液相色谱质谱法测定养殖场周围环境水中抗球虫药的方法

摘要

本发明公开了一种液相色谱质谱法测定养殖场周围环境水中抗球虫药的方法，是基于超高效液相色谱串联质谱法测定养殖场及周边环境水中化学合成类和离子载体类中8种抗球虫药物的分析方法，先将环境水样品经冷冻干燥，残渣用甲醇‑0.1％甲酸水8:2溶液复溶，过膜上机检测；以甲醇和0.1％甲酸水溶液为流动相经ACQUITY

说明书

技术领域

本发明属于环境水中抗球虫类药物检测方法的构建，具体地涉及鸡养殖场附近环境水的莫能菌素、盐霉素、氯羟吡啶、二硝托胺、磺胺喹恶啉、氯苯胍、尼卡巴嗪和地克珠利的含量检测。

背景技术

作为允许添加在饲料中的药物，抗球虫药有提高饲料利用率，降低继发疾病风险，促生长等作用，部分不法商家利用此特性谋取利益，滥用抗球虫药。许多一线养殖人员对药物残留危害的意识薄弱，为保证鸡群不发病，大量使用抗球虫药物造成球虫耐药性居高不下，还造成了药物残留。此外，抗球虫药大多以原型排除体外，粪便被用作肥料施入农田，粪便中的抗球虫药物会污染地表水或地下水，或是养殖废水直接排入河流、湖泊，或是直接用于农田灌溉最终影响生态环境。抗球虫药物会被农作物和蔬菜吸收富集进入食物链，则抗球虫药物对人体的健康存在潜在的威胁。

养殖污水排入河流、湖泊或农田是抗球虫药物污染环境的重要途径，污水中活性物质成分复杂，药物在多种活性成分共同作用下会增强药物对生物的毒性。目前，环境水中药物残留的分析方法主要通过进行富集再结合高效液相色谱串联质谱法测定。要实现固相萃取柱同时富集多种药物，必须要有适合的固相萃取柱，致使目标物涉及多种聚醚类和化学合成类药物，其理化性质存在较大差异，要使所有目标分析物均得到高回收率非常困难。同时，该方法操作步骤多，固相萃取小柱价格较高，在活化、净化和洗脱过程中使用大量有机试剂，不符合绿色化学原则。相反，使用冷冻干燥保藏法简称冻干法能使目标物长期维持原有状态，结构和性质不会发生改变，目标物损失少，因此常被用于非挥发性药物的残留检测。冻干法对样品进行前处理时目标药物损耗少，检测限低，且操作简单，不需要用有机试剂，符合环保理念，适用于环境水基质中的药物分析。目前关于抗球虫药物在水样品中的检测方法未见报道，基于冻干法结合超高效液相色谱串联质谱法建立环境水中抗球虫药残留检测方法，并运用到实际鸡养殖场污水及周边环境水样中抗球虫药的检测是我们研究方向。

发明内容

本发明的目的在于通过构建超高效液相色谱串联质谱法环境水中莫能菌素、盐霉素、氯羟吡啶、二硝托胺、磺胺喹恶啉、氯苯胍、尼卡巴嗪和地克珠利的含量。

本发明的目的是采取以下技术方案达到的：

液相色谱质谱法测定养殖场周围环境水中抗球虫药的方法，包括以下步骤：

(1)用0.45μm的微孔滤膜过滤去除环境水悬浮的颗粒物，置于-20℃避光保存；

(2)将样品完全解冻取40mL水样于100mL聚乙烯离心管中，加入混合的 8种标准工作液，涡旋混匀，至于-80℃冷冻；冻干机提前预冷，冷肼温度-85℃，真空度为小于20bar，将冷冻完全的水样至于冷冻干燥机中，冻干72h；

(3)冻干后，残渣用2mL甲醇-0.1％甲酸水8:2溶液复溶，充分涡旋，超声10min，过0.22μm微孔滤膜置于进样瓶中，上机检测；

(4)使用Agilent 1260高效液相色谱系统进行分析，色谱分离选用 ACQUITY

(5)质谱条件为电喷雾电离正离子模式即Electrospray ionization positivemode,ESI+/负离子模式即Electrospray ionization negative ion mode,ESI-，多反应监测模式即Multiple-reaction monitoring，MRM；毛细管电压为3.00kV；锥孔电压为30V；离子源和离子化溶剂温度分别为150℃和500℃；离子化气体流量为1000L/h；锥孔气流速50L/h；去溶剂气体为氮气，碰撞气体为氩气；参见8种目标分析物的质谱参数分析结果；

所述8种目标分析物为莫能菌素、盐霉素、氯羟吡啶、二硝托胺、磺胺喹恶啉、氯苯胍、尼卡巴嗪和地克珠利。

所述ACQUITY

所述环境水包括鸡养殖场污水、养殖场周边池塘水和养殖场周边湖水，构建方法前预检测均不含8种目标药物。

所述的混合标准工作液：首先制备标准储备液，称取0.01g二硝托胺、盐霉素和莫能菌素对照品，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解配制成1mg/mL的标准储备液；分别称取0.01g氯羟吡啶、尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉、氯苯胍和地克珠利对照品，置于10mL容量瓶，用1mL二甲基亚砜(DMSO)完全溶解后用乙腈定容至10mL配制成1mg/mL的标准储备液；置于-20℃避光保存，有效期6个月。其次制备标准工作液：将上述标准储备液稀释后，分别准确移取1mL于10mL 容量瓶中用色谱乙腈定容，配制成100μg/mL的标准工作液，于-20℃避光保存，有效期1个月。根据需要用色谱甲醇-0.1％甲酸水8:2溶液逐级稀释配成50 μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的标准工作液，现配现用。

本发明旨在建立新的、敏捷、高效的抗球虫药物多残留检测方法快速测定环境水中的八种抗球虫药物残留的分析方法。

附图说明

图1是冻干体积的优化。

(注：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉， CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。)

图2是复溶液优化。

(注：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺，A 甲醇-0.1％甲酸水(8:2,v/v)，B甲醇-0.1％甲酸水(5:5,v/v)，C甲醇-0.1％甲酸水(2:8,v/v)，D甲醇-0.1％甲酸水(1:9,v/v)。)

图3是添加浓度为250ng/L的空白养殖场污水和空白养殖场污水提取液的典型色谱图。

(注：A1,A2列：空白污水图，B1,B2列：对应的污水基质加标；MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶， DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。)

图4是8种抗球虫药在水样基质中的稳定性。

(注：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉，CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺。)

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明加以说明。

一种液相色谱质谱法测定养殖场周围环境水中抗球虫药的方法，包括以下步骤：环境水包括鸡养殖场污水、养殖场周边池塘水和养殖场周边湖水，构建方法前预检测均不含本次试验的目标药物。用0.45μm的微孔滤膜过滤去除悬浮的颗粒物，置于-20℃避光保存。将样品完全解冻取40mL水样于100mL聚乙烯离心管中，加入混合标准工作液，涡旋混匀，至于-80℃冷冻。冻干机提前预冷，冷肼温度-85℃，真空度为小于20bar，将冷冻完全的水样至于冷冻干燥机中，冻干72h。冻干后，残渣用2mL甲醇-0.1％甲酸水8:2溶液复溶，充分涡旋，超声10min，过0.22μm微孔滤膜置于进样瓶中，上机检测。使用Agilent 1260 高效液相色谱系统进行分析，色谱分离选用ACQUITY

本发明是通过以下实验得出的：

1.溶液及样品制备：

(1)标准储备液1mg/mL：称取0.01g二硝托胺、盐霉素和莫能菌素对照品，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解配制成1mg/mL的标准储备液；分别称取 0.01g氯羟吡啶、尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉、氯苯胍和地克珠利对照品，置于10mL 容量瓶，用1mL二甲基亚砜(DMSO)完全溶解后用乙腈定容至10mL配制成1 mg/mL的标准储备液；置于-20℃避光保存，有效期6个月。

(2)标准工作液100μg/mL：将上述标准储备液稀释后，分别准确移取1 mL于10mL容量瓶中用色谱乙腈定容，配制成100μg/mL的标准工作液，于- 20℃避光保存，有效期1个月。根据需要用色谱甲醇-0.1％甲酸水8:2溶液逐级稀释配成50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的标准工作液，现配现用。

乙腈饱和的正己烷：取乙腈和正己烷充分震荡混匀，上层为饱和的正己烷。

(3)样品的制备：环境水包括鸡养殖场污水、养殖场周边池塘水和养殖场周边湖水，构建方法前预检测均不含本次试验的目标药物。实际样品采于贵阳市某养殖场及附近。采样时将聚乙烯瓶多次润洗后装取水样，编号，冷藏运输。用 0.45μm的微孔滤膜过滤去除悬浮的颗粒物，置于-20℃避光保存。

2、液相色谱和质谱条件的优化

(1)液相色谱的优化

色谱柱是影响目标物色谱峰分离和保留主要因素之一，C18作为常用的色谱柱填料能满足大多数的药物分离，Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱柱效、峰形对称性和化学稳定性较好，因此选其作为分析柱。药物进入系统后通过流动相洗脱，本试验根据离子信号增强、灵敏度、色谱峰形状，选择了0.1％甲酸水和甲醇作为流动相，同时优化了洗脱梯度。

(2)质谱条件的优化

获取母离子和子离子的最佳响应，由于毛细管电压和碰撞能量对离子的丰度影响较大，直接影响方法的灵敏度，因此通过调节二者可获得最佳灵敏度。研究发现碰撞能量过高会导致母离子的碎片过多，同时导致子离子响应过低；反之过低的碰撞能量，子离子则无法生成，毛细管电压的优化有利于得到更稳定的化合物响应。为了找到本试验目标药物最佳离子对，制备了200μg/L的8种药物混合标准工作液，直接进入质谱注射泵进行MS扫描，该过程完全按照欧盟 2002/657/EC指令规定，标准要求在MRM模式进行定量和定性，为了满足质谱4 个点的要求，至少需要1个母离子和2个子离子。不断优化毛细管电压寻找出响应最佳的母离子，再逐步优化其余质谱参数，通过调节碰撞能量，以响应最佳和干扰最小的子离子作为定量离子。8种抗球虫药的最佳质谱参数如表1所示。

表1、八种抗球虫药物的质谱参数

注：MON为莫能菌素，SAL为盐霉素，ROB为氯苯胍，SQX为磺胺喹噁啉， CLOP为氯羟吡啶，DZL为地克珠利，NIC为尼卡巴嗪，DIN为二硝托胺，*定量离子。

3、冻干体积优化

比较不同的冻干体积20、30、40和50mL对目标药物回收率的影响，结果如图1所示。冻干体积过大，冻干的时间相对较长，会导致莫能菌素、地克珠利和氯苯胍等药物的降解；然而，冻干体积过小则检测限过高，由于水体中的药物残留含量为微量或痕量，综合考虑，最终将冻干体积定为40mL。

4、复溶液的优化

冷冻干燥后的样品，需要合适的复溶液将冻干后残渣中的药物溶出。本试验比较了甲醇和乙腈为复溶液对目标物回收率的影响，结果表明两者溶解回收率相当，鉴于流动相为甲醇，同时甲醇较乙腈价格低，因此使用甲醇作为复溶液。由于流动相的起始比例为10％有机相和90％水相，为了避免纯有机溶剂带来的基质干扰，试验比较了甲醇和0.1％甲酸水不同比例时对目标物的复溶效果，结果如图2所示。当甲醇比例较低时目标药物难以溶出导致回收率较低，虽然甲醇- 0.1％甲酸水8:2,v/v溶液，甲醇-0.1％甲酸水5:5溶液两者之间的回收率相差不大，但是从基质效应和经济效益的角度考虑最终选择甲醇-0.1％甲酸水5:5溶液为复溶液。

5、方法验证

(1)标准认定在目标药物出峰时间±2.5％范围内无干扰峰出现，目标分离度好，峰形尖锐则表明该方法具有特异选择性。本专利对不同来源的水样品(养殖场污水、池水和湖水)进行处理，得到对应的空白基质加标样品和空白基质，运用上述已经构建好的方法进行分析检测，各检测药物结果均满足要求，本试验建立方法具有特异性。

(2)标准曲线与线性范围

按照实验步骤1前处理方法对不同来源的水样品(养殖场污水、池水和湖水) 进行处理，得到不同来源的环境水样品的基质匹配标准曲线，结果如表2所示，目标药物在0.01μg/L～100μg/L浓度范围内，线性良好，相关系数均大于0.99，可以满足抗球虫药物的残留分析检测要求。

(3)回收率和精密度

40mL空白样品中加入混合标液，配制成低(50ng/L)、中(250ng/L)和高 (500ng/L)三个浓度水平的加标样品，每个浓度6个平行，按照1方法进行前处理，做三个批次间隔一天或数天。分别计算各浓度下8种抗球虫药物的回收率和精密度，结果如表3所示。8种抗球虫药物在三种环境水中的批内回收率在 73.2％～109.1％之间，批间回收率在71.9％～108.2％之间，批内和批间变异系数分别在0.8％～10.3％和1.5％～15.8％之间，r

表2、8种目标物的线性方程、相关系数、检测限与定量限

注：X表示ELSD色谱峰面积的对数值；y表示检测药物浓度(μg/mL)

(4)检测限和定量限

将混合标准溶液加入不同的空白样品中，配制成浓度逐级降低的低浓度加标样品，按照1方法进行前处理和检测，得到三种环境水样品中8种抗球虫药物的检测限和定量限，结果如表2所示，8种药物的检测限和定量限分别为0.005～10μg/L和0.01～25μg/L，检测限低，能满足环境水中痕量抗球虫药物残留分析要求。

(5)稳定性

本专利选择了成分复杂的养殖场内污水为分析对象最具代表性，在1的方法下对样品进行处理，制备成浓度为250ng/L的基质加标溶液，分别置于4℃和25℃的条件下，分别在第1、3、5、7、9、11和14天时进行分析。结果如图4所示。在4℃保存的药物其浓度没有多少变化，而在25℃时药物浓度从第二第三天就已经开始降解，8种药物中地克珠利的降解最慢。采样后建议低温保存，尽快处理检测。

表3、三种环境水样中8种药物的批内和批间回收率和精密度

运用冷冻干燥法对鸡养殖场污水及其周边环境水样品进行前处理，结合超高效液相色谱串联质谱法建立了一种简单、快速、灵敏和可靠的水样中八种抗球虫药物的多残留检测方法。该方法操作便捷、经济环保，前处理过程中目标药物损耗少，并且能同时分析多种化学性质不同的药物，可用于实际养殖场环境水中莫能菌素、盐霉素、氯羟吡啶、二硝托胺、磺胺喹恶啉、氯苯胍、尼卡巴嗪和地克珠利的日常检测和监测。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。