一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法及应用

摘要

本发明提供了一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法及应用，其中，一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法，包括采用高效液相色谱法对五味子供试品溶液进行测定获得具有木脂素类成分特征峰的特征图谱，以五味子醇甲作为内参物，采用一测多评法建立五味子醇甲与其他木脂素类成分之间的相对校正因子，通过校正因子计算其他木脂素类成分的含量。本发明的方法实用性强、操作简单、节约成本，试验结果准确可靠，弥补了现有五味子质量控制方法的不足，从而为五味子药材及饮片的质量控制与质量评价提供新思路和参考。

说明书

技术领域

本发明涉及中药质量控制领域，具体涉及一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法及应用。

背景技术

五味子(习称“北五味子”)，为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁等省，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，常用于治疗久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠等，是一味具有重要治疗价值的常用中药。目前，从五味子中已分离出多种有效成分，其中木脂素类化合物是其发挥作用的主要有效成分，研究发现其对消化、中枢神经、心血管、内分泌以及免疫系统均有疗效，具有保护心血管、调压降脂、保肝护酶、消炎抗癌、改善记忆力和改善睡眠以及提高免疫力等多种药理作用。

由于植物化学成分的复杂性，多指标含量测定已经成为植物来源药物质量控制的共识。目前，越来越多的国内外植物药标准将多指标含量测定收录其中。然而，在多指标含量测定方法实施的过程中，对照品消耗量大，检测操作难度高，严重制约了该方法的推广应用，并成为制约药用植物的质控及其产业发展的瓶颈问题。而一测多评法(QAMS法)是通过测定中药中一种代表性成分的含量，依据相对校正因子推算该中药中多种待测成分含量，并控制计算值与实测值符合定量方法学要求的一种多指标同步质量控制方法。该方法由于具有节约标准品、结果准确可靠等特性，在许多中药的质量评价研究中得到推广和应用。

目前，2020年版《中国药典》五味子质量标准含量测定项下仅以五味子醇甲含量为检测指标，无法全面控制五味子质量，因此，有必要研究一测多评法在五味子中的应用，针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，达到在更少对照品用量的情况下，有效准确测量出更多木脂素类成分含量的目的。

发明内容

因此，本发明提供了能在更少对照品用量的情况下，有效准确测量出五味子中更多木脂素类成分的含量的一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法及应用。

一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法，采用高效液相色谱法对五味子供试品溶液进行测定获得具有木脂素类成分特征峰的特征图谱，以五味子醇甲作为内参物，采用一测多评法建立五味子醇甲与其他木脂素类成分之间的相对校正因子，通过校正因子计算其他木脂素类成分的含量；

所述高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：220-254nm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：

所述色谱柱的柱温为25-35℃，流速0.8-1.2ml/min。

所述柱温为35℃，所述检测流速为1ml/min。

所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm，检测波长为250nm；

所述供试品溶液的进样量为5-20μl，优选为10μl。

所述木脂素类成分包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素。

所述五味子供试品溶液的制备过程为：取五味子供试品，加入溶剂混合均匀后，密塞，称定重量，超声处理，冷却后再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤后获得滤液，滤液即为供试品溶液。

所述超声处理的功率250W，频率50kHz；超声处理的时间为30min。

所述溶剂为正己烷。

上述一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法在五味子质量控制与评价中的应用。

进一步，本发明通过一测多评法检测出的木脂素类成分总含量判断五味子的质量等级；所述判定规则为：一等药材的木脂素类成分总含量≥0.90％，二等药材的木脂素类成分总含量≥0.70％。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明采用高效液相色谱法进行测定，利用一测多评法实现同时测定五味子中四种木脂素类成分含量。以使用广泛的五味子醇甲作为内参物进行一测多评，建立五味子醇甲与五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素之间的相对校正因子，通过校正因子计算五味子中五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量；本发明的方法实用性强、操作简单、节约成本，试验结果准确可靠，弥补了现有五味子质量控制方法的不足，从而为五味子药材及饮片的质量控制与质量评价提供新思路和参考。

2.本发明首次将五味子一测多评测定结果与五味子等级之间进行关联分析，找出规律，从而制订出了更科学合理的五味子药材等级标准；具体的，本发明通过一测多评法检测出的木脂素类成分总含量判断五味子的质量等级；所述判定规则为：一等药材的木脂素类成分总含量≥0.90％，二等药材的木脂素类成分总含量≥0.70％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为混合标准品的HPLC色谱图，图中1为五味子醇甲；2为五味子醇乙；3为五味子甲素；4为五味子乙素。

图2所示为五味子药材的HPLC色谱图，图中1为五味子醇甲；2为五味子醇乙；3为五味子甲素；4为五味子乙素。

具体实施方式

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

仪器：LC-10AT VP高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SSI Series 1500高效液相色谱仪(美国科学系统公司)；KQ5200台式超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；DV215CD电子天平(OHAUS公司)；CP214电子天平(奥豪斯仪器常州有限公司)。

试药：五味子醇甲对照品(批号：110857-201211，纯度：99.9％)、五味子甲素对照品(批号：110764-201312，纯度：99.6％)、五味子乙素对照品(批号：110765-201512，纯度：99.0％)均由中国食品药品检定研究院提供；五味子醇乙对照品(批号：58546-54-6，纯度≥98％)，由成都植标化纯生物技术有限公司提供。

试剂：乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。

药材：25批五味子药材分别购自吉林、黑龙江、辽宁三省，按照国药联材字84第72号文附件《七十六种药材商品规格标准》的等级标准划分为一等1-2号、5-6号、8-9号、11号、13-16号、18号、20号，二等3-4号、7号、10号、12号、17号、19号、20-25号(一等：表面紫红色或红褐色，肉厚，干瘪粒不超过2％；二等：表面黑红、暗红或淡红色，肉较薄，干瘪粒不超过20％)。以上五味子药材经鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill的干燥成熟果实。

实施例1

一测多评法测定五味子中木脂素类成分含量的方法，包括：

1、色谱条件

色谱柱：Vision HT C18 HL柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，梯度洗脱程序见下表1:

表1流动相梯度洗脱程序表

流速：0.8ml·min

2、溶液的制备

2.1混合对照品溶液：精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，用甲醇配制成浓度分别为0.5045、0.1590、0.1305、0.2856mg/ml的溶液，即得。

2.2供试品溶液：取五味子药材的粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入正己烷25ml，称重，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，称重，加正己烷补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3、色谱图的获取

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得；供试品溶液及混合对照品溶液的色谱图见图1-2所示。

4、方法学考察

4.1线性关系的考察：

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml、2.4ml，分别置5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系列混合对照品溶液，按“1”项下色谱条件进样测定。以各成分峰面积(A)对进样量(μg)进行回归处理，进样量(μg)＝进样体积×对照品浓度，结果见下表2。

表2线性关系考察结果

证明本发明的色谱条件检测出的对照品的峰面积和浓度之间存在线性关系。

4.2精密度试验：

取同一供试品溶液10μl，连续6次进样测定，记录峰面积，结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为1.65％、1.70％、1.57％、1.86％(n＝6)，表明仪器精密度良好。

4.3稳定性试验：

取同一供试品溶液10μl，分别于制备后0、2、4、6、8、24h时进样测定，记录峰面积，结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为0.56％、2.36％、0.59％、0.38％(n＝6)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

4.4重复性试验：

分别称取同一批次五味子药材6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算4种成分的含量及其RSD值，结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的平均含量分别为0.527％、0.148％、0.126％、0.340％，RSD分别为1.43％、1.81％、0.96％、1.97％(n＝6)，表明方法重复性良好。

4.5加样回收率试验：

在已知含量的五味子药材粉末中，定量加入混合对照品溶液5ml(含五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素分别为1.269、0.371、0.305、0.836mg)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算各成分加样回收率及其RSD值，结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的平均加样回收率分别为100.6％、100.8％、100.0％、100.4％，RSD分别为1.64％、1.74％、1.49％、1.53％(n＝6)，表明该方法的加样回收率结果良好。

5、校正因子的建立

5.1校正因子的计算：

随机选择7批次的五味子供试品溶液，以五味子醇甲为内参物，根据相对校正因子计算公式(f

表3 3种待测组分的相对校正因子(n＝7)

结果表明不同批次之间校正因子的差异较小，可以用于五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量换算。

5.2校正因子重现性考察试验

考察了下表4中的2种不同品牌的高效液相色谱仪和4种不同品牌的色谱柱(规格均为250mm×4.6mm，5μm)对校正因子f

表4不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

结果表明不同高效液相色谱仪和不同色谱柱对校正因子影响较小，该方法重现性良好。

5.3待测色谱峰的定位

以五味子醇甲为内参物，考察了五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素在2种不同品牌高效液相色谱仪和4种不同品牌色谱柱条件下相对保留时间值的稳定性，其RSD均小于2.0％，结果表明不同仪器和不同色谱柱对五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的相对保留时间值无显著影响。

6、不同批次样品含量测定

6.1 1～10号样品含量测定：

取1～10号五味子样品，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，按“1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，分别采用一测多评法(QASM法)和外标法(ESM法)测定含量，并将所得结果进行对比，结果见表5。

表5 1～10批五味子药材含量测定结果对比表

上表5中一测多评法(QASM法)和外标法(ESM法)测定含量的RSD均小于2.0％，结果表明一测多评法计算值与外标法实测值之间无明显差异，有效证明本发明一测多评法对五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量测定的准确性。

实施例2

本实施例中公开的是五味子药材木脂素含量与等级之间的相关性分析及其在药材等级评价中的应用，具体如下：

1、采用实施例1中的一测多评法计算11～25号样品中其他木脂素类成分的含量

取11～25号五味子样品，按实施例1中“2.2”项下方法制成供试品溶液，按实施例1中“1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，采用一测多评法测定含量，结果见表6。

表6 11～25批五味子药材含量测定结果

2、木脂素类成分总含量在五味子药材等级评价中的应用

将上表5和6中木脂素类成分总含量结果与药材的等级进行对比，对比结果如下表7所示：

表7五味子药材含量测定结果与等级相关性分析

由上述表7可知，木脂素类成分总含量与药材等级之间存在关联，所有一等药材中四种木脂素类成分的含量总和均不小于0.90％，所有二等药材四种木脂素含量总和均不小于0.70％。因此，可以将上述木脂素类成分的含量总和应用于五味子药材等级评价中，以弥补其原有等级评价指标不足之处(仅有感官指标，无内在检测指标)。

同时，采用SPSS 22.0软件对上表7中五味子药材等级与木脂素含量(五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、四种木脂素含量总和)之间进行相关性分析，结果表明，五味子药材等级与四种木脂素含量总和、五味子醇甲含量、五味子醇乙含量、五味子乙素含量之间有相关性(P<0.05,P<0.01)。

通过上述检测结果显示，本发明检测方法实用性强、操作简单、节约成本，弥补了中国药典五味子含量测定项下仅测定单一组分五味子醇甲含量的不足，可以有效检测出五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素四种成分含量，全面提高五味子药材及饮片的质量检测水平。

同时，本发明也可以将木脂素类成分的含量总和应用于五味子药材等级评价中，从而为五味子药材的原料采购、制剂生产和临床应用提供更完善的评价依据。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。