中性粒细胞弹性蛋白酶活性的多肽抑制剂及其用途

摘要

本发明的特征在于包括纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI‑1)变体的多肽，其具有与玻连蛋白结合的能力降低，具有与PAI‑1清除受体LDL受体相关蛋白1(LRP1)相互作用的能力降低，并且在中性粒细胞胞外陷阱(NET)的存在下具有有效抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力。在一些实施方式中，本发明的多肽包括任选地与Fc结构域单体或部分融合的PAI‑1变体。本发明的特征还在于使用该多肽治疗以异常中性粒细胞弹性蛋白酶活性为特征的疾病和病症(例如，特发性肺纤维化)的药物组合物和方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年11月21日提交的美国临时申请号62/938,859的优先权和权益，其全部内容通过援引并入本文。

发明领域

本发明的特征在于包括纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)变体的多肽，其具有与玻连蛋白结合的能力降低，具有与PAI-1清除受体LDL受体相关蛋白1(LRP1)相互作用的能力降低，并且在中性粒细胞胞外陷阱(NET)的存在下具有有效抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的能力。在一些实施方式中，本发明的多肽包括任选地与Fc结构域单体或部分融合的PAI-1变体。本发明的特征还在于使用所述多肽治疗以异常中性粒细胞弹性蛋白酶活性为特征的疾病和病症(例如，特发性肺纤维化)的药物组合物和方法。

背景技术

特发性肺纤维化(IPF)是进行性和慢性肺疾病，其导致呼吸衰竭和死亡。IPF是进行性肺疾病最常见的死亡原因，并且全世界有约500万人受到影响。诊断后估计的中位生存期仅为3-5年(参见，Chakraborty et al.,(2014)Expert Opin Investig Drugs,23:893-910；Spagnolo et al.,(2015)Pharmacology&Therapeutics 152:18-27；Tzouvelekis etal.,(2015)Therapeutics and Clinical Risk Management 11:359-370；Lederer DJ andMartinez FJ.The New England journal of medicine.2018；378:1811-1823)。美国有大约130,000名IPF患者，估计每年诊断30,000至40,000例新病例(参见,Ley,B.,andCollard,H.R.2013.Epidemiology of idiopathic pulmonaryfibrosis.Clin.Epidemiol.5:483-492；Lynch,J.P.,III,et al.,2016.IdiopathicPulmonary Fibrosis:Epidemiology,Clinical Features,Prognosis,andManagement.Semin.Respir.Crit Care Med.37:331-357)。IPF的患病率范围为每100,000人14.0至42.7例病例，并且年发病率范围为每100,000人6.8至16.3例病例，取决于所采用的诊断标准的严格性(参见，Jones,M.G.,and Richeldi,L.Semin.Respir.Crit.CareMed.2016；37:477-484)。IPF的患病率随着年龄而增加，大多数IPF患者在诊断时已经60岁或甚至更大。该疾病在男性中比在女性中更常见(参见，Fernandez Perez E R et al.,(2010)Chest 137(1):129-137)，大多数患者是现在或以前的吸烟者。(参见，Jones,MG andRicheldi,L.,Semin.Respir.Care Med.2016,37:477-484)。

IPF的病因尚不清楚。然而，潜在因素诸如吸烟、灰尘暴露和感染剂已经与IPF的发展有关。IPF的特征在于由于上皮细胞和内皮细胞的凋亡、成纤维细胞增生和细胞外基质重塑导致肺结构的进行性和不可逆的扭曲(参见，Chakraborty et al.,(2014)Expert OpinInvestig Drugs,23:893-910)。随着间质纤维化的进展伴随着肺结构的扭曲，肺变得不那么顺应，增加了与呼吸相关的努力，导致呼吸困难。通常，肺功能会随着时间缓慢下降，但一些患者会经历快速下降，可能导致住院或死亡，尤其是在疾病的后期。

用于治疗IPF的药剂的开发进展缓慢。用于治疗IPF的前两种药剂吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(nintedanib)在2014年底才获得批准(参见，King et al.,(2014)N Engl J Med 370:2083-92；Richeldi et al.,(2014)N Engl J Med 370:2071-82；Richeldi,L,et al.,Am.J.Med.Sci.2019,357:370-373)。然而，这两种药剂具有仅有限的疗效和显著的副作用，并且需要复杂的给药方案。最近进行的吡非尼酮、西地那非(sildenafil)、波生坦(bosentan)、依那西普(etanercept)和干扰素γ-1b的3期临床试验未能证明其主要终点的疗效。N-乙酰半胱氨酸(NAC)、皮质类固醇和免疫抑制药物环磷酰胺和硫唑嘌呤是常用处方，但几乎没有证据表明使用这些药物可以改善患者预后或改变疾病的自然病程(参见，Collard H R et al.,(2004)Chest 125(6):2169-2174；Walter N etal.,(2006)Proc Am Thorac Soc 3(4):377-381)。肺移植是改善存活的唯一治疗，但大多数IPF患者由于年龄或合并症不适合移植。IPF患者通常采用以下项进行管理：支持性措施诸如咳嗽和呼吸困难的对症治疗、低氧血症的补充氧气、戒烟、肺康复以及呼吸道感染的预防和控制。

需要改进的治疗IPF的方法。

本发明解决了这种需要。

发明内容

虽然已确定纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)与靶酶的复合物与LDL受体相关蛋白1(LRP1)紧密结合，但这种相互作用的分子细节尚未明确定义。此外，文献中关于游离PAI-1与LRP1相互作用的性质存在相当大的争议。在开发本发明的实施方式的过程期间进行的实验中，检查了PAI-1与低分子量尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的复合物以及游离PAI-1与LRP1的结合。数据证实uPA:PAI-1复合物与LRP1结合的亲和力是单独PAI-1的～100倍高。PAI-1的化学修饰证实了PAI-1上的赖氨酸残基对于PAI-1和uPA:PAI-1复合物两者与LRP1的相互作用是基本要求。表面等离激元共振测量支持二价结合模型，其中PAI-1和uPA:PAI-1复合物上的多个位点与LRP1上的互补位点相互作用。结合的离子强度依赖性表明了用于PAI-1与LRP1相互作用的2个关键带电荷残基和用于uPA:PAI-1复合物与LRP1相互作用的3个带电荷残基的参与。uPA:PAI-1复合物的三个区域与LRP1上的LDLa重复的相互作用导致的增强的亲和力，为uPA:PAI-1复合物对LRP1的增加的亲和力提供了分子解释。突变分析揭示了LRP1结合与PAI-1的小分子抑制剂CDE-096(特异性PAI-1抑制剂)的结合位点之间的重叠，K207在PAI-1与LRP1的相互作用中以及K207、K88和K80在uPA:PAI-1复合物与LRP1的相互作用中具有重要作用。

在开发本发明实施方式的过程期间进行的实验阐明了PAI-1和蛋白酶:PAI-1复合物与LRP1的相对结合亲和力。另外，进行了实验以确定蛋白酶:PAI-1复合物与LRP1的结合是否主要归因于PAI-1上的决定子。另外，进行了实验以确定PAI-1与靶蛋白酶(尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA))复合物以及游离PAI-1中参与其与LRP1结合的特定氨基酸残基。事实上，突变分析揭示了LRP1结合与PAI-1的小分子抑制剂CDE-096的结合位点之间的重叠，K207在PAI-1与LRP1的相互作用以及K207、K88和K80在uPA:PAI-1复合物与LRP1的相互作用中具有重要作用。

IPF的特征在于间质瘢痕组织形成，其可显著限制肺功能。美国有大约130,000名IPF患者，估计每年诊断30,000至40,000例新病例(参见,Ley,B.,and Collard,H.R.2013.Epidemiology of idiopathic pulmonary fibrosis.Clin.Epidemiol.5:483-492；Lynch,J.P.,III,et al.,2016.Idiopathic Pulmonary Fibrosis:Epidemiology,Clinical Features,Prognosis,and Management.Semin.Respir.Crit Care Med.37:331-357)。诊断出IPF后的期望寿命通常为三至五年(参见,Lederer,D.J.and Martinez,F.J.,NEJM 2018,378:1811-1823)。除肺移植外，没有有效的治疗性治疗。缺乏阻止IPF进展的疗法呈现出重大挑战，并且是尚未满足的主要医疗需求。目前批准的两种药物吡非尼酮和尼达尼布已被证明减缓疾病进展，但它们不能阻止进展，并且不能恢复丧失的肺功能。因此，用于IPF治疗的新疗法对于疾病管理是必要的。

本发明通过提供包括能够抑制NE，并且尤其抑制结合在NET中的NE的突变体PA1-I多肽的组合物来解决这种需要。本文提供了能够抑制NE活性同时具有减弱与玻连蛋白和LRP1结合能力的PAI-1变体。实际上，在开发本发明的实施方式的过程期间进行的实验证明，这样的PAI-1变体通过经由修饰负责这种玻连蛋白结合的PAI-1氨基酸残基(例如R101A和Q123K)来抑制其与玻连蛋白结合的能力而具有治疗与NE活性相关的病症(例如IPF)的改善的疗效。

实际上，在开发本发明的实施方式的过程期间进行的实验利用了丝氨酸蛋白酶抑制物映射技术(serpin mapping technology)并鉴定了PA1-1的突变体形式(例如，在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V)作为NE抑制剂，其能够在NET环境中有效抑制NE。PA1-I的这种突变体形式被证明不可逆地抑制与DNA结合的NE(NET的主要组分)，其中FDA批准的人血浆来源A1AT商标Aralast是无效的。在某些实施方式中，PA1-I的这种突变体形式进一步与人IgG-Fc相关。

因此，本发明的特征在于包括PAI-1变体的多肽，该变体能够抑制NE活性，同时通过修饰其负责玻连蛋白结合的氨基酸残基(例如，R101A和Q123K)而具有减弱的与玻连蛋白结合的能力，并且通过修饰其负责LRP1结合的氨基酸残基(例如，K207、K88和K80)而引起改善的药代动力学(PK)，引起改善了治疗与NE活性相关的病症(例如IPF)的疗效。在一些实施方式中，本发明的多肽包括与Fc结构域单体或部分的N-或C-末端融合的PAI-1变体(例如，为了改善PK的目的)。在一些实施方式中，本发明的多肽包括与Fc结构域单体或部分的N-或C-末端融合的PAI-1变体。在一些实施方式中，Fc结构域单体或部分提高了多肽的稳定性或改善了多肽的药代动力学。

这样的部分可以通过氨基酸或其他共价键融合或连接，并且可以提高多肽的稳定性。包括与Fc结构域单体融合的PAI-1变体的多肽也可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)。在一些实施方式中，本文所述的多肽与Fc结构域单体连接，Fc结构域单体通过接头与多肽融合。在一些实施方式中，接头是氨基酸间隔物。

本发明的多肽可用于抑制NE活性并且可用于抑制结合在NET中的NE活性。另外，本发明的多肽可用于治疗患有以异常的NE活性为特征的病症(例如，IPF)的受试者。另外，本发明的多肽可用于防止受试者罹患以异常NE活性为特征的病症(例如，IPF)。此外，本发明的多肽还可用于影响具有发展或患有涉及异常NE活性的疾病或病症的风险的受试者中的NE活性。

在一些实施方式中，本发明的特征在于包括PAI-1变体的多肽，所述变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在一些实施方式中，PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的突变：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V，如SEQ ID NO:5中示出。在一些实施方式中，PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：R101A和Q123K。在一些实施方式中，PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ IDNO:3)内的以下突变：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V。在一些实施方式中，PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：I91L、R101A、Q123K、K207A、V343A、R346V。该突变体应具有延长的半衰期，特别是在Fc形式中，对NET中的NE具有完全的活性。

在一些实施方式中，本发明的特征在于包括与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体的多肽，所述变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在一些实施方式中，与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在一些实施方式中，与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：R101A和Q123K。在一些实施方式中，与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V(SEQ IDNO:7)。在一些实施方式中，与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：I91L、R101A、Q123K、K207A、V343A、R346V。

在一些实施方式中，本文所述的多肽能够抑制NE，并且尤其抑制结合在NET中的NE。

在一些实施方式中，本发明的特征在于编码本文所述多肽的核酸分子(例如，包括PAI-1变体的多肽,所述PAI-1变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在另一方面，本发明的特征还在于包括本文所述核酸分子的载体。

在另一方面，本发明的特征在于表达本文所述多肽的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包括前两个方面所述的核酸分子或载体，其中，所述核酸分子或载体在所述宿主细胞中表达。

在另一方面，本发明的特征在于一种制备本文所述多肽的方法，其中，所述方法包括：a)提供包括本文所述核酸分子或载体的宿主细胞，以及b)在允许形成所述多肽的条件下在所述宿主细胞中表达所述核酸分子或载体。

在另一方面，本发明的特征在于一种药物组合物，包括本文所述的多肽、核酸分子或载体以及一种或多种药学上可接受的负载体或赋形剂。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述多肽、核酸分子或载体处于治疗有效量。

在另一方面，本发明的特征还在于包括两个相同多肽的构建体(例如，同二聚体)，每个多肽包括PAI-1变体，所述PAI-1变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V，其中，所述变体与Fc结构域单体的N-或C-末端融合。两个多肽中的两个Fc结构域单体相互作用以在构建体中形成Fc结构域。

在另一方面，本发明的特征还在于包括两个不同多肽的构建体(例如，异二聚体)，每个多肽包括PAI-1变体，所述PAI-1变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变中的一种或多种的不同组合：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V，其中，两个变体与Fc结构域单体的N-或C-末端融合。两个多肽中的两个Fc结构域单体相互作用以在构建体中形成Fc结构域。

在另一方面，本发明的特征在于在此有需要的受试者中抑制NE活性的方法。在另一方面，本发明的特征在于在此有需要的受试者中抑制结合在NET中的NE活性的方法。所述方法包括向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物。

在抑制受试者中的NE活性或结合在NET内的NE活性的方法的一些实施方式中，受试者患有IPF和/或以异常NE活性为特征的病症(例如，囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿)。在抑制受试者中的NE活性或结合在NET内的NE活性的方法的一些实施方式中，受试者具有A1AT活性和/或表达缺陷。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有IPF的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有COPD的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有肺气肿的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有缺血再灌注损伤的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有乙醇诱导的慢性胰腺炎的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来进行治疗患有类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有弥散性血管内凝血(DIC)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有溃疡性结肠炎(UC)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有克罗恩病的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有具有中性粒细胞病理的皮肤病的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗具有A1AT活性和/或表达缺陷的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有以异常的NE活性和/或表达为特征的任何病症的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有以缺乏A1AT活性和/或表达为特征的任何病症的受试者的方法。

在任何上述方面的一些实施方式中，受试者患有以下病症或处于发展以下病症的风险：以异常NE活性为特征的病症(例如，IPF、COPD、囊性纤维化、肺气肿、ARDS、缺血再灌注、慢性胰腺炎、RA、DIC、UC、克罗恩病、皮肤病)。

在任何上述方面的一些实施方式中，受试者患有以下病症或处于发展以下病症的风险：以缺乏A1AT活性和/或表达为特征的病症。

附图说明

图1.PAI-1上的赖氨酸残基对于PAI-1和LMWuPA:PAI-1复合物与LRP1结合的重要作用。A.通过SPR分析LMWuPA:PAI-1复合物和游离PAI-1与LRP1的结合，其中Req值通过平衡测量确定。进行了三个独立实验，并对平均值±SE进行绘图。KD值(LMWuPA:PAI-1为0.9±0.2nM，以及PAI-1为74±13nM)通过非线性回归分析确定。B.PAI-1(泳道1)和化学修饰的PAI-1(泳道2)与LMWuPA形成复合物(分别为泳道3和4)。泳道5，LMWuPA。C.将250nM PAI-1和300nM用磺基-NHS-乙酸盐化学修饰的PAI-1注射到固定有LRP1的SPR芯片上。D.将9nM的LMWuPA:PAI-1复合物和80nM用化学修饰的PAI-1形成的复合物注射到固定有LRP1的SPR芯片上。

图2.PAI-1与LRP1的结合是离子强度依赖性的。A.将包含增加浓度的NaCl的缓冲液中增加浓度的PAI-1注射到LRP-1包被的SPR芯片上，并确定Req值。对于每个NaCl浓度，将数据相对于Rmax归一化。从顶部曲线向下的NaCl浓度：150mM、250mM、500mM、750mM和1000mM。B.PAI-1与LRP1结合的Debye-Hückel图。通过平衡SPR测量来测量每个离子强度(150、250、500、750和1000mM NaCl)下的KD值。进行了三个独立实验，并且绘图的值是平均值±SE。通过线性回归分析确定了1.5±0.1的斜率。通过对各个实验的线性回归分析的结果进行平均，获得了类似的斜率值。

图3.PAI-1与LRP1的结合通过二价结合模型得到了很好的描述。(A)PAI-1上的两个不同区域与LRP1上的互补位点相互作用的二价结合模型示意图。(B)将增加浓度的PAI-1(9.4、37.5、75、300nM)注射到LRP1偶联SPR芯片上。从SPR数据测量每个浓度的解离，将t＝0处的初始值归一化为100％。数据符合双指数衰减(蓝线)。C.将增加浓度的PAI-1(3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125nM)注射到LRP1偶联芯片上。实验数据(黑线)与二价结合模型的拟合以蓝线示出。示出的数据是来自已进行的六个独立实验的代表性实验。

图4.PAI-1与来自LRP1的簇IV的结合很好地拟合二价结合模型。(A)示出LRP1的结构域组织的示意图。结合重复序列的配体簇(红色圆圈)标记为I、II、III和IV。(B)将增加浓度的PAI-1(9.4、15.6、31、62.5、125nM)注射到LRP1簇IV偶联SPR芯片上。从SPR数据测量每个浓度的解离，将t＝0处的初始值归一化为100％。数据符合双指数衰减(蓝线)。(B)将增加浓度的PAI-1(3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125nM)注射到LRP1簇IV偶联芯片上。实验数据(黑线)与二价结合模型的拟合以蓝线示出。示出的数据代表进行的三个独立实验。

图5.CDE-096抑制HMWuPA:PAI-1复合物与LRP1的结合。A.在不存在(顶部曲线)和存在增加浓度的CDE-096(15.6、31.2、62.5、125、250、500nM)下，使1nM的HMWuPA:PAI-1复合物流过LRP1偶联SPR芯片。B.图A的结合期相对于CDE-096浓度的初始斜率的图。通过非线性回归分析确定了70±11nM的IC50。数据代表两个独立实验。

图6.LMWuPA:PAI-1复合物与LRP1的结合是离子强度依赖性的。A.在增加浓度的NaCl的存下下，使增加浓度的uPA:PAI-1复合物流过LRP-1包被的SPR芯片，并确定Req值。对于每个NaCl浓度，将数据相对于Rmax归一化。从顶部曲线向下的NaCl浓度：150mM、250mM、500mM、750mM和1000mM。B.LMWuPA:PAI-1与LRP1结合的Debye-Hückel图。通过平衡SPR测量来测量每个离子强度(150mM、250mM、500mM、750mM和1000mM NaCl)下的KD值。进行了三个独立实验，并对平均值±SE绘图。通过线性回归分析确定了2.4±0.4的斜率。通过对各个实验的线性回归分析的结果进行平均，获得了相同的值。

图7.LMWuPA:PAI-1复合物经由复杂的动力学模型与LRP1结合。A)用于分析LMWuPA:PAI-1复合物与LRP1结合的模型。在方案I中，LMWuPA:PAI-1经由二价模型结合。在较高浓度的LMWuPA:PAI-1下，发生单价结合模型(方案II)。(B)将增加浓度的LMWuPA:PAI-1复合物(3.12、6.25、12.5、25、50nM)注射到LRP1偶联芯片上。从SPR数据测量每个浓度的解离，将t＝0处的初始值归一化为100％。(B)将增加浓度的LMWuPA:PAI-1(0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25和50nM)注射到LRP1偶联芯片上。示出了实验数据(黑线)与包括方案I和II的模型的拟合(蓝线)。数据代表三个独立实验。

图8.LMWuPA:PAI-1复合物与LRP1的簇IV结合的动力学分析。A)将增加浓度的uPA:PAI-1复合物(0.6、1.2、2.5、5、10、20和40nM)注射到LRP1偶联芯片上。从SPR数据测量每个浓度的解离，将t＝0处的初始值归一化为100％。B)将增加浓度的LMWuPA:PAI-1(0.6、1.2、2.5、5、10、20和40nM)注射到LRP1偶联芯片上。实验数据(黑线)与方案I和II模型的拟合(蓝线)。数据代表三个独立实验。

图9.当与在赖氨酸残基处包含突变的PAI-1形成复合物时，LRP1介导的LMWuPA:PAI-1的细胞摄取降低。在不存在或存在过量RAP下，将与I91L PAI-1或指定的突变体PAI-1分子形成的5nM的125I标记的LMWuPA:PAI-1复合物与WI-38人成纤维细胞在37℃下孵育6h。孵育后，量化内化复合物的量。实验一式三份进行。

图10.提供了野生型PAI-1核酸序列(SEQ ID NO:1)；野生型PAI-1氨基酸序列(SEQID NO:2)；以及成熟野生型PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。

图11.提供了成熟变体PAI-1核酸序列(SEQ ID NO:4)，其编码在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的多肽：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V；以及成熟变体PAI-1氨基酸序列(SEQ IDNO:4)，其在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。

图12.提供了成熟变体PAI-1/Fc核酸序列(SEQ ID NO:6)，其编码在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的多肽：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V；以及成熟变体PAI-1/Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:7)，其在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V。

图13示出MDI-1001比Aralast更好地靶向炎症net。

图14示出了Aralast、Avelestat、MDI-1002、MDI-1003和MDI-1004之间的体外比较。

图15示出MDI-1003靶向CF痰中的NET。

图16示出了作为抑制剂浓度函数的弹性蛋白酶活性。

图17示出MDI-1002保护免受急性肺损伤。

图18示出MDI-1002保护免受肺纤维化。

图19示出MDI-1002没有改善博来霉素后的恢复。

图20示出吸入的MDI-1003保护免受急性肺损伤。

图21示出MDI-1003比MDI-1001更好地保护免受肺纤维化。

图22示出MDI-1003改善了博来霉素后的恢复。

图23示出了MDI-1002和MDI-1004的Fc融合构建体。

图24示出了MDI-1002和MDI-1004的Fc融合表达。

图25示出Fc融合改善PK。

图26示出LRP1结合残基的突变确实影响在DNA NET存在下对中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制，从而证明与清除受体LRP1的相互作用降低，并且对NET中弹性蛋白酶活性的保留。

定义

如本文所用，术语“Fc结构域”是指两个Fc结构域单体的二聚体。Fc结构域与至少包括C

如本文所用，术语“融合”或“连接”用于描述两个或更多个元件、组分或蛋白结构域(例如肽或多肽)通过包括化学缀合、重组方式和化学键(例如酰胺键)的组合或连接。例如，串联的两个单肽可以通过化学缀合、化学键、肽接头或共价连接的任何其他方式融合以形成一个连续的蛋白结构，例如多肽。

如本文所用，术语“多肽”描述了单一聚合物，其中，单体是通过酰胺键共价缀合在一起的氨基酸残基。多肽旨在涵括任何氨基酸序列，无论是天然存在的、重组的或合成产生的。

如本文所用，术语“同二聚体”是指由两个相同的大分子(诸如蛋白或核酸)形成的分子构建体。两个相同的单体可以通过共价键或非共价键形成同二聚体。例如，如果两个Fc结构域单体包含相同的序列，则Fc结构域可以是两个Fc结构域单体的同二聚体。在另一实例中，本文所述的包括与Fc结构域单体融合的PAI-1变体的多肽可以通过两个Fc结构域单体的相互作用形成同二聚体，这两个Fc结构域单体在同二聚体中形成Fc结构域。

如本文所用，术语“异二聚体”是指由两个不同的大分子(诸如蛋白或核酸)形成的分子构建体。两个单体可以通过共价键或非共价键形成异二聚体。例如，本文所述的包括与Fc结构域单体融合的PAI-1变体的多肽可通过两个Fc结构域单体的相互作用形成异二聚体，每个Fc结构域单体与在异二聚体中形成Fc结构域的不同的PAI-1变体融合。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指包括从其相应核酸表达蛋白所需的必要细胞组分(例如细胞器)的运载体。核酸通常被包括在可以通过本领域已知的常规技术(转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接微注射等)引入宿主细胞的核酸载体中。宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，或真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如，CHO细胞或HEK293细胞)。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指在治疗患有疾病(诸如以异常NE活性和/或缺乏A1AT活性为特征的任何病症(例如，IPF、COPD、囊性纤维化、肺气肿、ARDS、缺血再灌注、慢性胰腺炎、RA、DIC、UC、克罗恩病、皮肤病))的患者中有效实现期望的治疗效果的本发明的多肽、核酸或载体或者包含本发明的多肽、核酸或载体的药物组合物的量。术语“治疗有效量”还指在治疗患有这样的病症的患者中有效地实现期望的治疗效果的本发明的多肽、核酸或载体或者包含本发明的多肽、核酸或载体的药物组合物的量。尤其，治疗有效量的多肽、核酸或载体避免了不利的副作用。

如本文所用，术语“药物组合物”是指药用或药物制剂，其包括活性成分以及赋形剂和稀释剂以使活性成分适用于给药方法。本发明的药物组合物包括与多肽、核酸或载体相容的药学上可接受的组分。药物组合物可以是用于口服给药的片剂或胶囊形式或者用于静脉内或皮下给药的水性形式。

如本文所用，术语“药学上可接受的负载体或赋形剂”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。药学上可接受的负载体必须与制剂的其他成分相容并且对接受者无害。在本发明中，药学上可接受的负载体或赋形剂必须为包括PAI-1变体的多肽、编码该多肽的核酸分子或者含有这样的一个或多个核酸分子的载体提供足够的药学稳定性。负载体或赋形剂的性质因给药方式而异。例如，对于内静脉给药，一般使用水性溶液负载体；对于口服给药，优选固体负载体。

如本文所用，术语“治疗和/或预防”是指使用本发明的方法和组合物治疗和/或预防疾病，例如以异常的NE活性和/或缺乏A1AT活性为特征的任何病症(例如，IPF、COPD、囊性纤维化、肺气肿)。通常，治疗这样的疾病发生在受试者已经发展该疾病和/或已经被诊断出患有该疾病之后。预防这样的疾病是指当受试者处于发展该疾病的风险时采取的步骤或程序。受试者可能示出被医生判断为发展该疾病的指征或风险因素的体征或轻微症状，或者具有发展该疾病的家族史或遗传预先倾向性，但尚未发展该疾病。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如，优选人。哺乳动物包括但不限于人以及家养和农场动物，诸如猴、小鼠、狗、猫、马和牛等。

具体实施方式

IPF的特征在于间质瘢痕组织形成，其可显著限制肺功能。美国有大约130,000名IPF患者，估计每年诊断30,000至40,000例新病例(参见，Ley,B.,and Collard,H.R.2013.Epidemiology of idiopathic pulmonary fibrosis.Clin.Epidemiol.5:483-492；Lynch,J.P.,III,et al.,2016.Idiopathic Pulmonary Fibrosis:Epidemiology,Clinical Features,Prognosis,and Management.Semin.Respir.Crit Care Med.37:331-357)。诊断出IPF后的期望寿命通常为三至五年(参见，Lederer,D.J.and Martinez,F.J.,NEJM 2018,378:1811-1823)。除肺移植外，没有有效的治疗性治疗。缺乏阻止IPF进展的疗法呈现出重大挑战，并且是尚未满足的主要医疗需求。目前批准的两种药物吡非尼酮和尼达尼布已被证明减缓疾病进展，但它们不能阻止进展，并且不能恢复丧失的肺功能。因此，用于IPF治疗的新疗法对于疾病管理是必要的。

本发明通过提供包括能够抑制NE，并且尤其抑制结合在NET中的NE的突变体PA1-I多肽的组合物来解决这种需要。

本发明通过提供包括能够抑制NE，并且尤其抑制结合在NET中的NE的突变体PA1-I多肽的组合物来解决这种需要。本文提供了能够抑制NE活性同时具有减弱与玻连蛋白和/或LRP1结合能力的PAI-1变体。实际上，在开发本发明的实施方式的过程期间进行的实验证明，这样的PAI-1变体通过经由修饰负责这种玻连蛋白结合的PAI-1氨基酸残基(例如R101A和Q123K)来抑制其与玻连蛋白结合的能力而具有治疗与NE活性相关的病症(例如IPF)的改善的疗效。

在开发本发明的实施方式的过程期间进行的实验利用了丝氨酸蛋白酶抑制物映射技术并鉴定了PA1-1的突变体形式(例如，在野生型人成熟PA1-I氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V)作为NE抑制剂，其能够在NET环境中有效抑制NE。PA1-I的这种突变体形式被证明不可逆地抑制与DNA结合的NE(NET的主要组分)，其中FDA批准的人血浆来源A1AT商标Aralast是无效的。在某些实施方式中，PA1-I的这种突变体形式进一步与人IgG-Fc相关。

作为固有免疫应答的部分，中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞，并且处于防御感染的最前沿。中性粒细胞通过吞噬作用以及通过氧依赖和氧非依赖机制有效清除微生物感染。最近，描述了新的中性粒细胞抗微生物机制，释放由DNA、组蛋白和抗菌肽组成的NET。PAI-1的这种突变体形式代表了特异性靶向NE的第一种治疗剂，NE是导致IPF(参见，Obayashi,Y.,et al.,1997Chest 112:1338-1343；Schaaf,B.,et al.,2000Respiration67:52-59；Takemasa,A.,et al.,2012Eur.Respir.J 40:1475-1482；Kristensen,J.H.,etal.,2015BMC.Pulm.Med.15:53)和其他破坏性肺疾病(参见，Gregory,A.D.,et al.,2015JLeukoc.Biol.98:143-152)(例如囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病(COPD))中大量肺功能丧失的原因。更有效的治疗和潜在疾病逆转的前景对患有这种罕见疾病(orphan disease)的患者极具吸引力。

PAI-1的此类变体形式的临床指征包括特发性肺纤维化(因为NE-NET涉及纤维化的病因，包括肺成纤维细胞的分化)、COPD(参见Grabcanovic-Musija,F.,et al.,2015Respir.Res.16:59)、囊性纤维化(代表了一种肺疾病，其中NE-NET升高，并且一旦这些疾病出现，目前的治疗选择有限)、肺气肿、ARDS、缺血再灌注、慢性胰腺炎、RA、DIC、UC、克罗恩病和皮肤病。

因此，本发明的特征在于包括PAI-1变体的多肽，该PAI-1变体能够抑制NE活性，同时通过修饰其负责玻连蛋白结合的氨基酸残基(例如，R101A和Q123K)和/或LRP1结合的氨基酸残基(例如，K207、K88和K80)而具有减弱的与玻连蛋白和LRP1结合的能力，引起改善的药代动力学(PK)和改善的治疗与NE活性相关的病症(例如IPF)的疗效。在一些实施方式中，本发明的多肽包括与Fc结构域单体或部分的N-或C-末端融合的PAI-1变体(例如，为了改善PK的目的)。在一些实施方式中，本发明的多肽包括与Fc结构域单体或部分的N-或C-末端融合的PAI-1变体。在一些实施方式中，Fc结构域单体或部分提高了多肽的稳定性或改善了多肽的药代动力学。包括与Fc结构域单体融合的PAI-1变体的多肽也可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)。本文所述的PAI-1变体能够抑制NE活性并且能够抑制NE活性，其中，NE结合在NET内。本发明还包括通过向受试者给药本文所述的包括PAI-1变体的多肽来治疗受试者中涉及异常NE活性和/或缺乏A1AT活性的疾病和病症的方法。

弹性蛋白酶是由激活的中性粒细胞和巨噬细胞和单核细胞释放的丝氨酸蛋白酶。在炎症反应期间，中性粒细胞被激活并释放弹性蛋白酶，通过蛋白水解导致组织破坏。在肺中，弹性蛋白酶降解弹性组织并导致肺气肿。弹性蛋白酶也是囊性纤维化(CF)以及成人和婴儿两者急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的复合因素。弹性蛋白酶也与TNF介导的炎症(参见，Massague,J.et al.,Annu.Rev.Biochem.62:515-541(1993)和HIV感染(Bristow,C.L.etal.,International Immunol.7:239-249(1995))有关。

与纤溶酶原激活物相比，弹性蛋白酶具有更广谱的反应性，它们中的每一种都优先作用于前体底物以激活它。

对弹性蛋白酶的天然防御是一种称为α

主要的PAI属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制物)基因超家族，该丝氨酸蛋白酶抑制剂基因超家族包括血液中的许多蛋白酶抑制剂以及具有不相关或未知功能的其他蛋白(参见，Gettins,P.G.W.,and Olson,S.T.(2016)Inhibitory serpins.Newinsights into their folding,polymerization,regulation andclearance.Biochem.J.473,2273–2293)。丝氨酸蛋白酶抑制物具有共同的三级结构，并且是从共同的原型进化而来的。丝氨酸蛋白酶抑制物调节许多过程，包括凝血、纤维蛋白溶解、补体激活、排卵、血管生成、炎症、瘤形成、病毒病程和过敏反应。

丝氨酸蛋白酶抑制物作为自杀抑制剂，仅与其靶蛋白酶反应一次以形成十二烷基硫酸钠(SDS)稳定的复合物。这些复合物可以解离以产生游离的活性酶连同类似于在α

PAI-1被认为是PA系统的主要调节物之一。它是分子量为50kDa的单链糖蛋白(参见，Van Mourik J A et al.,J Biol Chem(1984)259:14914-14921)，并且是已知的单链和双链形式tPA和uPA的最有效的抑制剂(参见，Lawrence D et al.,Eur J Biochem(1989)186:523-533)。PAI-1还抑制纤溶酶和胰蛋白酶(参见，Hekman C M et al.,Biochemistry(1988)27:2911-2918)并且还抑制凝血酶和活化的蛋白C，尽管具有的效率低得多。

PAI-1cDNA编码包括典型的分泌信号序列在内的402个氨基酸的蛋白(参见，Ny etal.，同上；Ginsburg et al.,1986，同上)。从细胞培养物中分离的成熟人PAI-1由大约相等比例的381和379个氨基酸的两种变体组成。图10提供了人野生型PAI-1核酸序列(SEQ IDNO:1)；人野生型PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)；以及人成熟野生型PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。

PAI-1是包含15％至20％的碳水化合物之间的具有三个潜在的N-连接糖基化位点的糖蛋白(Van Mourik J A et al.，同上)。成熟PAI-1不包含半胱氨酸残基，有助于从大肠杆菌(E.coli)中有效表达和分离重组PAI-1。在大肠杆菌中产生的PAI-1虽然是非糖基化的，但在功能上与天然PAI-1非常相似。重组PAI-1可以以固有活性形式从大肠杆菌中分离(见下文)，这与从哺乳动物细胞培养物中纯化的PAI-1形成对比(Lawrence et al.,1989，同上；Hekman et al.,1988，同上)。

PAI-1随着它由细胞产生并分泌到培养基中时以活性形式存在，并且随着时间在培养基中以非活性或潜活形式(latent form)积累(参见，Hekman C M et al,J Biol Chem(1985)260:11581-11587,Levin E G et al,Blood(1987)70:1090-1098)。活性形式在37℃下自发地转化为具有约1h半衰期的潜活形式(参见，Lawrence et al.，同上,Hekman etal.，同上；Levin E G et al,1987，同上)。

潜活形式可以通过用变性剂、带负电荷的磷脂或Vn处理转化为活性形式(参见，Lambers et al,同上；Hekman et al,同上；Wun T-C et al,J Biol Chem(1989)264:7862-7868)。输注到兔中的潜活PAI-1通过未知的机制在体内重新激活。与其他丝氨酸蛋白抑制物相比，活性结构和潜活(latent)结构之间的可逆相互转换(可能是由于构象变化)是PAI-1的独特特征。潜活形式在能量上似乎更有利。

已辨析PAI-1的潜活形式的三维结构。在该结构中，反应性中心环的整个N末端侧作为中心链插入到β折叠A中(参见，Mottonen et al.，同上)，这解释了增加的稳定性(参见，Lawrence,D.A.et al.,Biochemistry 33:3643-3648(1994))以及缺乏抑制活性。

两种纤溶酶原激活物，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和组织型纤溶酶原激活物的活性受纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)调节，这是调节纤维蛋白溶解和伤口愈合并且与血栓性和纤维化疾病有关的丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制物)。丝氨酸蛋白酶抑制物通过以下项的独特机制来发挥抑制丝氨酸蛋白酶的功能：其切割丝氨酸蛋白酶抑制物的反应中心环，诱导丝氨酸蛋白酶抑制物的构象变化，从而导致蛋白酶抑制(参见，Gettins,P.G.W.,and Olson,S.T.(2016)Biochem.J.473,2273–2293)。一旦丝氨酸蛋白酶抑制物与蛋白酶复合，复合物就通过与LDL受体相关蛋白1(LRP1)结合而迅速从肝脏循环中去除(参见，Kounnas,M.Z.,Church,F.C.,Argraves,W.S.,和Strickland,D.K.(1996)J.Biol.Chem.271,6523–6529)。

LRP1最初被鉴定为负责去除α

LRP1以相对高的亲和力识别许多结构上不相关的配体这一事实已经引发了关于配体/受体相互作用性质的问题。关于这可能如何发生的见解来自：认识到K256和K270对于RAP的第三个结构域结合LRP1是必不可少的(参见，Migliorini,M.M.,et al.,(2003)J.Biol.Chem.278,17986–17992)以及在与来自LDL受体的两个LDLa重复的复合物中RAP的第三结构域的晶体结构(参见,Fisher,C.,et al.,(2006)Mol.Cell.22,277–283)。这些研究表明，RAP上K256和K270的ε-氨基基团与LDLa重复内的天冬氨酸残基的羧酸盐形成盐桥，从而在受体上形成酸性口袋(acidic pocket)。迄今为止，包括α2-巨球蛋白(α

虽然赖氨酸残基似乎有助于PAI-1与LRP1的相互作用(参见，Horn,I.,et al.,(1998)Thromb.Haemost.1,20–22；Rodenburg,K.W.,et al.,(1998)Biochem.J.329,55–63；Gettins,P.G.W.,and Dolmer,K.(2016)J.Biol.Chem.291,800–812)，但调查PAI-1与LRP1相互作用的研究得到了相互矛盾的数据。首先，关于PAI-1对比于蛋白酶:PAI-1复合物与LRP1的相对亲和力存在问题。大多数研究表明，只有与蛋白酶复合的PAI-1才能以高亲和力与LRP1结合(参见，Horn,I.,et al.,(1998)Thromb.Haemost.1,20–22；Stefansson,S.(1998)J.Biol.Chem.273,6358–6366；Nykjaer,A.,et al.,(1992)J.Biol.Chem.267,14543–14546；Horn,I.R.,et al.,(1997)J.Biol.Chem.272,13608–13613)。相比之下，另一些研究(参见，Gettins,P.G.W.,and Dolmer,K.(2016)J.Biol.Chem.291,800–812；Jensen,J.K.,et al.,(2009)J.Biol.Chem.284,17989–17997)报道了单独的PAI-1以高亲和力结合来自LRP1的片段。其次，基于蛋白酶:PAI-1复合物以比单独PAI-1更高的亲和力与LRP1结合的观察，一些人已经提出与PAI-1形成蛋白酶复合物暴露了PAI-1上被LRP1识别的隐藏表位(参见,Horn,I.,et al.,(1998)Thromb.Haemost.1,20–22；Stefansson,S.(1998)J.Biol.Chem.273,6358–6366)。相反，另一些人认为蛋白酶本身可能与LRP1相互作用并有助于高亲和力相互作用(参见，Skeldal,S.,et al.,(2006)FEBS J.273,5143–5159)。最后，虽然许多研究报告了当多种碱性残基突变为丙氨酸时PAI-1对LRP1的亲和力发生变化(参见，Horn,I.,et al.,(1998)Thromb.Haemost.1,20–22；Stefansson,S.(1998)J.Biol.Chem.273,6358–6366；Skeldal,S.,et al.,(2006)FEBS J.273,5143–5159)，但是对赖氨酸残基构成结合位点似乎几乎没有共识。

在开发本发明实施方式的过程期间进行的实验阐明了PAI-1和蛋白酶:PAI-1复合物与LRP1的相对结合亲和力。另外，进行了实验以确定蛋白酶:PAI-1复合物与LRP1的结合是否主要归因于PAI-1上的决定子。另外，进行了实验以确定PAI-1与靶蛋白酶(尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA))复合物以及游离PAI-1中参与其与LRP1结合的特定氨基酸残基。事实上，突变分析揭示了LRP1结合与PAI-1的小分子抑制剂CDE-096的结合位点之间的重叠，K207在PAI-1与LRP1的相互作用以及K207、K88和K80在uPA:PAI-1复合物与LRP1的相互作用中具有重要作用。

在开发本发明的实施方式的过程期间进行的实验利用了丝氨酸蛋白酶抑制物映射技术并鉴定了PA1-1的突变体形式(例如，在野生型人成熟PA1-I氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V)作为NE抑制剂，其能够在NET环境中有效抑制NE。PA1-I的这种突变体形式被证明不可逆地抑制与DNA结合的NE(NET的主要组分)，其中FDA批准的人血浆来源A1AT商标Aralast是无效的。在某些实施方式中，PA1-I的这种突变体形式进一步与人IgG-Fc相关。

因此，本发明的特征在于包括PAI-1变体的多肽。在一些实施方式中，本发明的多肽包括与Fc结构域单体或部分的N-或C-末端融合的PAI-1变体。在一些实施方式中，本发明的多肽包括与Fc结构域单体或部分的N-或C-末端融合的PAI-1变体。在一些实施方式中，Fc结构域单体或部分提高了多肽的稳定性或改善了多肽的药代动力学。

这样的部分可以通过氨基酸或其他共价键融合或连接，并且可以提高多肽的稳定性。包括与Fc结构域单体融合的PAI-1变体的多肽也可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)。在一些实施方式中，本文所述的多肽与Fc结构域单体连接，Fc结构域单体通过接头与多肽融合。在一些实施方式中，接头是氨基酸间隔物。

本发明的多肽可用于抑制NE活性并且可用于抑制结合在NET中的NE活性。另外，本发明的多肽可用于治疗患有以异常的NE活性为特征的病症(例如，IPF)的受试者。另外，本发明的多肽可用于防止受试者罹患以异常NE活性为特征的病症(例如，IPF)。此外，本发明的多肽还可用于影响具有发展或患有涉及异常NE活性的疾病或病症的风险的受试者中的NE活性。

在一些实施方式中，本发明的特征在于包括PAI-1变体的多肽，该变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在一些实施方式中，PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的突变：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V，如SEQ ID NO:5中示出。在一些实施方式中，PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：R101A和Q123K。在一些实施方式中，PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ IDNO:3)内的以下突变：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V。

在一些实施方式中，本发明的特征在于包括与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体的多肽，该变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在一些实施方式中，与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在一些实施方式中，与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：R101A和Q123K。在一些实施方式中，与Fc结构域单体或部分连接的PAI-1变体包括野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内的以下突变：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V(SEQ IDNO:7)。

在一些实施方式中，本文所述的多肽能够抑制NE，并且尤其抑制结合在NET中的NE。

在一些实施方式中，本发明的特征在于编码本文所述多肽的核酸分子(例如，包括PAI-1变体的多肽,该PAI-1变体在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的一种或多种：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在另一方面，本发明的特征还在于包括本文所述核酸分子的载体。

在另一方面，本发明的特征在于表达本文所述多肽的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包括前两个方面所述的核酸分子或载体，其中，所述核酸分子或载体在所述宿主细胞中表达。

在另一方面，本发明的特征在于一种制备本文所述多肽的方法，其中，该方法包括：a)提供包括本文所述核酸分子或载体的宿主细胞，以及b)在允许形成多肽的条件下在宿主细胞中表达核酸分子或载体。

在另一方面，本发明的特征在于一种药物组合物，包括本文所述的多肽、核酸分子或载体以及一种或多种药学上可接受的负载体或赋形剂。在药物组合物的一些实施方式中，多肽、核酸分子或载体处于治疗有效量。

图11提供了成熟变体PAI-1核酸序列(SEQ ID NO:4)，其编码在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的多肽：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V；并且提供了成熟变体PAI-1氨基酸序列(SEQ IDNO:5)，其在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。

图12提供了成熟变体PAI-1/Fc核酸序列(SEQ ID NO:6)，其编码在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的多肽：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V；并且提供了成熟变体PAI-1/Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:7)，其在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V。

在一些实施方式中，本文所述的多肽可以包括与免疫球蛋白的Fc结构域单体或Fc结构域的片段融合的PAI-1变体，以增加多肽的血清半衰期。包括与Fc结构域单体融合的PAI-1变体的多肽也可以通过两个Fc结构域单体之间的相互作用形成二聚体(例如，同二聚体或异二聚体)，这两个Fc结构域单体在二聚体中形成Fc结构域。如本领域常规已知的，Fc结构域是在免疫球蛋白的C-末端发现的蛋白结构。Fc结构域包括两个Fc结构域单体，它们通过C

本发明的多肽可以由宿主细胞产生。宿主细胞是指包括从其相应核酸表达本文所述的多肽和融合多肽所需的必要细胞组分(例如细胞器)的运载体。核酸可以被包括在可以通过本领域已知的常规技术(例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接微注射、感染等)引入宿主细胞的核酸载体中。核酸载体的选择部分取决于待使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是真核(例如，哺乳动物)或原核(例如，细菌)来源的。

可以通过本领域已知的多种方法制备编码本发明多肽的氨基酸序列的核酸序列。这些方法包括但不限于寡核苷酸介导的(或定点)诱变和PCR诱变。编码本发明多肽的核酸分子可以使用标准技术例如基因合成来获得。替代地，编码野生型PAI-1的核酸分子可以使用本领域的标准技术例如QuikChange

可以将编码本发明多肽的核酸序列插入能够在原核或真核宿主细胞中复制并表达核酸分子的载体中。许多载体在本领域中是可获得的并且可以用于本发明的目的。每个载体可以包括可以被调节和优化以与特定宿主细胞相容的各种组分。例如，载体组分可以包括但不限于复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点、信号序列、编码目的蛋白的核酸序列和转录终止序列。

在一些实施方式中，哺乳动物细胞可以用作本发明的宿主细胞。哺乳动物细胞类型的实例包括但不限于人胚肾脏(HEK)(例如，HEK293、HEK293F)、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、COS、PC3、Vero、MC3T3、NS0、Sp2/0、VERY、BHK、MDCK、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0(不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在一些实施方式中，大肠杆菌细胞也可用作本发明的宿主细胞。大肠杆菌菌株的实例包括但不限于大肠杆菌294(

用于生产本发明多肽的宿主细胞可以在本领域已知的并且适用于培养所选宿主细胞的培养基中生长。用于哺乳动物宿主细胞的合适培养基的实例包括基本必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Expi293

在一些实施方式中，取决于所使用的表达载体和宿主细胞，表达的蛋白可以从宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)分泌到细胞培养基中。蛋白回收可能涉及过滤细胞培养基以去除细胞碎片。可以进一步纯化蛋白。本发明的多肽可以通过以下项来纯化：通过蛋白纯化领域中已知的任何方法，例如通过色谱法(例如离子交换、亲和以及尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度，或者通过蛋白纯化的任何其他标准技术。例如，可以通过适当选择和组合亲和柱诸如蛋白A柱(例如POROS蛋白A色谱法)与色谱柱(例如POROS HS-50阳离子交换色谱法)、过滤、超滤、盐析和透析程序来分离和纯化蛋白。

在另外的实施方式中，可以破坏宿主细胞(例如，通过渗透压休克、超声处理或裂解)以回收表达的蛋白。一旦细胞被破坏，可以通过离心或过滤去除细胞碎片。在一些情况下，多肽可以与标记序列诸如肽缀合以促进纯化。标记氨基酸序列的实例是六组氨酸肽(His-tag)，它以微摩尔亲和力结合镍功能化的琼脂糖亲和柱。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签，其对应于来源于流感血凝素蛋白的表位(参见，Wilson etal.,Cell 37:767,1984)。

替代地，本发明的多肽可以由受试者(例如人)的细胞产生，例如在基因治疗的情况下，通过给药包含编码本发明多肽的核酸分子的载体(诸如病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如牛痘病毒载体，诸如修饰型安卡拉痘苗病毒(MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体))。载体一旦进入受试者的细胞内(例如，通过转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接微注射、感染等)将促进多肽的表达，该多肽然后从细胞中分泌。如果疾病或病患的治疗是期望的结果，则可能不需要进一步的行动。如果期望收集蛋白，则可以从受试者收集血液并通过本领域已知的方法从血液中纯化蛋白。

本发明的特征在于药物组合物，其包括本文所述的多肽(例如，包括PAI-1变体的多肽(例如，在野生型PAI-1(SEQ ID NO:1)内具有以下突变的一种或多种的PAI-1变体：K69A、K80A、K88A、I91L、R101A、K122A、Q123K、K176A、K207A、K263A、V343A和R346V。在一些实施方式中，本发明的药物组合物包括含有具有C-末端延伸(例如1、2、3、4、5、6或更多个额外氨基酸)的PAI-1变体的多肽作为治疗性蛋白。在一些实施方式中，本发明的药物组合物包括含有与部分(例如，Fc结构域单体或其二聚体、野生型Fc结构域、具有氨基酸置换(例如，降低二聚化的一个或多个置换)的Fc结构域)融合的PAI-1变体的多肽作为治疗性蛋白。在一些实施方式中，本发明的药物组合物包括含有与第一部分(例如，Fc结构域单体或其二聚体、野生型Fc结构域、具有氨基酸置换(例如，降低二聚化的一个或多个置换)的Fc结构域)融合的PAI-1变体的多肽。

在一些实施方式中，包括本发明多肽的本发明药物组合物可以与其他药剂(例如治疗性生物制剂和/或小分子)或组合物在疗法中组合使用。除了治疗有效量的多肽之外，药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的负载体或赋形剂，它们可以通过本领域技术人员已知的方法来配制。在一些实施方式中，本发明的药物组合物包括编码本发明多肽的核酸分子(DNA或RNA，例如mRNA)，或者包含这样的核酸分子的载体。

药物组合物中可接受的负载体和赋形剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。可接受的负载体和赋形剂可以包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES和TAE，抗氧化剂诸如抗坏血酸和甲硫氨酸，防腐剂诸如氯化六甲双铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵，蛋白诸如人血清白蛋白、明胶、右旋糖酐和免疫球蛋白，亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸，以及碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨糖醇。本发明的药物组合物可以以可注射制剂的形式胃肠外给药。可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为运载体来配制注射用药物组合物。药学上可接受的运载体包括但不限于无菌水、生理盐水和细胞培养基(例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α-改良的Eagle培养基(α-MEM)、F-12培养基)。配制方法是本领域已知的，参见例如Banga(ed.)Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing and Delivery Systems(3rd ed.)Taylor&Francis Group,CRC Press(2015)。

可以将本发明的药物组合物制备成微胶囊，诸如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。本发明的药物组合物也可以在其他药物递送系统诸如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊中制备。这样的技术描述在Remington:TheScience and Practice of Pharmacy 22

也可以将本发明的药物组合物制备为持续释放制剂。持续释放配制剂的合适实例包括包含本发明多肽的固体疏水聚合物的半透性基质。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT

根据需要，药物组合物可以形成单位剂量形式。包括在药物制剂中的活性组分(例如本发明的多肽)的量使得提供指定范围内的合适剂量(例如0.01-100mg/kg体重范围内的剂量)。

用于基因治疗的药物组合物可以在可接受的稀释剂中，或者可以包括嵌入了基因递送运载体的缓释基质。如果使用流体动力学注射作为递送方法，则包含编码本文所述多肽的核酸分子或包含该核酸分子的载体(例如，病毒载体)的药物组合物以大流体体积静脉内快速递送。可用作体内基因递送运载体的载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，诸如改良的安卡拉牛痘)、腺相关病毒载体和甲病毒载体。

包括本发明的多肽作为治疗性蛋白的药物组合物可以配制用于例如静脉内给药、肠胃外给药、皮下给药、肌肉内给药、动脉内给药、鞘内给药或腹腔给药。药物组合物还可以配制用于以下项或者经由以下项给药：口服、鼻腔、喷雾、气溶胶、直肠或阴道药。对于可注射制剂，多种有效的药物负载体是本领域已知的。参见例如ASHP Handbook on InjectableDrugs,Toissel,18th ed.(2014)。

在一些实施方式中，包括编码本发明多肽的核酸分子或包含这样的核酸分子的载体的药物组合物可以通过基因递送的方式给药。基因递送的方法是本领域技术人员熟知的。可用于体内基因递送和表达的载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体，诸如改良的安卡拉牛痘(MVA))、腺相关病毒载体和甲病毒载体。在一些实施方式中，编码本发明多肽的mRNA分子可以向受试者直接给药。

在本发明的一些实施方式中，编码本文所述多肽的核酸分子或包含这样的核酸分子的载体可以使用流体动力学注射平台给药。在流体动力学注射方法中，将编码本文所述多肽的核酸分子置于工程质粒(例如病毒质粒)中的强启动子的控制之下。质粒通常以大流体体积静脉内快速递送。流体动力学注射在静脉中使用受控的流体动力学压力来增强细胞通透性，从而快速注射大流体体积产生的升高的压力导致液体和质粒从静脉外渗。核酸分子的表达主要由肝脏驱动。在小鼠中，流体动力学注射通常通过将质粒注射到尾静脉来进行。在某些实施方式中，编码本文所述多肽的mRNA分子可以使用流体动力学注射来给药。

本发明的药物组合物的剂量取决于包括以下项的因素：给药途径，待治疗的疾病以及受试者的身体特征例如年龄、体重、一般健康状况。本发明的药物组合物可以包括本发明多肽的剂量范围为0.01至500mg/kg(例如，0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg/kg)，并且在更特定的实施方式中，约0.1至约30mg/kg，并且在更特定的实施方式中，约0.3至约30mg/kg。剂量可以由医师根据常规因素诸如疾病程度和受试者的不同参数来调整。

药物组合物以与剂型相容的方式和治疗有效的量给药以导致症状的改善或补救。药物组合物以多种剂型，例如静脉内剂型、皮下剂型和口服剂型(例如可摄取溶液、药物释放胶囊)给药。通常，治疗性蛋白的剂量为0.1-100mg/kg，例如1-50mg/kg。包括本发明多肽的药物组合物可以例如每天、每周、每两周、每月、每两个月、每季度、每半年、每年一次或多次(例如，1-10次或更多)或根据医疗需要向有此需要的受试者给药。在一些实施方式中，包括本发明的多肽的药物组合物可以每周、每两周、每月、每两个月或每季度向有此需要的受试者给药。剂量可以以单次或多次给药方案提供。给药之间的时间可以随着医疗条件的改善而降低或随着患者健康的下降而增加。

本发明基于以下发现：置换人PAI-1中的一个或多个特定氨基酸使得其能够抑制NE活性并抑制其中NE结合在NET中的NE活性。这些PAI-1变体特性提供了可以用于治疗以异常NE活性和/或缺乏A1AT活性为特征的疾病的有用的治疗剂。

在另一方面，本发明的特征在于在此有需要的受试者中抑制NE活性的方法。在另一方面，本发明的特征在于在此有需要的受试者中抑制结合在NET中的NE活性的方法。该方法包括向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物。

在抑制受试者中的NE活性或结合在NET内的NE活性的方法的一些实施方式中，受试者患有IPF和/或以异常NE活性为特征的病症(例如，囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿)。在抑制受试者中的NE活性或结合在NET内的NE活性的方法的一些实施方式中，受试者具有A1AT活性和/或表达缺陷。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有IPF的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有COPD的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有肺气肿的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有缺血再灌注损伤的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有乙醇诱导的慢性胰腺炎的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来进行治疗患有类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有弥散性血管内凝血(DIC)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有溃疡性结肠炎(UC)的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有克罗恩病的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有具有中性粒细胞病理的皮肤病的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗具有A1AT活性和/或表达缺陷的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有以异常的NE活性和/或表达为特征的任何病症的受试者的方法。

在另一方面，本发明的特征在于通过向受试者给药治疗有效量的本文所述的多肽、核酸分子或载体或者本文所述的药物组合物来治疗患有以缺乏A1AT活性和/或表达为特征的任何病症的受试者的方法。

在任何上述方面的一些实施方式中，受试者患有以下病症或处于发展以下病症的风险：以异常NE活性为特征的病症(例如，IPF、COPD、囊性纤维化、肺气肿)。

在任何上述方面的一些实施方式中，受试者患有以下病症或处于发展以下病症的风险：以缺乏A1AT活性和/或表达为特征的病症。

本领域普通技术人员将容易地认识到，前述仅代表本发明的某些优选实施方式的详细描述。上述组合物和方法的各种修改和改变可以使用本领域可用的专业知识容易地实现并且在本发明的范围内。

实验

实施例I.

此实施例表明LMWuPA:PAI-1复合物以比单独PAI-1更高的亲和力与LRP1结合。

为了解决文献中存在的关于PAI-1和蛋白酶:PAI-1复合物对LRP1的相对亲和力的矛盾，我们最初的实验比较了游离PAI-1和与LMWuPA复合的PAI-1与LRP1的结合。值得注意的是，LMWuPA本身不与LRP1结合。由于野生型PAI-1相对不稳定并迅速转化为潜活形式，因此本研究和所有后续研究(除非另有说明)中的实验均使用了PAI-1的I91L突变体，该突变体将PAI-1的稳定性从2.0h的半衰期延长到了18.4h的半衰期(参见，Berkenpas,M.B.,Lawrence,D.A.,and Ginsburg,D.(1995)EMBO J.14,2969–77)。进行了形成I91L PAI-1与LMWuPA的复合物的实验，并使用平衡SPR测量将其与游离PAI-1与LRP1的结合进行了比较。数据(图1A)显示LMWuPA:PAI-1复合物以比单独PAI-1更紧密几乎2个数量级与LRP1结合(LMWuPA:PAI-1的K

实施例II.

此实施例表明PAI-1上的赖氨酸残基对于PAI-1和LMWuPA:PAI-1复合物两者与LRP1的结合至关重要。

为了确定赖氨酸残基对PAI-1与LRP1的相互作用的贡献，将这些残基用与赖氨酸残基的伯胺形成稳定的共价酰胺键的磺基-NHS-乙酸盐进行化学修饰。这种修饰不会阻止PAI-1与LMWuPA形成稳定的复合物(图1B)。然而，值得注意的是，这种修饰阻止了游离PAI-1(图1C)和LMWuPA与修饰AI-1的复合物两者与LRP1的结合(图1D)。这些结果表明，PAI-1上的赖氨酸残基有助于PAI-1和LMWuPA:PA1-1复合物两者者与LRP1的结合。

实施例III.

此实施例证明了两个带电荷的残基参与了PAI-1与LRP1的结合。

接下来进行了检查离子强度对PAI-1与LRP1结合的作用的实验。这些实验的结果表明，PAI-1与LRP1的结合取决于离子强度(图2A)。图2B示出了以Debye-Hückel图的形式绘图的数据，其中，log

实施例IV.

此实施例表明动力学分析支持PAI-1与LRP1结合的二价模型。

图2的数据表明至少两个带电荷的残基参与了PAI-1与LRP1的相互作用，提出了二价结合模型的可能性，其中高亲和力结合是由PAI-1上的两个区域(每个区域都包含带电荷的残基)与LRP1上的两个LDLa重复的相互作用介导的亲和力效应产生的(图3A)。对于FVIII与LRP1的结合，已经提出了类似的模型(16)。为了测试该模型，进行了动力学测量以使用表面等离激元共振实验检查I91L PAI-1与LRP1的结合。为了深入了解潜在机制，最初，在多种配体浓度下比较了PAI-1从LRP1解离的动力学(图3B)。这些结果表明解离动力学以两个阶段发生：快速阶段，随后是慢得多的阶段。另外，正如对二价模型所预期的那样，解离动力学与配体浓度无关。当将结合和解离动力学同时拟合于全局二价模型时，将从实验数据的拟合确定的解离速率常数用作解离阶段的初始估计值。这种拟合表明，二价结合模型很好地描述了实验数据(图3C)。最佳拟合的动力学数据(表I)显示PAI-1与LRP1快速结合形成复合物I，并以97s的半衰期转化为复合物II。重要的是，从动力学分析得出的平衡结合常数K

LRP1的配体结合区域主要定位于LDLa重复的簇，称为簇I、II、III和IV(图4A)。在这些簇中，大多数配体与簇II、III或IV结合。因此，进行实验也检查了PAI-1与簇II、III和IV的结合。最初的实验表明，I91L PAI-1以相似的亲和力与簇II和IV相互作用，但对簇III的亲和力弱得多。接下来应用簇IV进行详细的实验，簇IV是LRP1的主要配体结合区域。图4B证实PAI-1从簇IV的解离也以两阶段发生，并且与PAI-1浓度无关。拟合到实验数据的比较表明，该结合符合二价结合模型(图4C)。最佳拟合参数总结在表I中，其揭示了从动力学数据得出的K

实施例V.

此实施例证明了K207在PAI-1与LRP1的结合中的关键作用。

由于PAI-1的化学修饰揭示了赖氨酸残基在与LRP1相互作用中的关键作用，因此开始研究以确定有助于PAI-1与LRP1结合的特定赖氨酸残基。为了额外地了解PAI-1上可能对其与LRP1相互作用重要的区域，检测了CDE-096阻断HMWuPA:PAI-1复合物与LRP1结合的潜力。CDE-096是一种小分子抑制剂，其与PAI-1可逆结合并经由变构机制抑制PAI-1与蛋白酶的相互作用(参见，Li,S.-H.,et al.,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,E4941-9)。CDE-096也与uPA:PAI-1复合物结合。当将CDE-09添加到HMWuPA:PAI-1复合物中时，观察到HMWuPA:PAI-1与LRP1结合的剂量依赖性抑制(图5A)。通过将结合曲线的初始斜率相对于CDE-096浓度再次绘图(图5B)确定了70nM的IC

结构研究表明，K207和K263有助于CDE-096与PAI-1的结合(参见，Li,S.-H.,etal.,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,E4941-9)。因此，进行了包括在分析中的这些PAI-1突变体连同K69、K80和K88的实验，K69、K80和K88先前已被确定为对PAI-1与来自簇II的LDLa重复的结合至关重要(参见，Gettins,P.G.W.,and Dolmer,K.(2016)J.Biol.Chem.291,800–812)。在这些研究中，由SPR平衡测量确定K

表II中的数据还示出基于PAI-1三维结构的特定侧链的表面积分数。侧链基团的可及表面积分数是蛋白中溶剂可及的面积除以对该残基和延伸的Gly-Xaa-Gly三肽中计算的可及表面积(参见，Willard,L.,et al.,(2003)Nucleic Acids Res.31,3316–3319)，其中接近1的值是完全可及的，并且接近0的值是被隐藏的。R76E PAI-1突变体缺乏LRP1结合(参见，Stefansson,S.(1998)J.Biol.Chem.273,6358–6366)，并且已经提出R76直接参与PAI-1与LRP1的结合(参见，Gettins,P.G.W.,and Dolmer,K.(2016)J.Biol.Chem.291,800–812)。然而，0.24的ASA值表明该残基被隐藏，并且不能与LRP1直接相互作用。同样，在先前研究中涉及的K263和K122也是在结构中部分隐藏的，并且因此无法与LRP1直接相互作用。

表II.

实施例VI.

此实施例描述了LMWuPA:PAI-1复合物与LRP1的结合是经由复杂的机制发生的。

为了表征LMWuPA:PA1与LRP1的结合，进行了检查结合的离子强度依赖性的实验。图6A中示出的结果证明了结合对离子强度的显著依赖性。Debye-Hückel图(图6B)产生了2.4±0.3的斜率，表明2-3种离子相互作用参与结合。

当检查相互作用的动力学时，观察到解离动力学在LMWuPA:PAI-1复合物浓度较高时发生变化(图7B)。从图7C中的数据中也显而易见地看出这一点，其中，在较高的LMWuPA:PAI-1浓度下会出现更快速的解离，这表明存在多种结合机制。之前对于RAP结构域D1D2与LRP1的结合观察到这一点(参见，Prasad,J.M.,et al.,(2016)J.Biol.Chem.291,18430–18439)。因此，实验还将第二方案并入模型，其中LMWuPA:PAI-1复合物也能够与LRP1上的第二不同位点结合以形成单价复合物(复合物III，图7A，方案II)。为了简化模型，假设方案II中的k

实验还检查了LMWuPA:PAI-1复合物与固定在SPR芯片上的LRP1的簇IV的结合。类似于LMWuPA:PAI-1与全长LRP1的结合，解离动力学与配体浓度无关(图8A)，并且因此实验将数据拟合到图7A中描述的模型。拟合很好地描述了数据(图8B)并且从这些拟合中得出的参数总结在表III中，并表明LMWuPA:PAI-1复合物与簇IV的结合比与全长LRP1的结合略弱。这些结果表明LMWuPA:PAI-1复合物也可能与簇IV之外的LRP1区域相互作用。

实施例VII.

此实施例表明PA1-I突变体揭示了额外的残基参与LMWuPA:PAI-1复合物与LRP1的相互作用。

为了确定PAI-1上类似的赖氨酸残基是否也参与了uPA:PAI-1复合物与LRP1的相互作用，进行了同样形成LMWuPA与突变PAI-1分子的复合物的实验，并测量了这些复合物与LRP1的结合。这些研究的结果总结在表II中。有趣的是，和PAI-1与LRP1的结合不同，PAI-1的单个突变体(K69A、K88A和K207A)对LMWuPA:PAI-1复合物与LRP1的结合影响最小，而K80A导致K

接下来的实验检查了由包含双突变或三突变的PAI-1分子形成的PAI-1与LMWuPA的复合物的细胞摄取(图9)。结果表明，当与LMWuPA复合时，PAI-1的双突变体和三突变体没有被表达LRP1的细胞有效摄取。

实施例VIII.

此实施例描述了用于实施例I-VII的材料和方法。

LMWuPA、HMWuPA、WT PAI-1HMWuPA:PAI-1复合物和I91L PAI-1购自MolecularInnovations。突变PAI-1蛋白如所述产生和纯化。LRP1如所述从人胎盘中纯化(参见，Ashcom,J.D.,et al.,(1990)J.Cell Biol.110,1041–1048)。结合簇II、III和IV的LRP1配体购自RnD Systems。CDE096如所述合成(参见，Li,S.-H.,et al.,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,E4941-9)。用于Biacore研究的LMWuPA:PAI-1复合物是通过将PAI-1与1.2倍摩尔过量的LMWuPA在PBS中在室温下孵育1h形成的。通过在4-20％Tris-gly凝胶(Novex)上分析蛋白并用胶体蓝染色剂染色来验证复合物的形成。

使用磺基-NHS-乙酸盐(Thermo-Fisher Scientific)对I91L PAI-1进行化学修饰以阻断赖氨酸侧链中的伯胺。将磺基-NHS-乙酸盐以50g/ml溶解在PBS中。将55ug的I91LPAI1与相对于I91L PAI-1中的总氨基基团的50倍过量的磺基-NHS-乙酸盐在PBS中在4摄氏度下孵育3h。使用NAP

使用20μg/ml LRP1在10mM pH 4的乙酸钠中的工作溶液将纯化的LRP1固定在CM5传感器芯片表面，以达到10,000个响应单位的水平。根据制造商的说明(BIAcore AB)，使用20μg/ml簇IV在10mM pH 4的乙酸钠中的工作溶液将结合簇IV的LRP1配体固定在CM5传感器芯片表面，以达到2,000个响应单位的水平。另一个流动池被激活并用不含蛋白的1M乙醇胺封闭，作为对照表面。除非另有说明，否则结合实验在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES、0.15MNaCl、0.005％表面活性剂P、1mM CaCl2，pH 7.4)中进行。对于离子强度依赖性，由10mMHEPES、0.0005％表面活性剂P、1mM CaCl2和多种浓度的NaCl(0.15M、0.25M、0.5M、0.75M和1.0M)制备缓冲液，pH 7.4。所有实验均在25℃下使用20μl/min的流速在IAcore3000仪器上进行。传感器芯片表面通过以100μl/min的流速注射100mM磷酸15s来进行再生。

使用GraphPad Prism 7.04软件将解离率拟合到2指数衰减。使用BIAevaluationshotware中可用的数值积分算法将动力学数据分析为二价模型(方案1)：

方案1

其中A代表配体(PAI-1或LMWuPA:PAI-1复合物)，B代表LRP1，AB1代表位点1处的配体:LRP1复合物，以及AB2代表位点2处的配体:LRP1复合物。为了便于拟合过程，通过将解离数据全局拟合到二指数衰减模型而获得k

方案1

以及

方案1I

通过将结合速率拟合到伪一阶过程来确定平衡结合数据以获得Req。然后将Req相对于总配体浓度绘图并使用GraphPad Prism 7.04软件中的非线性回归分析拟合到结合等温线：

y＝Bmax*L/(KD+L)

其中Bmax是饱和时的Req值，L是游离配体浓度，并且KD是平衡结合常数。由于在这些实验中游离配体浓度是未知的，因此使用该方程假定添加的配体的总量远大于与LRP-1偶联SPR芯片结合的配体的量。

将HMWuPA-PAI-1复合物在包含0至500nM CDE-096的0.01M HEPES、0.15M NaCl、1mM CaCl2、0.0005％表面活性剂P、0.1％DMSO，pH 7.8中稀释至2nM。如上所述在Biacore上进行与LRP1结合，但运行缓冲液为0.01M HEPES、0.15M NaCl、1mM CaCl2、0.0005％表面活性剂P、0.1％DMSO，pH7.8。

将WI38细胞铺板在用聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma)预先包被的12孔组织培养板中。在用碘化复合物处理之前，将细胞在测定缓冲液(DMEM、1％BSA、20mM HEPES)中孵育1h。在包含1mM 6-氨基己酸(Aldrich)的PBS中，使用Iodo-gen(Pierce)用I-125碘化钠(PerkinElmer NEZ033)对LMWuPA进行碘化。使用PD-10柱(GE Healthcare)将碘化蛋白脱盐到PBS中以去除游离碘。通过将I91L PAI-1及其突变体(0.8uM)与I-125LMWuPA(0.4uM)在室温下孵育1小时形成标记的复合物。将所得复合物在单独的测定缓冲液或包含1uM RAP的测定缓冲液中稀释至5nM，并在37度下放置在细胞上6h。去除培养基，将细胞用2ml PBS洗涤并用包含50ug/ml蛋白酶K的胰蛋白酶(Corning 25-0520)处理。将细胞以4000rpm离心4min。去除上清液并对细胞沉淀进行计数以确定内化的摩尔数。

实施例IX.

此实施例描述了在大肠杆菌(E.coli)中纯化具有在野生型人成熟PAI-1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)内具有以下突变的PAI-1变体：R101A和Q123K(下文称为“MDI-1003)”。

用0.05M磷酸钠、0.1M氯化钠、0.001M EDTA，pH 6.6对两百ml的MDI-1003发酵罐裂解物离心澄清的上清液进行透析，然后在Heparin-Sepharose 6B柱(10x 5.0cm)上在室温下以大约0.5ml/min的流速进行色谱分离。将Heparin-Sepharose 6B柱用2L pH 6.6的0.05M磷酸钠、0.1M氯化钠、0.001M EDTA洗涤，随后在相同缓冲液中通过600ml梯度洗脱至1.0M氯化钠。合并包含PAI-1的级分并将固体硫酸铵添加至18％饱和度。将PAI-1在预先在0.05M磷酸钾、0.1M氯化钠、0.001M EDTA，pH 6.6，30％饱和硫酸铵中平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow(Low Sub)柱(10x 2.5cm)上在室温下以大约0.5ml/min的流速进行色谱分离。将Phenyl-Sepharose Fast Flow柱用500ml的0.05M磷酸钾、0.1M氯化钠、0.001MEDTA，pH 6.6，30％饱和硫酸铵洗涤，随后在相同缓冲液中通过400ml梯度洗脱至0％硫酸铵。合并包含PAI-1的级分并通过将固体硫酸铵添加至65％饱和度进行沉淀。用0.05M磷酸钠、0.1M氯化钠、0.001M EDTA，pH 6.6将沉淀物溶解至3.5mg/ml，然后用相同的缓冲液进行充分透析。Heparin-Sepharose 6B柱后的产量为90ml，包含80mg蛋白(泳道1)。Phenyl-Sepharose Fast Flow柱后的产量为80ml，包含47mg蛋白(泳道2)。最终产量为12ml，包含38mg高度纯化的HPAI-AVI-AK蛋白。

实施例X.

将CF患者的痰用2mL的冷PBS/1g痰提取，然后手动匀浆至光滑。以10,000xg离心20min(4℃)并保存用于弹性蛋白酶滴定。接下来将纯化的HNE稀释至40nM，并向每个孔(黑色板)中添加0、2.5、5、7.5、10、12.5、15和20uL，并用40mM Hepes、100mM NaCl，pH7.4，0.005％吐温-20使体积达到100uL。添加100uL的500uM MeOSuc-AAPV-AMC并在ex 370em440下动态读取10min。注意斜率和截距。

稀释CF-痰并向每孔中添加0、2.5、5、7.5、10、12.5、15和20uL，用40mM Hepes、100mM NaCL，pH7.4，0.005％吐温-20使体积达到100uL，然后添加100uL 500uM MeOSuc-AAPV-AMC并在ex370、em440下动态读取10min。使用纯化HNE的斜率和截距反演计算CF痰中的弹性蛋白酶浓度。

将50nM HNE或CF-痰+/-鲑鱼精子DNA或肝素在室温下孵育30min。将弹性蛋白酶抑制剂连续稀释到黑色板中(在40mM Hepes、100mM NaCl，pH7.4，0.005％Tween-20中稀释)至最终体积为90uL。将10uL的HNE/DNA/肝素从上面添加到90uL的抑制剂中。如果需要在室温下孵育30秒、1min、2min或更长时间。向每个孔中添加100uL的500uM MeOSucAAPV-AMC，并在ex370、em440下动态读取10min。

K

将K

K

在8周龄C57BL/6J雄性小鼠中以20mg/kg静脉内(IV)推注给药后评估AVI或AVI-AK的药代动力学特征。0.5、1、2、6和24h后抽血，并测定血浆中PAI-1的量。

对野生型C57BL/6J小鼠(雄性8周龄)进行LPS(25微升，2mg/mL)的气管内滴注，随后用运载体、AVI、AVI-AK或Aralast(30微升，1.3mg/mL)进行气管内治疗。十八小时后，向动物灌注PBS并获得湿肺重量和总弹性蛋白酶。

得到全肺湿重。添加250uL的0.4M Hepes、0.1M NaCl，pH7.4，1％Tx-100，并用均质机高速研磨1min。在10,000xg下离心10min(4℃)。将上清液移至新管并在10,000xg下再旋10min。将上清液移至新试管用于测定。

纤维化测定基本上如所述(Blood,2011,118:2313-2321)。简而言之，将体重和年龄匹配(6-8周龄,18-22g)的WT小鼠在第0天用单剂量的气管内博来霉素(1.15u/kg，在50L无菌PBS中)进行处理以诱导肺纤维化。从第1天开始，每天两次向小鼠给药MDI-1001、MDI-1002、MDI-1003或盐水(4mg/kg IP)以治疗急性损伤期。在第21天，处死小鼠并如所述从羟脯氨酸测量确定肺纤维化(参见Blood,2011,118:2313-2321)。

通过定点诱变(QuickChange II Kit,Agilent,Santa Clara,CA)将以下突变引入人PAI-1cDNA的成熟形式：I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V。突变V343A、R346V、I91L(AVI)传递稳定的活性PAI-1表型，而突变R101A、Q123K(AK)引入减少的玻连蛋白结合表型。将修饰的cDNA(命名为AVI-AK)克隆到pcDNA5/FRT质粒中，其具有的N-末端融合肽序列由人免疫球蛋白(IgG1)恒定区域组成，该恒定区域包括结构域2和3，包括铰链区序列(HFc)。通过限制性消化筛选和DNA测序证实了构建体的完整性。使用GeneJuice试剂(Novagen/Millipore)将经过验证的HFc-AVI-AK融合质粒与pOG44质粒(具有Flp重组酶基因)以9:1的比率共转染到CHO(中国仓鼠卵巢)Flp-In细胞(InVitrogen)中以促进融合蛋白序列的单拷贝整合。将转染的细胞在37℃、6％CO2下孵育48小时，之后添加100ug/ml潮霉素(Invivogen)以选择带有整合的AVI-AK cDNA的细胞。在Ham's F12培养基(补充10％胎牛血清和潮霉素)中选择和繁殖转染细胞后，使细胞培养物适应在无血清培养基(CHOgro，MirusBio)中生长，以促进非贴壁生长、扩增细胞密度，并简化纯化。蛋白表达由组成型巨细胞病毒(CMV)启动子调节，因此大约每3-5天收获包含HFc-AVI-AK的细胞上清培养基用于下游处理。

将条件培养基用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.0)以1:1稀释，并应用到包含用PBS平衡的15-20ml蛋白A/蛋白G树脂的柱上，然后用PBS彻底洗涤。用0.1M甘氨酸、0.1M NaCl，pH3.0洗脱结合的融合蛋白并收集到pH 5.6的0.5M乙酸钠中以稳定pH，产生>95％纯度的蛋白。然后将蛋白洗脱物立即应用到在0.05M磷酸钠、0.1M NaCl，pH 6.6中平衡的肝素琼脂糖上，然后用0.05M磷酸钠、1M NaCl，pH 6.6洗涤并洗脱。第二步利用PAI-1的独特特性来浓缩蛋白并达到>99％的纯度。

–

–

–

–MDI-1004–具有MDI-1003突变的Fc融合蛋白

图13示出MDI-1001比Aralast更好地靶向炎症net。

图14示出Aralast、Avelestat、MDI-1002、MDI-1003和MDI-1004之间的体外比较。

图15示出MDI-1003靶向CF痰中的NET。

图16示出了作为抑制剂浓度函数的弹性蛋白酶活性。

图17示出MDI-1002保护免受急性肺损伤。

图18示出MDI-1002保护免受肺纤维化。

图19示出MDI-1002没有改善博来霉素后的恢复。

图20示出吸入的MDI-1003保护免受急性肺损伤。

图21示出MDI-1003比MDI-1001更好地保护免受肺纤维化。

图22示出MDI-1003改善了博来霉素后的恢复。

图23示出了MDI-1002和MDI-1004的Fc融合构建体。

图24示出了MDI-1002和MDI-1004的Fc融合表达。

图25示出Fc融合改善PK。

图26示出了对中性粒细胞弹性蛋白酶加或减DNA NET的抑制曲线。该数据表明提供针对中性粒细胞弹性蛋白酶的最佳活性的突变可以与表II中示出的降低与清除受体结合的突变的每一个组合。结果是改善了分子的药代动力学。总共有7个变体，6个具有单个受体结合突变，并且1个具有2个受体结合突变。后一种双突变体表明突变可以组合以具有使清除受体结合更大降低的潜力。所有这些还包含I91L、R101A、Q123K、V343A、R346V突变。

每个变体的MDI名称是：

K69A是MDI-1005

K80A是MDI-1006

K88A是MDI-1007

K176A是MDI-1008

K207A是MDI-1009

K263A是MDI-1010

K69A-K207A是MDI-1011

这些突变表明与清除受体的结合降低，同时在DNA的存在下保持NET结合和对中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制。优选的突变是K207A，因为这将游离抑制剂的清除受体结合降低至19分之一，但仅将抑制的蛋白酶复合物的结合降低至1.6分之一(参见申请中的表II)。这显著增加了具有这种突变的抑制剂的药代动力学，但仍允许在抑制后去除弹性蛋白酶复合物。

现在已对本发明进行全面描述，本领域技术人员将理解，同样可以在条件、制剂和其他参数的宽泛和等同范围内进行而不影响本发明或其任何实施方式的范围。本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过援引以其全部内容并入本文。

通过援引并入

出于所有目的，本文提到的每篇专利文献和科学文章的完整公开均通过援引并入本文,包括但不限于本文援引的任何参考文献。

等同形式

本发明可以在不背离其精神或本质特征下，以其他具体形式体现。因此，前述实施方式在所有方面都被认为是说明性的，而并非限制本文描述的本发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述说明书来指示，并且在权利要求书的等价意义和范围内的所有改变均应旨在包括在其中。

序列表

<110> 密执安大学评议会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN)

<120> 中性粒细胞弹性蛋白酶活性的多肽抑制剂及其用途

<130> PPI22170938US

<150> US 62/938,859

<151> 2019-11-21

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4080

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

gaattcctgc agctcagcag ccgccgccag agcaggacga accgccaatc gcaaggcacc 60

cttaaggacg tcgagtcgtc ggcggcggtc tcgtcctgct tggcggttag cgttccgtgg 120

tctgagaact tcaggatgca gatgtctcca gccctcacct gcctagtcct gggcctggcc 180

agactcttga agtcctacgt ctacagaggt cgggagtgga cggatcagga cccggaccgg 240

cttgtctttg gtgaagggtc tgctgtgcac catcccccat cctacgtggc ccacctggcc 300

gaacagaaac cacttcccag acgacacgtg gtagggggta ggatgcaccg ggtggaccgg 360

tcagacttcg gggtgagggt gtttcagcag gtggcgcagg cctccaagga ccgcaacgtg 420

agtctgaagc cccactccca caaagtcgtc caccgcgtcc ggaggttcct ggcgttgcac 480

gttttctcac cctatggggt ggcctcggtg ttggccatgc tccagctgac aacaggagga 540

caaaagagtg ggatacccca ccggagccac aaccggtacg aggtcgactg ttgtcctcct 600

gaaacccagc agcagattca agcagctatg ggattcaaga ttgatgacaa gggcatggcc 660

ctttgggtcg tcgtctaagt tcgtcgatac cctaagttct aactactgtt cccgtaccgg 720

cccgccctcc ggcatctgta caaggagctc atggggccat ggaacaagga tgagatcagc 780

gggcgggagg ccgtagacat gttcctcgag taccccggta ccttgttcct actctagtcg 840

accacagacg cgatcttcgt ccagcgggat ctgaagctgg tccagggctt catgccccac 900

tggtgtctgc gctagaagca ggtcgcccta gacttcgacc aggtcccgaa gtacggggtg 960

ttcttcaggc tgttccggag cacggtcaag caagtggact tttcagaggt ggagagagcc 1020

aagaagtccg acaaggcctc gtgccagttc gttcacctga aaagtctcca cctctctcgg 1080

agattcatca tcaatgactg ggtgaagaca cacacaaaag gtatgatcag caacttgctt 1140

tctaagtagt agttactgac ccacttctgt gtgtgttttc catactagtc gttgaacgaa 1200

gggaaaggag ccgtggacca gctgacacgg ctggtgctgg tgaatgccct ctacttcaac 1260

ccctttcctc ggcacctggt cgactgtgcc gaccacgacc acttacggga gatgaagttg 1320

ggccagtgga agactccctt ccccgactcc agcacccacc gccgcctctt ccacaaatca 1380

ccggtcacct tctgagggaa ggggctgagg tcgtgggtgg cggcggagaa ggtgtttagt 1440

gacggcagca ctgtctctgt gcccatgatg gctcagacca acaagttcaa ctatactgag 1500

ctgccgtcgt gacagagaca cgggtactac cgagtctggt tgttcaagtt gatatgactc 1560

ttcaccacgc ccgatggcca ttactacgac atcctggaac tgccctacca cggggacacc 1620

aagtggtgcg ggctaccggt aatgatgctg taggaccttg acgggatggt gcccctgtgg 1680

ctcagcatgt tcattgctgc cccttatgaa aaagaggtgc ctctctctgc cctcaccaac 1740

gagtcgtaca agtaacgacg gggaatactt tttctccacg gagagagacg ggagtggttg 1800

attctgagtg cccagctcat cagccactgg aaaggcaaca tgaccaggct gccccgcctc 1860

taagactcac gggtcgagta gtcggtgacc tttccgttgt actggtccga cggggcggag 1920

ctggttctgc ccaagttctc cctggagact gaagtcgacc tcaggaagcc cctagagaac 1980

gaccaagacg ggttcaagag ggacctctga cttcagctgg agtccttcgg ggatctcttg 2040

ctgggaatga ccgacatgtt cagacagttt caggctgact tcacgagtct ttcagaccaa 2100

gacccttact ggctgtacaa gtctgtcaaa gtccgactga agtgctcaga aagtctggtt 2160

gagcctctcc acgtcgcgca ggcgctgcag aaagtgaaga tcgaggtgaa cgagagtggc 2220

ctcggagagg tgcagcgcgt ccgcgacgtc tttcacttct agctccactt gctctcaccg 2280

acggtggcct cctcatccac agctgtcata gtctcagccc gcatggcccc cgaggagatc 2340

tgccaccgga ggagtaggtg tcgacagtat cagagtcggg cgtaccgggg gctcctctag 2400

atcatggaca gacccttcct ctttgtggtc cggcacaacc ccacaggaac agtccttttc 2460

tagtacctgt ctgggaagga gaaacaccag gccgtgttgg ggtgtccttg tcaggaaaag 2520

atgggccaag tgatggaacc ctgaccctgg ggaaagacgc cttcatctgg gacaaaactg 2580

tacccggttc actaccttgg gactgggacc cctttctgcg gaagtagacc ctgttttgac 2640

gagatgcatc gggaaagaag aaactccgaa gaaaagaatt ttagtgttaa tgactctttc 2700

ctctacgtag ccctttcttc tttgaggctt cttttcttaa aatcacaatt actgagaaag 2760

tgaaggaaga gaagacattt gccttttgtt aaaagatggt aaaccagatc tgtctccaag 2820

acttccttct cttctgtaaa cggaaaacaa ttttctacca tttggtctag acagaggttc 2880

accttggcct ctccttggag gacctttagg tcaaactccc tagtctccac ctgagaccct 2940

tggaaccgga gaggaacctc ctggaaatcc agtttgaggg atcagaggtg gactctggga 3000

gggagagaag tttgaagcac aactccctta aggtctccaa accagacggt gacgcctgcg 3060

ccctctcttc aaacttcgtg ttgagggaat tccagaggtt tggtctgcca ctgcggacgc 3120

ggaccatctg gggcacctgc ttccacccgt ctctctgccc actcgggtct gcagacctgg 3180

cctggtagac cccgtggacg aaggtgggca gagagacggg tgagcccaga cgtctggacc 3240

ttcccactga ggccctttgc aggatggaac tacggggctt acaggagctt ttgtgtgcct 3300

aagggtgact ccgggaaacg tcctaccttg atgccccgaa tgtcctcgaa aacacacgga 3360

ggtagaaact atttctgttc cagtcacatt gccatcactc ttgtactgcc tgccaccgcg 3420

ccatctttga taaagacaag gtcagtgtaa cggtagtgag aacatgacgg acggtggcgc 3480

gaggaggctg gtgacaggcc aaaggccagt ggaagaaaca ccctttcatc tcagagtcca 3540

ctcctccgac cactgtccgg tttccggtca ccttctttgt gggaaagtag agtctcaggt 3600

ctgtggcact ggccacccct ccccagtaca ggggtgctgc aggtggcaga gtgaatgtcc 3660

gacaccgtga ccggtgggga ggggtcatgt ccccacgacg tccaccgtct cacttacagg 3720

cccatcatgt ggcccaactc tcctggcctg gccatctccc tccccagaaa cagtgtgcat 3780

gggtagtaca ccgggttgag aggaccggac cggtagaggg aggggtcttt gtcacacgta 3840

gggttatttt ggagtgtagg tgacttgttt actcattgaa gcagatttct gcttcctttt 3900

cccaataaaa cctcacatcc actgaacaaa tgagtaactt cgtctaaaga cgaaggaaaa 3960

atttttatag gaatagagga agaaatgtca gatgcgtgcc cagctcttca ccccccaatc 4020

taaaaatatc cttatctcct tctttacagt ctacgcacgg gtcgagaagt ggggggttag 4080

<210> 2

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

Met Gln Met Ser Pro Ala Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Phe Gly Glu Gly Ser Ala Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala

20 25 30

His Leu Ala Ser Asp Phe Gly Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln

35 40 45

Ala Ser Lys Asp Arg Asn Val Val Phe Ser Pro Tyr Gly Val Ala Ser

50 55 60

Val Leu Ala Met Leu Gln Leu Thr Thr Gly Gly Glu Thr Gln Gln Gln

65 70 75 80

Ile Gln Ala Ala Met Gly Phe Lys Ile Asp Asp Lys Gly Met Ala Pro

85 90 95

Ala Leu Arg His Leu Tyr Lys Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp

100 105 110

Glu Ile Ser Thr Thr Asp Ala Ile Phe Val Gln Arg Asp Leu Lys Leu

115 120 125

Val Gln Gly Phe Met Pro His Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val

130 135 140

Lys Gln Val Asp Phe Ser Glu Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn

145 150 155 160

Asp Trp Val Lys Thr His Thr Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly

165 170 175

Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu

180 185 190

Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Lys Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His

195 200 205

Arg Arg Leu Phe His Lys Ser Asp Gly Ser Thr Val Ser Val Pro Met

210 215 220

Met Ala Gln Thr Asn Lys Phe Asn Tyr Thr Glu Phe Thr Thr Pro Asp

225 230 235 240

Gly His Tyr Tyr Asp Ile Leu Glu Leu Pro Tyr His Gly Asp Thr Leu

245 250 255

Ser Met Phe Ile Ala Ala Pro Tyr Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala

260 265 270

Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn

275 280 285

Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu

290 295 300

Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp

305 310 315 320

Met Phe Arg Gln Phe Gln Ala Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu

325 330 335

Pro Leu His Val Ala Gln Ala Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu Val Asn

340 345 350

Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser Ser Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala

355 360 365

Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val

370 375 380

Val Arg His Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met

385 390 395 400

Glu Pro

<210> 3

<211> 379

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala His Leu Ala Ser Asp Phe Gly

1 5 10 15

Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln Ala Ser Lys Asp Arg Asn Val

20 25 30

Val Phe Ser Pro Tyr Gly Val Ala Ser Val Leu Ala Met Leu Gln Leu

35 40 45

Thr Thr Gly Gly Glu Thr Gln Gln Gln Ile Gln Ala Ala Met Gly Phe

50 55 60

Lys Ile Asp Asp Lys Gly Met Ala Pro Ala Leu Arg His Leu Tyr Lys

65 70 75 80

Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp Glu Ile Ser Thr Thr Asp Ala

85 90 95

Ile Phe Val Gln Arg Asp Leu Lys Leu Val Gln Gly Phe Met Pro His

100 105 110

Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val Lys Gln Val Asp Phe Ser Glu

115 120 125

Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn Asp Trp Val Lys Thr His Thr

130 135 140

Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu

145 150 155 160

Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Lys

165 170 175

Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His Arg Arg Leu Phe His Lys Ser

180 185 190

Asp Gly Ser Thr Val Ser Val Pro Met Met Ala Gln Thr Asn Lys Phe

195 200 205

Asn Tyr Thr Glu Phe Thr Thr Pro Asp Gly His Tyr Tyr Asp Ile Leu

210 215 220

Glu Leu Pro Tyr His Gly Asp Thr Leu Ser Met Phe Ile Ala Ala Pro

225 230 235 240

Tyr Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala

245 250 255

Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu

260 265 270

Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys

275 280 285

Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp Met Phe Arg Gln Phe Gln Ala

290 295 300

Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu Pro Leu His Val Ala Gln Ala

305 310 315 320

Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu Val Asn Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser

325 330 335

Ser Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile

340 345 350

Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Val Arg His Asn Pro Thr Gly

355 360 365

Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met Glu Pro

370 375

<210> 4

<211> 2352

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

gtgcaccatc ccccatccta cgtggcccac ctggcccacg tggtaggggg taggatgcac 60

cgggtggacc ggtcagactt cggggtgagg gtgtttcagc aggtggcgca ggcctccaag 120

gaccgcaacg tgagtctgaa gccccactcc cacaaagtcg tccaccgcgt ccggaggttc 180

ctggcgttgc acgttttctc accctatggg gtggcctcgg tgttggccat gctccagctg 240

acaacaggag gacaaaagag tgggataccc caccggagcc acaaccggta cgaggtcgac 300

tgttgtcctc ctgaaaccca gcagcagatt caagcagcta tgggattcaa gattgatgac 360

gcgggcatgg ccctttgggt cgtcgtctaa gttcgtcgat accctaagtt ctaactactg 420

cgcccgtacc ggcccgccct ccggcatctg taccgggagc tcatggggcc atggaacgcg 480

gatgagctca gcgggcggga ggccgtagac atggccctcg agtaccccgg taccttgcgc 540

ctactcgagt cgaccacaga cgcgatcttc gtccaggcgg atctgaagct ggtccagggc 600

ttcatgcccc actggtgtct gcgctagaag caggtccgcc tagacttcga ccaggtcccg 660

aagtacgggg tgttcttcag gctgttccgg agcacggtcg cgaaagtgga cttttcagag 720

gtggagagag ccaagaagtc cgacaaggcc tcgtgccagc gctttcacct gaaaagtctc 780

cacctctctc ggagattcat catcaatgac tgggtgaaga cacacacaaa aggtatgatc 840

agcaacttgc tttctaagta gtagttactg acccacttct gtgtgtgttt tccatactag 900

tcgttgaacg aagggaaagg agccgtggac cagctgacac ggctggtgct ggtgaatgcc 960

ctctacttca acccctttcc tcggcacctg gtcgactgtg ccgaccacga ccacttacgg 1020

gagatgaagt tgggccagtg ggcgactccc ttccccgact ccagcaccca ccgccgcctc 1080

ttccacaaat caccggtcac ccgctgaggg aaggggctga ggtcgtgggt ggcggcggag 1140

aaggtgttta gtgacggcag cactgtctct gtgcccatga tggctcagac caacgcgttc 1200

aactatactg agctgccgtc gtgacagaga cacgggtact accgagtctg gttgcgcaag 1260

ttgatatgac tcttcaccac gcccgatggc cattactacg acatcctgga actgccctac 1320

cacggggaca ccaagtggtg cgggctaccg gtaatgatgc tgtaggacct tgacgggatg 1380

gtgcccctgt ggctcagcat gttcattgct gccccttatg aaaaagaggt gcctctctct 1440

gccctcacca acgagtcgta caagtaacga cggggaatac tttttctcca cggagagaga 1500

cgggagtggt tgattctgag tgcccagctc atcagccact gggcaggcaa catgaccagg 1560

ctgccccgcc tctaagactc acgggtcgag tagtcggtga cccgtccgtt gtactggtcc 1620

gacggggcgg agctggttct gcccaagttc tccctggaga ctgaagtcga cctcaggaag 1680

cccctagaga acgaccaaga cgggttcaag agggacctct gacttcagct ggagtccttc 1740

ggggatctct tgctgggaat gaccgacatg ttcagacagt ttcaggctga cttcacgagt 1800

ctttcagacc aagaccctta ctggctgtac aagtctgtca aagtccgact gaagtgctca 1860

gaaagtctgg ttgagcctct ccacgtcgcg caggcgctgc agaaagtgaa gatcgaggtg 1920

aacgagagtg gcctcggaga ggtgcagcgc gtccgcgacg tctttcactt ctagctccac 1980

ttgctctcac cgacggtggc ctcctcatcc acagctgtca tagcctcagc cgtcatggcc 2040

cccgaggaga tctgccaccg gaggagtagg tgtcgacagt atcggagtcg gcagtaccgg 2100

gggctcctct agatcatgga cagacccttc ctctttgtgg tccggcacaa ccccacagga 2160

acagtccttt tctagtacct gtctgggaag gagaaacacc aggccgtgtt ggggtgtcct 2220

tgtcaggaaa agatgggcca agtgatggaa ccctgaccct ggggaaagac gccttcatct 2280

gggacaaaac tgtacccggt tcactacctt gggactggga cccctttctg cggaagtaga 2340

ccctgttttg ac 2352

<210> 5

<211> 379

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala His Leu Ala Ser Asp Phe Gly

1 5 10 15

Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln Ala Ser Lys Asp Arg Asn Val

20 25 30

Val Phe Ser Pro Tyr Gly Val Ala Ser Val Leu Ala Met Leu Gln Leu

35 40 45

Thr Thr Gly Gly Glu Thr Gln Gln Gln Ile Gln Ala Ala Met Gly Phe

50 55 60

Lys Ile Asp Asp Ala Gly Met Ala Pro Ala Leu Arg His Leu Tyr Ala

65 70 75 80

Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Ala Asp Glu Leu Ser Thr Thr Asp Ala

85 90 95

Ile Phe Val Gln Ala Asp Leu Lys Leu Val Gln Gly Phe Met Pro His

100 105 110

Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val Ala Lys Val Asp Phe Ser Glu

115 120 125

Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn Asp Trp Val Lys Thr His Thr

130 135 140

Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu

145 150 155 160

Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Ala

165 170 175

Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His Arg Arg Leu Phe His Lys Ser

180 185 190

Asp Gly Ser Thr Val Ser Val Pro Met Met Ala Gln Thr Asn Ala Phe

195 200 205

Asn Tyr Thr Glu Phe Thr Thr Pro Asp Gly His Tyr Tyr Asp Ile Leu

210 215 220

Glu Leu Pro Tyr His Gly Asp Thr Leu Ser Met Phe Ile Ala Ala Pro

225 230 235 240

Tyr Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala

245 250 255

Gln Leu Ile Ser His Trp Ala Gly Asn Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu

260 265 270

Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys

275 280 285

Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp Met Phe Arg Gln Phe Gln Ala

290 295 300

Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu Pro Leu His Val Ala Gln Ala

305 310 315 320

Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu Val Asn Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser

325 330 335

Ser Ser Thr Ala Val Ile Ala Ser Ala Val Met Ala Pro Glu Glu Ile

340 345 350

Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Val Arg His Asn Pro Thr Gly

355 360 365

Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met Glu Pro

370 375

<210> 6

<211> 3834

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgc acttgtcacg 60

tacatgtcct acgttgagga cagaacgtaa cgtgattcag aacgtgaacg tgaacagtgc 120

aattcggcac ctctcgagcc caaatctagt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 180

ttaagccgtg gagagctcgg gtttagatca ctgttttgag tgtgtacggg tggcacgggt 240

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 300

cgtggacttg aggacccccc tggcagtcag aaggagaagg ggggttttgg gttcctgtgg 360

ctctacatca cccgggaacc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 420

gagatgtagt gggcccttgg actccagtgt acgcaccacc acctgcactc ggtgcttctg 480

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 540

ggactccagt tcaagttgac catgcacctg ccgcacctcc acgtattacg gttctgtttc 600

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 660

ggcgccctcc tcgtcatgtt gtcgtgcatg gcacaccagt cgcaggagtg gcaggacgtg 720

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 780

gtcctgaccg acttaccgtt cctcatgttc acgttccaga ggttgtttcg ggagggtcgg 840

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 900

gggtagctct tttggtagag gtttcggttt cccgtcgggg ctcttggtgt ccacatgtgg 960

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1020

gacgggggta gggccctcct ctactggttc ttggtccagt cggactggac ggaccagttt 1080

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1140

ccgaagatag ggtcgctgta gcggcacctc accctctcgt tacccgtcgg cctcttgttg 1200

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1260

atgttctggt gcggagggca cgacctgagg ctgccgagga agaaggagat gtcgttcgag 1320

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380

tggcacctgt tctcgtccac cgtcgtcccc ttgcagaaga gtacgaggca ctacgtactc 1440

gctctgaagt tccactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtgc aactagtgtg 1500

cgagacttca aggtgatgtg cgtcttctcg gagagggaca gaggcccacg ttgatcacac 1560

caccatcccc catcctacgt ggcccacctg gcctcagact tcggggtgag ggtgtttcag 1620

gtggtagggg gtaggatgca ccgggtggac cggagtctga agccccactc ccacaaagtc 1680

caggtggcgc aggcctccaa ggaccgcaac gtggttttct caccctatgg ggtggcctcg 1740

gtccaccgcg tccggaggtt cctggcgttg caccaaaaga gtgggatacc ccaccggagc 1800

gtgttggcca tgctccagct gacaacagga ggagaaaccc agcagcagat tcaagcagct 1860

cacaaccggt acgaggtcga ctgttgtcct cctctttggg tcgtcgtcta agttcgtcga 1920

atgggattca agattgatga caagggcatg gcccccgccc tccggcatct gtacaaggag 1980

taccctaagt tctaactact gttcccgtac cgggggcggg aggccgtaga catgttcctc 2040

ctcatggggc catggaacaa ggatgagctc agcaccacag acgcgatctt cgtccaggcg 2100

gagtaccccg gtaccttgtt cctactcgag tcgtggtgtc tgcgctagaa gcaggtccgc 2160

gatctgaagc tggtccaggg cttcatgccc cacttcttca ggctgttccg gagcacggtc 2220

ctagacttcg accaggtccc gaagtacggg gtgaagaagt ccgacaaggc ctcgtgccag 2280

aagaaagtgg acttttcaga ggtggagaga gccagattca tcatcaatga ctgggtgaag 2340

ttctttcacc tgaaaagtct ccacctctct cggtctaagt agtagttact gacccacttc 2400

acacacacaa aaggtatgat cagcaacttg cttgggaaag gagccgtgga ccagctgaca 2460

tgtgtgtgtt ttccatacta gtcgttgaac gaaccctttc ctcggcacct ggtcgactgt 2520

cggctggtgc tggtgaatgc cctctacttc aacggccagt ggaagactcc cttccccgac 2580

gccgaccacg accacttacg ggagatgaag ttgccggtca ccttctgagg gaaggggctg 2640

tccagcaccc accgccgcct cttccacaaa tcagacggca gcactgtctc tgtgcccatg 2700

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atggctcaga ccaacaagtt caactatact gagttcacca cgcccgatgg ccattactac 2820

taccgagtct ggttgttcaa gttgatatga ctcaagtggt gcgggctacc ggtaatgatg 2880

gacatcctgg aactgcccta ccacggggac accctcagca tgttcattgc tgccccttat 2940

ctgtaggacc ttgacgggat ggtgcccctg tgggagtcgt acaagtaacg acggggaata 3000

gaaaaagagg tgcctctctc tgccctcacc aacattctga gtgcccagct catcagccac 3060

ctttttctcc acggagagag acgggagtgg ttgtaagact cacgggtcga gtagtcggtg 3120

tggaaaggca acatgaccag gctgccccgc ctcctggttc tgcccaagtt ctccctggag 3180

acctttccgt tgtactggtc cgacggggcg gaggaccaag acgggttcaa gagggacctc 3240

actgaagtcg acctcaggaa gcccctagag aacctgggaa tgaccgacat gttcagacag 3300

tgacttcagc tggagtcctt cggggatctc ttggaccctt actggctgta caagtctgtc 3360

tttcaggctg acttcacgag tctttcagac caagagcctc tccacgtcgc gcaggcgctg 3420

aaagtccgac tgaagtgctc agaaagtctg gttctcggag aggtgcagcg cgtccgcgac 3480

cagaaagtga agatcgaggt gaacgagagt ggcacggtgg cctcctcatc cacagctgtc 3540

gtctttcact tctagctcca cttgctctca ccgtgccacc ggaggagtag gtgtcgacag 3600

atagcctcag ccgtcatggc ccccgaggag atcatcatgg acagaccctt cctctttgtg 3660

tatcggagtc ggcagtaccg ggggctcctc tagtagtacc tgtctgggaa ggagaaacac 3720

gtccggcaca accccacagg aacagtcctt ttcatgggcc aagtgatgga accctgacag 3780

gccgtgttgg ggtgtccttg tcaggaaaag tacccggttc actaccttgg gact 3834

<210> 7

<211> 638

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Leu Val Thr Asn Ser Ala Pro Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

20 25 30

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

35 40 45

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr

50 55 60

Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

65 70 75 80

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

85 90 95

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

100 105 110

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

115 120 125

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

130 135 140

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

145 150 155 160

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

165 170 175

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

180 185 190

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

195 200 205

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

210 215 220

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

225 230 235 240

Ala Leu Lys Phe His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

245 250 255

Ala Thr Ser Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala His Leu Ala Ser

260 265 270

Asp Phe Gly Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln Ala Ser Lys Asp

275 280 285

Arg Asn Val Val Phe Ser Pro Tyr Gly Val Ala Ser Val Leu Ala Met

290 295 300

Leu Gln Leu Thr Thr Gly Gly Glu Thr Gln Gln Gln Ile Gln Ala Ala

305 310 315 320

Met Gly Phe Lys Ile Asp Asp Lys Gly Met Ala Pro Ala Leu Arg His

325 330 335

Leu Tyr Lys Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp Glu Leu Ser Thr

340 345 350

Thr Asp Ala Ile Phe Val Gln Ala Asp Leu Lys Leu Val Gln Gly Phe

355 360 365

Met Pro His Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val Lys Lys Val Asp

370 375 380

Phe Ser Glu Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn Asp Trp Val Lys

385 390 395 400

Thr His Thr Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly Lys Gly Ala Val

405 410 415

Asp Gln Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu Tyr Phe Asn Gly

420 425 430

Gln Trp Lys Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His Arg Arg Leu Phe

435 440 445

His Lys Ser Asp Gly Ser Thr Val Ser Val Pro Met Met Ala Gln Thr

450 455 460

Asn Lys Phe Asn Tyr Thr Glu Phe Thr Thr Pro Asp Gly His Tyr Tyr

465 470 475 480

Asp Ile Leu Glu Leu Pro Tyr His Gly Asp Thr Leu Ser Met Phe Ile

485 490 495

Ala Ala Pro Tyr Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala Leu Thr Asn Ile

500 505 510

Leu Ser Ala Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn Met Thr Arg Leu

515 520 525

Pro Arg Leu Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu Thr Glu Val Asp

530 535 540

Leu Arg Lys Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp Met Phe Arg Gln

545 550 555 560

Phe Gln Ala Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu Pro Leu His Val

565 570 575

Ala Gln Ala Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu Val Asn Glu Ser Gly Thr

580 585 590

Val Ala Ser Ser Ser Thr Ala Val Ile Ala Ser Ala Val Met Ala Pro

595 600 605

Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Val Arg His Asn

610 615 620

Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met Glu Pro

625 630 635