一种促进骨再生的复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥

摘要

本发明提供一种促进骨再生的复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥。本发明将三斜钙磷石和无定形磷酸钙粉末按不同质量比例混合，然后加入去离子水制成复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥，探究最佳三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥配比。本发明的复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥具有凝固时间短、无放热反应、降解速度慢，可促进骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨，不利于破骨细胞的增殖、迁移和破骨，在一定程度上可抑制破骨细胞在骨缺损早期对骨和CPC吸收的作用。本发明三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥的可注射性、凝固时间和力学性能均满足临床应用要求。

说明书

技术领域

本发明属于骨水泥技术领域，涉及一种复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥及其制备方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

外伤、肿瘤、炎症等骨病引起的大面积骨缺损，往往为临界尺寸骨缺损，无法单纯依靠骨组织自身的再生能力进行修复，需要自体骨、异种骨或骨修复材料修复骨缺损。由于自体骨的提取会给患者带来额外的伤害，异种骨容易引起免疫排斥反应，因此人工骨修复材料的应用越来越多。羟基磷灰石和磷酸三钙等磷酸钙类材料在骨科中得到了广泛的研究和应用。与上述磷酸钙类材料相比，三斜钙磷石(monetite，MC)虽然具有优异的自固化能力和生物学特性，但合成过程不够稳定，对其生物学特性的研究还不够深入。三斜钙磷石呈现出连续的降解曲线并表现出持续的体内吸收行为。这提供了通过植入物再吸收形成新骨组织而不影响植入物的机械稳定性的可能性。基于三斜钙磷石的合成骨修复材料已被植入身体不同部位骨缺损的动物模型中，这些研究证实了三斜钙磷石具有骨传导性甚至骨诱导的潜力。无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate，ACP)的研究比较成熟。由于无定形磷酸钙的非晶性和不稳定性，与其他磷酸钙类材料相比，它具有更高的降解性和更丰富的微观外观。无定形磷酸钙在水存在下自发结晶形成与人体骨骼的无机成分非常相似的磷酸钙类材料(通常是羟基磷灰石纳米颗粒)。同时,无定形磷酸钙的簇状、非刚性结构可以容纳多种外来离子，其数量和种类比其他磷酸钙类材料晶格要多。无定形磷酸钙不稳定，在潮湿条件下易转化，降解迅速，这是其缺点。

如上所述，三斜钙磷石和无定形磷酸钙都各有长处，它们的弱点可以互补，但目前还没有研究将三斜钙磷石和无定形磷酸钙混合用作新的磷酸钙类骨水泥，并且三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥对小鼠骨髓间充质干细胞的增殖、迁移、成骨分化和RAW 264.7细胞的增殖、迁移、破骨细胞分化的影响也没有研究。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种新型磷酸钙骨水泥，即复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥，并找出最适宜实际应用的三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥的组成。本发明将三斜钙磷石和无定形磷酸钙粉末按不同比例混合，然后加入去离子水制成复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥。本发明的复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥具有凝固时间短、无放热反应、降解速度慢，可促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨，不利于破骨细胞的增殖、迁移和破骨，在一定程度上可抑制破骨细胞在骨缺损早期对骨和磷酸钙类骨水泥吸收的作用。本发明三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥的可注射性、凝固时间和力学性能均满足临床应用要求。

具体的，本发明的实施技术方案如下：

本发明第一方面，提出一种复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥。所述复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥的组分包括三斜钙磷石和无定形磷酸钙。进一步的，所述三斜钙磷石质量分数为25-75％，优选为75％。

本发明第二方面，提出上述复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据一定质量比例称取三斜钙磷石和无定形磷酸钙粉体；

(2)通过非介入式均质机将上述粉体混合均匀；

(3)将混合均匀的粉体按照一定的固液比与去离子水混合均匀。

进一步的，所述无定形磷酸钙粉体通过使用CaCl

更进一步的，无定形磷酸钙粉体通过使用CaCl

进一步的，所述三斜钙磷石采用Ca(NO

更进一步的，三斜钙磷石纳米纤维采用Ca(NO

进一步的，步骤(2)中，混合条件为：转速为800r/min，时间为60s，次数为6-9次。

进一步的，固液比为0.6-1.0，优选为固液比为0.5。

本发明第三方面，提出上述复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥的应用方法，包括如下步骤：

(1)用针管将复合三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥注入到圆柱形模具中，得到骨水泥块体；

(2)随后将块体放置于恒温培养箱中，对骨水泥块体进行养护；

(3)将养护后的骨水泥块体取出干燥备用。

进一步的，所述圆柱形模具的尺寸为10mm×10mm。

进一步的，养护温度为37℃，养护湿度为100％，养护时间为72h。

一般聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥凝固时间很快，但注射后在体内有大量放热反应，会损伤周围组织，冷却后会出现骨水泥块收缩，与周围骨质贴合不紧密。而三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥作为一种新型磷酸钙骨水泥，凝固时间更适合临床应用，且无放热反应，骨水泥块降解速度慢，与周围骨质贴合更紧密，更有利于骨质生长。

普通磷酸钙自固化性能一般都比较差，β-磷酸三钙不会自固化，α-磷酸三钙自固化性能比三斜钙磷石差，而无定形磷酸钙和三斜钙磷石是磷酸钙中自固化性能最强的，可注射性最高的，三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥比前两者的性能都要好，说明他们的可注射性和自固化性能比一般磷酸钙类骨水泥更优秀。并且，三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥较现有技术中骨水泥的凝固时间更短，更适合在临床手术中使用。同时，三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥的降解特性更有利于修复骨缺损后骨的再生。

本发明一个或多个实施例中有以下有益效果：

本发明的三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥的凝固时间更适合临床应用，孔隙率较无定形磷酸钙、磷酸三钙等常用磷酸钙骨水泥低，这使其抗压强度更强，其体外降解也是可持续的缓慢降解，并且生物学实验也证明，无论从细胞增殖、细胞迁移、还是本复合骨水泥对成骨和破骨活动的影响，三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥，尤其是三斜钙磷石75，相比于其他磷酸钙骨水泥而言，具有更好的力学、降解性能，尤其拥有优异的生物学性能，因此可以成为现有磷酸钙骨水泥更好的替代材料。本发明三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥的可注射性、凝固时间和力学性能均满足临床应用要求。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥XRD成分分析和SEM形貌图。

图2为三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥初凝时间、终凝时间、可注射性、抗压强度测试结果图。

图3为三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥生物降解的XRD结果、孔隙率图。

图4为三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥在SBF中浸泡的表面形貌变化和降解变化图。

图5和图6为三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥对小鼠骨髓间充质干细胞黏附、增殖、迁移和成骨分化的影响

图7和图8为三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥对小鼠RAW264.7细胞黏附、增殖、迁移和破骨分化的影响

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1

三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥的制备

以三斜钙磷石、无定形磷酸钙粉体为原料，制备磷酸钙复合骨水泥，具体步骤如下：

(1)无定形磷酸钙粉体通过使用CaCl

(2)三斜钙磷石纳米纤维采用Ca(NO

(3)根据不同质量比例(无定形磷酸钙质量分数为0％、25％、50％、75％、100％)，称取三斜钙磷石和无定形磷酸钙粉体，制备成的复合骨水泥分别命名为三斜钙磷石100(含0％无定形磷酸钙)(MC100)、三斜钙磷石75(含25％无定形磷酸钙)(MC75)、三斜钙磷石50(含50％无定形磷酸钙)(MC50)、三斜钙磷石25(含75％无定形磷酸钙)(MC25)、无定形磷酸钙(含100％无定形磷酸钙)(ACP)；

(4)通过非介入式均质机将上述粉体混合均匀，混合条件为：转速为800r/min，时间为60s，次数为6-9次；

(5)将混合均匀的骨水泥粉体按照一定的固液比与去离子水混合均匀，用针管注入到10mm×10mm圆柱形模具中，得到骨水泥块体；

(6)随后将块体放置于恒温培养箱中，在温度37℃和湿度100％的条件下对骨水泥块体进行养护，养护时间为72h；

(7)将养护后的骨水泥块体取出干燥备用。

物相表征方法

本发明利用X射线衍射仪(X-ray Diffraction,XRD,DMAX-2500PC)对样品进行物相成分分析。测试条件：样品测试前充分研磨过筛、干燥，以CuKα(λ＝0.1542nm)为辐射源，加速电压为45kv，电流为150mA，扫描速度为10°/min。

利用傅里叶红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR,Nicolet is 50)手段对样品进行红外光谱分析。测试条件：样品测试前需充分研磨过筛、干燥，以样品与溴化钾比例1：100，将两者充分混合均匀，压制成透明薄片，放入机器内进行测试。

利用热重分析仪(Thermogravimetric Analysis,TG,HTC-4)，来分析样品在升温过程中的重量变化以研究样品物相变化。测试条件：升温区间为20-1000℃，升温速率10℃/min，气氛为空气。

形貌表征方法

本发明利用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM,SU-70)，观察样品表面形貌。测试条件：样品测试前需充分干燥，粉末需充分研磨，粘至贴好导电胶的样品台上，喷金以解决其导电性问题后，进行观察，发光单晶为钨单晶，测试电压为15kV。

利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM,Talos F200S)观察样品纳米尺度形貌。测试条件：样品测试前需在无水乙醇中超声1h，分散完全后，吸取上清液滴在铜网上，完全干燥后移入透射电镜观察。

粉体性能表征方法

本发明利用纳米粒度分析仪(Nano-particle Analyzer,ZS90)进行粉体的粒径及粒径分布测定。测试条件：样品测试前需充分研磨过筛，按照固液比1：5000，将样品分散在无水乙醇中，充分超声震荡后，离心，吸取上清液1-2ml进行测试。

利用比表面积与微孔分析仪(BSD-PM1)对样品粉体比表面积、孔径、孔容进行测试。测试条件：测试前样品需充分研磨过筛，在60℃下干燥24h，称量0.1-0.2g样品进行测试。

力学性能表征方法

本发明主要测定样品抗压强度以表征其力学性能。利用万能试验机(CMT5105)测试样品的抗压强度。测试条件：样品测试前需打磨平整，长径比≥2。同时测量样品的实际受力面积，根据公式(1)计算其抗压强度：

式中，σ表示抗压强度，F表示最大载荷值，S表示实际受力面积。

本发明利用阿基米德排水法，对样品的气孔率进行测定，具体步骤如下：

(1)将样品放入真空干燥箱，在60℃下干燥24h，称量其重量，记为m

(2)将样品放入装有去离子水的烧杯中，利用油浴锅将其加热至沸腾，保持沸腾1h后，迅速放入另一装有去离子水的烧杯，称量其在水中的重量，记为m

(3)将样品取出，轻轻擦除其表面水分，称量其重量，记为m

(4)最后，根据公式(2)算出样品的气孔率。

式中，P为样品气孔率，m1,m2,m3已给出。

骨水泥性能表征方法

本发明利用Gilmore双针法测定不同液相含量的磷酸钙骨水泥的初凝、终凝时间。分别使用轻针(m＝113.4±0.5g)测定骨水泥的初凝时间T1，重针(m＝453.6±0.5g)测定骨水泥的终凝时间Tf。测试使使针尖处于一定高度，然后垂直于样品表面自由坠落，当针尖无法在样品表面留下明显痕迹时，记录下样品的初凝时间与终凝时间。

细胞培养

自干细胞公司购买C57小鼠的初代骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)，并在含10％FBS及1％青霉素/链霉素双抗的DMEM/F12完全培养基中进行传代和培养。细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每三天进行细胞传代，隔天更换一次培养基。

自细胞公司购买C57小鼠的初代巨噬细胞样细胞系(RAW264.7)，本细胞系可分化为破骨细胞，是破骨细胞的前体细胞，并在含10％FBS及1％青霉素/链霉素双抗的DMEM高糖完全培养基中进行传代和培养。细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每两天进行细胞传代。

细胞形貌

用于与小鼠骨髓间充质干细胞共培养的样品先在体外模拟体液中浸泡14天，用于与RAW264.7细胞共培养的样品无需浸泡，将经过紫外线消毒处理的各组样品置于24孔板中，小鼠骨髓间充质干细胞RAW264.7经消化、离心、重悬、细胞计数后，以1×10

细胞增殖检测

使用CCK-8试剂测定小鼠骨髓间充质干细胞及RAW264.7的增殖水平。将经过紫外线消毒处理的各组样品置于24孔板中，并设置一个不放入样品的空白对照组。细胞经消化、离心、重悬、细胞计数后，以1×10

细胞凋亡检测

将细胞在放置好样品的6孔板中培养7天后，收集培养基中的细胞和贴壁细胞。用annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Vazyme，中国南京)检测细胞的凋亡。收集的细胞用PBS洗涤，并在1000rpm，5min，4℃下离心两次。然后向每个试管中添加100μL 1×结合缓冲液以重新悬浮细胞。此外，将5μL V-FITC和5μL PI添加到每个试管中，然后在室温下在避光孵育10分钟。最后，在检测前向每管中加入400μL 1×结合缓冲液。用流式细胞检测仪(cytoflex，美国)进行检测。

免疫荧光染色检测

用免疫荧光法评估小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化性能及RAW264.7的破骨分化性能。RAW 264.7细胞与5组样品在核因子-κB配体受体激活剂(RANKL)的诱导下培养7天，小鼠骨髓间充质干细胞与5组样品在成骨诱导培养基诱导下培养14天。使用4％多聚甲醛在4℃环境中固定20分钟，0.2％Triton X-100室温环境中透膜处理20分钟。室温下，将样品置于山羊血清中封闭30分钟。随后，用2μg·mL-1的OCN一抗(1:100)在4℃环境中孵育过夜。第二天用FITC标记的山羊抗兔二抗溶液中浸泡1小时，随后，在室温下用TRITC标记的鬼笔环肽染色20分钟，用PBS洗3遍，然后用DAPI(0.5μg·ml-1)染色20分钟，用PBS清洗3遍。最后在高速转盘共聚焦显微镜(Dragonfly 200，美国)下观察。

Transwell细胞迁移能力检测

将细胞重新消化、离心并悬浮在无血清培养基中，按照每孔8×103个细胞将其接种到含有8μm小孔滤膜的Transwell小室的上室中。下室加入含10％FBS的培养基，并在底部置入各组样品。培养24小时后，用PBS清洗滤膜上表面的细胞，并用棉签擦拭，用甲醇固定下表面的细胞，并用0.5％结晶紫染色。在光学显微镜(Lecia，德国)下观察细胞迁移，并在高倍视野下拍摄照片。细胞迁移能力通过每个高倍视野中的平均细胞数来估计。

细胞基因表达检测

为检测不同组样品的组分和微纳复合结构对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因及RAW264.7破骨分化相关基因的表达水平的影响，采用实时荧光定量多聚酶链式反应(RT-qPCR)检测小鼠骨髓间充质干细胞中COL-1、Runx-2、OCN及RAW264.7中Ctsk、c-Fos的表达情况。RAW 264.7细胞与5组样品在RANKL诱导下培养7天，小鼠骨髓间充质干细胞与5组样品在成骨诱导培养基诱导下培养14天。培养7天后首先，使用RNA快速抽提试剂盒从细胞中提取总RNA，经过浓度测定后，定量从各组样品所提取的RNA中吸取1μg RNA对应体积的液体，然后用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒(TOYOBO，日本)将RNA逆转录为cDNA，最后使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，日本)为染料，在快速实时PCR反应系统(Biorad，美国)中进行PCR的反应及实时监测，并读取数据。所得结果采用相对定量比较法(2-ΔΔCT)处理分析。所用引物的序列如表所示。

表1所用引物序列

细胞蛋白表达检测

将RAW264.7细胞和小鼠骨髓间充质干细胞分别接种于5组样品表面，加入诱导剂培养7天后提取细胞蛋白。首先，制备RIPA和PMSF混合的裂解液，将裂解液加入细胞中，然后在冰上裂解30分钟。并将细胞裂解物收集到EP管中，在4℃下以12,000rpm离心20分钟。之后，使用BCA试剂盒(Beyotime，上海，中国)测量蛋白质浓度，并将等量的蛋白质与上样缓冲液混合。通过电泳和膜转移将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，Millipore，德国)。然后将PVDF膜用Quick block溶液(Beyotime，上海，中国)封闭15分钟。之后，将PVDF膜分别与RUNX2和Ctsk一抗在4℃下孵育过夜，然后在室温下二抗孵育1小时。最后，通过化学发光HRP底物(Millipore，Germany)观察蛋白质水平并通过ImageJ进行分析。各组对应的靶蛋白灰度值和内参GAPDH分别用ImageJ测量，测量3次。目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值之比即为本组目的蛋白的相对表达水平。

数据分析

所有实验的每个变量至少设置三个独立重复实验，实验数据均表示为平均值±标准差(SD)。Transwell每组取5个高倍镜视野并进行细胞计数，细胞增殖检测每次检测每组取3个吸光度值，RT-qPCR每组3个Ct值，采用单因素方差分析方法，利用GraphPad Prism 9软件对差异进行分析。统计分析的显著性水平设为*P<0.05，当**P<0.01时认为差异非常显著。

三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥的表征

磷酸钙骨水泥水化后，由于其自固化特性，其成分和形态会发生很大变化。因此，本发明分别探讨了水化前后骨水泥块样品的组成和形态。图1A显示了不同原料粉比的三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥块在水化前(图1A(a))和水化后(图1A(b))的XRD成分分析。纯三斜钙磷石和三斜钙磷石75水化前后的XRD图谱变化不大，三斜钙磷石50和三斜钙磷石25也有微小变化。然而，水化前后无定形磷酸钙的XRD图谱发生了显着变化，其特征在于水合后存在宽的结晶峰。

图1B为SEM观察到的骨水泥块水化前后的表面形貌，其中(a)和(b)行为水化前的表面和横截面形貌，(c)和(d)行为水化后的表面和横截面形貌。各组的表面形貌和横截面形貌在水化前后均发生了变化。三斜钙磷石100、三斜钙磷石75和三斜钙磷石25水化后表面出现长纤维，三斜钙磷石25的长纤维连接成片状。三斜钙磷石50表面多为短棒状纤维。三斜钙磷石100在水合前的横截面呈纳米棒分布，而水合后的纳米棒则转变为棒状和薄片状。水合前无定形磷酸钙的横截面呈纳米颗粒形式，水合后纳米颗粒结合在一起形成相对致密的内部形貌，但与其他四组相比，表面和断面都相对松散。水化前的三斜钙磷石25、三斜钙磷石50、三斜钙磷石75内部为纳米棒和纳米颗粒的混合形态，随着无定形磷酸钙添加量的增加，纳米棒逐渐减少，纳米颗粒逐渐增加。同样，随着无定形磷酸钙的增加，水化后的三斜钙磷石75、三斜钙磷石50和三斜钙磷石25的截面也越来越致密，其中三斜钙磷石25的截面是5组中最光滑、最致密的。

图2A、B和C显示了不同液固比的三斜钙磷石100、三斜钙磷石50、无定形磷酸钙的初凝和终凝时间。液固比为0.8、0.9、1时三斜钙磷石100的平均初凝时间分别为15min、11min、9min，均大于8min，平均终凝时间为35min、27min、21min，均大于15min。当液固比达到0.7时，三斜钙磷石100骨水泥的初凝时间为6min，终凝时间为15min，可以满足实际应用要求。当液固比降至0.5和0.6时，骨水泥的初凝时间小于3min，终凝时间小于15min，此时凝固过快。

图2D显示了三斜钙磷石100、三斜钙磷石50和无定形磷酸钙的可注射性。从总体趋势来看，在不同液固比下，无定形磷酸钙的可注射性最好，其次是三斜钙磷石50，三斜钙磷石100的可注射性最差。当液固比为0.7时，三斜钙磷石50的可注射性与无定形磷酸钙相当。

图2E显示了不同添加量无定形磷酸钙的磷灰石基骨水泥在水化前(a)和水化后(b)的抗压强度测试结果。三斜钙磷石100、三斜钙磷石75、三斜钙磷石50、三斜钙磷石25、无定形磷酸钙的水化前抗压强度分别为1.08MPa、1.10MPa、1.01MPa、1.00MPa和0.77MPa。三斜钙磷石100、三斜钙磷石75、三斜钙磷石50、三斜钙磷石25、无定形磷酸钙的水化后抗压强度分别为0.8MPa、1.29MPa、1.4MPa、1.67MPa和1.19MPa。

不同液固比和不同组的孔隙率如图3B所示。与不同的液固比相比，随着液固比从0.6增加到0.8，样品的孔隙率逐渐增加，最高为1。在液固比相同的情况下，比较不同组间的孔隙度，可以发现孔隙度从低到高依次为三斜钙磷石25、三斜钙磷石50、三斜钙磷石75、无定形磷酸钙、三斜钙磷石100。三斜钙磷石75的孔隙率低于无定形磷酸钙和三斜钙磷石100，但高于三斜钙磷石50和三斜钙磷石25。

体外降解表征

图3A显示了体外浸泡在体外模拟体液中的三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥的生物降解的XRD结果。三斜钙磷石100的XRD图谱中，最强的峰是三斜钙磷石相的(020)晶面，另外还有(030)晶面峰，第7天、第14天、第21天和第28天没有差异，也没有出现羟基磷灰石的特征衍射峰(图3A(a))。无定形磷酸钙的XRD图如图3A(e)所示，表现为羟基磷灰石的特征衍射峰(211)和(300)。而与三斜钙磷石和无定形磷酸钙复合的骨水泥的三斜钙磷石75和三斜钙磷石50只出现了三斜钙磷石的(020)和(030)衍射峰，没有出现羟基磷灰石的衍射峰。

在SBF中浸泡7、14、21和28天的五组样品的表面形貌变化显著(图4A)。三斜钙磷石100的纳米棒逐渐转变为块状颗粒，表面逐渐变平，浸泡28天后块状颗粒消失，取而代之的是微小颗粒。三斜钙磷石75在第7天和第14天表面形貌非常致密，在第21天，三斜钙磷石75表面呈细长纤维不规则排列形成的网格状形态，出现大小不一的孔洞结构。这种形貌使三斜钙磷石75的表面粗糙不平。继续浸泡第28天，发现三斜钙磷石75的纤细纤维逐渐长成薄片，虽然保留了小孔，但大的孔洞基本消失。三斜钙磷石50在第7天表面比其他四组更平整，然后在第14天出现孔洞较大的片状形貌。随着浸泡时间的增加，片状纤维和孔洞消失，而表面逐渐变得平坦而紧密。第7天，三斜钙磷石25表面形成细小的棒状纤维，浸泡21天后，三斜钙磷石25表面出现大孔，大孔内壁分布着微孔，有利于诱导成骨，在第28天，形成了由小颗粒组成的平坦表面。无定形磷酸钙在第7天形成了带有小孔的网格状结构，但这种形态在第14天和第21天消失了，最后在第28天形成了大量的片状形态。

三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥的生物相容性

加入CCK-8溶液并孵育2小时的混合物在450nm处的吸光度值代表细胞增殖活性，吸光度值越高，细胞增殖能力越强。各组吸光度从第1天、第4天到第7天呈上升趋势(图5D和图7D)。对于小鼠骨髓间充质干细胞，各组的吸光度均高于无细胞培养样品的对照组，说明各组样品均无对小鼠骨髓间充质干细胞的细胞毒性。三斜钙磷石75的小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力在第4天和第7天最高，其次是三斜钙磷石50和三斜钙磷石25，无定形磷酸钙略低于三斜钙磷石50和三斜钙磷石25，三斜钙磷石100与无定形磷酸钙相似(图5D)。对于RAW264.7细胞，三斜钙磷石100的吸光度值在对照组和其他组中最高。三斜钙磷石50和三斜钙磷石25的吸光度值接近且无统计学意义，三斜钙磷石75略低于它们。无定形磷酸钙的吸光度值低于对照组，说明无定形磷酸钙的显微形态或化学成分可以抑制RAW264.7细胞的增殖(图7D)。

酒精梯度脱水处理后，获得SEM图像，观察不同样品中细胞的粘附和形态。大量细胞和丰富的伪足表明样品促进了细胞粘附。如图6A所示，三斜钙磷石75和三斜钙磷石50上的小鼠骨髓间充质干细胞呈多边形，伪足较多，无定形磷酸钙的伪足相对前两者较少。然而，三斜钙磷石100上的小鼠骨髓间充质干细胞呈纺锤形，缺乏伪足。如图8A所示，

三斜钙磷石75和无定形磷酸钙中RAW 264.7细胞数量较少，细胞不丰满。三斜钙磷石50和三斜钙磷石25细胞数量逐渐增多，细胞铺展面积增大，伪足相互接触融合。三斜钙磷石100细胞数量不断增加，细胞扩散面积增加，发生细胞间融合，说明其更有利于RAW264.7细胞的粘附、增殖和破骨细胞分化，从而加速溶骨过程。

三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥对细胞迁移能力的影响

图5E和图7E显示了通过膜到达Transwell小室膜下表面的的细胞的图像和平均数量。三斜钙磷石100组小鼠骨髓间充质干细胞数量在5组中最少，细胞形态不丰满，未充分伸展。三斜钙磷石75、无定形磷酸钙、三斜钙磷石50比三斜钙磷石100细胞多，细胞扩散面积大。三斜钙磷石75在细胞数量和细胞形态方面在各组中都是最佳的，表明它对小鼠骨髓间充质干细胞迁移能力的促进作用最强(图5E)。三斜钙磷石75组RAW 264.7细胞数量在5组中最少，说明三斜钙磷石75在5组中最不利于RAW 264.7细胞的迁移(图7E)。

三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

在图5A中，三斜钙磷石75的小鼠骨髓间充质干细胞中成骨相关基因如胶原蛋白1(COL-1)、骨钙素(OCN)和runt相关转录因子2(RUNX2)(表1)的表达均显着高于对照组和其他4组。三斜钙磷石100、三斜钙磷石50、三斜钙磷石25、无定形磷酸钙的mRNA表达均不同程度高于对照组。IF染色检测成骨诱导培养基培养14天的小鼠骨髓间充质干细胞中OCN蛋白表达的结果也支持了上述观点(图6B)。三斜钙磷石75的OCN荧光强度最强，三斜钙磷石75的细胞数和细胞铺展面积在5组中最大。这表明在成骨诱导培养基的诱导下，三斜钙磷石75更有利于小鼠骨髓间充质干细胞的生长和成骨分化。

三斜钙磷石/无定形磷酸钙骨水泥对RAW 264.7细胞破骨分化的影响

RAW 264.7细胞中破骨分化相关基因组织蛋白酶K(Ctsk)和c-Fos(Tab.1)的相对表达量如图7A所示。三斜钙磷石100的mRNA表达量显着最高，相对表达量为对照组的1.5倍以上。三斜钙磷石75的相对mRNA表达最低，小于对照组的0.75倍。三斜钙磷石50、三斜钙磷石25与对照组接近，无定形磷酸钙略低于对照组，但三者与对照组相比无统计学差异。通过IF染色检测培养7天的RAW 264.7细胞中Ctsk蛋白表达的结果也支持了上述观点(图8B)。三斜钙磷石100、三斜钙磷石50和三斜钙磷石25的Ctsk比三斜钙磷石75和无定形磷酸钙具有更强的荧光强度，且细胞数多于三斜钙磷石75和无定形磷酸钙。

从上述实验可知，三斜钙磷石/无定形磷酸钙复合骨水泥复作为一种新型复合骨水泥，比已在临床应用的无定形磷酸钙、磷酸三钙和三斜钙磷石相比，拥有更好的自固化性能、力学性能、降解性能，尤其是拥有更有利于骨再生的生物学性能。本研究表明，与75wt.％三斜钙磷石和25wt.％无定形磷酸钙复合的三斜钙磷石75具有最佳的表面形貌和材料组成，可促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和成骨，不利于破骨细胞的增殖、迁移和破骨，在一定程度上可抑制破骨细胞在骨缺损早期对骨和磷酸钙类骨水泥吸收的作用。三斜钙磷石75的可注射性、凝固时间和力学性能均满足临床应用要求，但与三斜钙磷石25相比仍有一些不足。考虑到材料本身的特性和生物学特性，三斜钙磷石75更适合作为理想的复合骨水泥。

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