶液，涡旋1min，超声10min，震荡20min，10000rpm离心10min，充分提取两次，合并两次提取清液，待净化；

(3)加入等比的乙腈饱和的正己烷，除去溶解在提取液中的脂类物质；再取步骤2中合并后的清液转移至提前装有50mg PSA和50mg C

(4)取净化后的2mL溶液置于玻璃管中，吹干，用1mL甲醇-含0.1％甲酸水5：5溶液复溶，将其置于-20℃2h，4℃冷冻离心，10000rpm离心5min，经0.22μm滤膜过滤，待检测；

(5)使用Agilent 1260高效液相色谱系统进行分析，色谱分离选用ACQUITY

其质谱条件：电喷雾电离正离子模式为Electrospray ionization positivemode,ESI+/负离子模式为Electrospray ionization negative ion mode,ESI-，多反应监测模式为Multiple-reaction monitoring，MRM；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：30V；离子源和离子化溶剂温度分别为150℃和500℃；离子化气体流量：1000L/h；锥孔气流速50L/h；去溶剂气体为氮气，碰撞气体为氩气。

所述标准工作液为称取0.01g二硝托胺、盐霉素和莫能菌素对照品，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解配制成1mg/mL的标准储备液；分别称取0.01g氯羟吡啶、尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉、氯苯胍和地克珠利对照品，置于10mL容量瓶，用1mL二甲基亚砜完全溶解后用乙腈定容至10mL配制成1mg/mL的标准储备液；标准储备液置于-20℃避光保存，有效期6个月。将标准储备液稀释后，分别准确移取1mL于10mL容量瓶中用色谱乙腈定容，配制成100μg/mL的标准工作液，于-20℃避光保存，有效期1个月。根据需要用色谱甲醇-含0.1％甲酸水溶液8:2逐级稀释配成50、20、10、5μg/mL的标准工作液，现配现用。

所述ACQUITY

所述梯度洗脱程序为0.1％甲酸水A和甲醇B：10％B，0～2min；10％～80％B，2～6min；80％～95％B，6～8min；95％B，8～9min；95％～10％B，9～10min。

所述8种目标分析物为莫能菌素、盐霉素、氯苯胍、磺胺喹噁啉、氯羟吡啶、地克珠利、尼卡巴嗪和二硝托胺。

本发明旨在建立一种新的、简便的、重复性好的超高效液相色谱串联质谱检测法快速测定畜禽粪便中8种抗球虫药的分析方法。

附图说明

图1是不同提取液的对抗球虫药物的提取回收率的影响；

其中：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。

图2是不同净化条件对鸡粪便中抗球虫药物的净化影响；

其中：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。

图3是添加浓度为100ng/kg的空白粪便和空白粪便提取液的典型色谱图；

其中：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。A1,A2列：空白鸡粪便，B1,B2列:对应的鸡粪便。

图4是抗球虫药在鸡粪便基质中的稳定性；

其中：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明加以说明。

实施例：一种液相色谱质谱法测定畜禽粪便中抗球虫药含量的方法，采用超声萃取-分散固相萃取DSPE前处理结合超高效液质联用技术同时检测鸡粪便中8种抗球虫药物，包括以下步骤：准确称取2g±0.01g鸡粪便中加入按需称取0.1-250μg/kg的混合标准工作液，混匀，静置20min，待提取。加入5mL 2％乙酸乙腈溶液，涡旋1min，超声10min，震荡20min，10000rpm离心10min，充分提取两次，合并两次提取清液，待净化。加入等比的乙腈饱和的正己烷，除去溶解在提取液中的脂类物质。再取上述溶液转移至提前装有50mg PSA和50mg C

所述标准工作液为称取0.01g二硝托胺、盐霉素和莫能菌素对照品，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解配制成1mg/mL的标准储备液；分别称取0.01g氯羟吡啶、尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉、氯苯胍和地克珠利对照品，置于10mL容量瓶，用1mL二甲基亚砜完全溶解后用乙腈定容至10mL配制成1mg/mL的标准储备液；标准储备液置于-20℃避光保存，有效期6个月。将标准储备液稀释后，分别准确移取1mL于10mL容量瓶中用色谱乙腈定容，配制成100μg/mL的标准工作液，于-20℃避光保存，有效期1个月。根据需要用色谱甲醇-含0.1％甲酸水溶液8:2逐级稀释配成50、20、10、5μg/mL的标准工作液，现配现用。

所述梯度洗脱程序为0.1％甲酸水A和甲醇B：10％B，0～2min；10％～80％B，2～6min；80％～95％B，6～8min；95％B，8～9min；95％～10％B，9～10min。

本发明是通过以下实验得出的：

1、溶液及样品制备：

(1)标准储备液1mg/mL：称取0.01g盐霉素和莫能菌素对照品，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解配制成1mg/mL的标准储备液；分别称取0.01g氯羟吡啶、尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉、氯苯胍和地克珠利对照品，置于10mL容量瓶，用1mL二甲基亚砜完全溶解后用乙腈定容至10mL配制成1mg/mL的标准储备液；标准储备液置于-20℃避光保存，有效期6个月。

(2)标准工作液100μg/mL：将上述标准储备液稀释后，分别准确移取1mL于10mL容量瓶中用色谱乙腈定容，配制成100μg/mL的标准工作液，于-20℃避光保存，有效期1个月。根据需要用色谱甲醇-含0.1％甲酸水溶8:2液逐级稀释配成50、20、10、5μg/mL的标准工作液，现配现用。

(3)乙腈饱和的正己烷：取乙腈和正己烷充分震荡混匀，上层为饱和的正己烷。

(4)样品的制备：粪便样品采自贵州省某养殖场，采用五点取样法，经检测均无目标药物。样品冷冻干燥，粉碎过筛，置于自封袋编号备用。

2、仪器条件的优化

(1)液相色谱条件

色谱柱是影响目标物色谱峰分离和保留主要因素之一，C

(2)质谱条件

获取母离子和子离子的最佳响应，由于毛细管电压和碰撞能量对离子的丰度影响较大，直接影响方法的灵敏度，因此通过调节二者可获得最佳灵敏度。为了找到本试验目标药物最佳离子对，制备了200μg/L的8种药物混合标准工作液，直接进入质谱注射泵进行MS扫描，该过程完全按照欧盟2002/657/EC指令规定，标准要求在MRM模式进行定量和定性，为了满足质谱4个点的要求，至少需要1个母离子和2个子离子。不断优化毛细管电压寻找出响应最佳的母离子，再逐步优化其余质谱参数，通过调节碰撞能量，以响应最佳和干扰最小的子离子作为定量离子。8种抗球虫药的最佳质谱参数如表1所示。

表1、八种抗球虫药物的质谱参数

注：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺，*定量离子。

3、提取液的优化

鸡的肠道较短，摄入的饲料不能完全消化吸收，40％～70％排出体外，导致鸡粪便的成分比较复杂，其中含有大量的碳水化合物、粗蛋白、脂肪、纤维、含氮、磷和钾等成分。此类成分对目标药物的提取会造成严重的干扰，不同试剂因极性和性质不同，提取出的物质成分也不同，所以选择合适的提取液可以避免部分杂质的溶解，同时可有效提取目标药物。其中甲醇、乙腈和乙酸乙酯常被用于抗球虫药物的提取。本试验比较了三种提取液，结果如图1所示，乙酸乙酯的提取效果最差多数药物回收率低于60％，甲醇和乙腈提取回收率相当，但是经检测发现甲醇提取的结果杂质较复杂，干扰比起乙腈要多，这可能跟两者的极性有关，甲醇的极性大于乙腈，更易溶解酯类物质。综上，试验选择乙腈作为提取液，但是个别药物如尼卡巴嗪和氯苯胍等的提取率相对较低。尼卡巴嗪在酸性溶液中更易溶解，同时氯苯胍和聚醚类药物分解后会带负电荷更易溶于酸性溶液中，所以在乙腈中加入乙酸为提高目标物的提取率。结果如图1所示，当增加值2％的乙酸时回收率均大于80％满足检测需求，为了保护仪器和检测柱不再增加酸的浓度。最终确立2％乙酸乙腈作为提取试剂。

4、净化条件优化

固相萃取在兽药残留检测中常被用于样品的前处理，目的为了除去提取试剂中的各类杂质，减少杂质对目标物的干扰以及对仪器的损害。分散固相萃取是近年来国际上最常用于产品检测的快速样品前处理技术，该方法简便、快捷效果较好。本试验比较了不同SPE小柱含HLB、C18和碱性氧化物铝柱及DSPE对抗球虫药物净化后回收率的影响。在不同SPE柱的选择过程中，研究了甲醇、甲酸甲醇和乙酸乙酯等洗脱试剂，结果均显示对目标物的净化回收率不理想，原因可能是8种抗球虫药物的理化性质差异过大，某些药物在固相萃取柱中不保留，某些则可能无法从柱上洗脱。除此外，SPE法过程复杂耗时长，固相萃取柱价格昂贵。相比下，DSPE所用的试剂和计量按照1mL提取液用50mg PSA+50mg C

5、方法验证

(1)标准曲线和线性范围

标准曲线的绘制，按照上述方法对粪便样进行前处理得到空白基质，向其中加入混合标准工作液，配制成0.05、0.1、1、5、20、50和100μg/L共8个浓度的基质加标溶液，每个浓度点3个平行取平均值，以x轴药物浓度μg/L，y轴为离子峰面积，列回归方程，r2为相关系数，当r

(2)回收率与精密度

2g空白粪便中加入混合标液，配制低25ng/kg、中100ng/kg和高500ng/kg三个浓度水平的加标样品，每个浓度6个平行，按照上述方法进行前处理，做三个批次(间隔一天或数天)。分别计算各浓度下8种抗球虫药物的回收率和精密度，结果如表2所示。从表中可以看出，8种抗球虫药物在鸡粪便中的平均回收率在74.4％～100.1％之间，批内和批间变异系数分别在1.7％～10.3％和4.9％～12.3％之间。该方法准确度及精密度良好。表明该方法具有较高的准确度和精密度，能够满足粪便中多种抗球虫药含量检测要求。

表2、粪便中8种抗球虫药物的添加回收率和精密度(n＝6)

(3)选择性

运用上述试验创建好的前处理方法和仪器方法，对鸡粪便空白基质加标样品和空白基质进行检测，结果显示在目标药物出峰时间±2.5％范围内无干扰峰出现，同时目标分离度好，峰形尖锐，重现性好则表明本方法具有特异选择性。

(4)检测限LOD和定量限LOQ

将混合标准工作液加入不同的空白样品中，配制成低浓度加标样品，按照上述方法前处理，检测。得到粪便样品中8种抗球虫药物的检测限和定量限，结果见表3，可知8种药物的LOD和LOQ分别为0.03～2μg/kg和0.1～5μg/kg。

表3、八种抗球虫药的标准曲线和相关系数、线性范围、检测限、定量限

注：X表示ELSD色谱峰面积的对数值；y表示检测药物浓度μg/mL

(5)稳定性

研究按照上述的方法下对鸡粪便样品进行处理，制备成浓度为250ng/L的基质加标溶液，分别置于4℃和25℃的条件下，分别在第1、3、5、7、9、11和14天取样检测分析。结果如图4所示，在4℃时8种抗球虫药物均能保持较好的稳定性没有发生降解。但是在25℃时从第3天开始除了地克珠利以外均出现了明显的降解。地克珠利的降解半衰期可能长达半年以上，所以其在常温中比较稳定。综上所述，目标药物在提取后需要保存在低温中，或者尽快上机检测，确保结果的准确性。

运用建立的UPLC检测方法对各养殖场鸡粪便样品进行检测。本方法简单、灵敏和可靠，可快速测定鸡粪便样品中8种抗球虫药，可用于实际鸡粪便样品中氯羟吡啶、二硝托胺、磺胺喹恶啉、氯苯胍、尼卡巴嗪、地克珠利莫能菌素和盐霉素的日常检测和监测。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。