广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用

摘要

本发明提供广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用，广谱抗生素通过激活肝脏FXR减轻肝脏IRI实现治疗。广谱抗生素能够重塑肠道菌群，并且作用于肝脏IRI病理过程，符合当今研制治疗肝脏IRI中药物的需求。广谱抗生素预处理能够减轻肝脏IRI中肝细胞损伤、炎症反应、细胞凋亡水平及浸润巨噬细胞募集，并且能够通过激活FXR信号从而实现肝脏保护作用，本发明给肝脏IRI治疗提供了新的思路，具有临床实际意义。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

肝脏缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)是包括肝肿瘤切除和肝移植等肝脏外科手术过程中发生肝脏损伤的重要原因。在这个过程中，初始的缺氧损伤会导致细胞代谢紊乱，而再灌注阶段的血液再通会导致炎症级联反应，造成肝功能障碍和损伤。炎症级联反应和进一步组织损伤的机制涉及细胞因子/趋化因子、多种细胞类型和各种信号通路的复杂作用。近年来多项研究证实，肠道菌群与肝脏IRI密切相关。在肝脏IRI期间，由于门静脉阻塞导致肠壁通透性增加，导致肠源性内毒素易位进入肝脏循环并加重IRI。既往有研究报道了在肝移植前无论对“供体”还是“受体”抗炎治疗都能够减轻肝脏IRI损伤。

胆汁酸是在肝细胞内以胆固醇为原料合成的重要信号分子，肝细胞中合成的胆汁酸通过胆囊分泌至肠道，并在肠道细菌的作用下代谢为次级胆汁酸，分泌至肠道未代谢的初级胆汁酸和次级胆汁酸通过门静脉转运至肝脏形成胆汁酸的肠肝循环。既往研究已经证实，胆汁酸及其下游信号在肝脏IRI中也发挥着作用。

广谱抗生素(Abx)是抗菌谱比较宽的药物，Abx预处理是否能够通过影响胆汁酸代谢相关肠道细菌，改变肝脏胆汁酸组成，影响胆汁酸信号进而影响肝脏IRI尚未有相关的报道和记载。因此，本发明提供广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提供广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用，广谱抗生素通过激活肝脏FXR减轻肝脏IRI实现治疗。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

进一步地，广谱抗生素通过减轻肝脏IRI中的细胞凋亡水平实现治疗。

进一步地，广谱抗生素通过减少肝脏IRI中浸润巨噬细胞的募集实现治疗。

进一步地，广谱抗生素通过减轻肝脏IRI中的肝细胞损伤实现治疗。

进一步地，广谱抗生素通过减轻肝脏IRI中的炎症反应实现治疗。

进一步地，所述广谱抗生素的组成剂量为1g/L氨苄霉素、0.5g/L万古霉素、1g/L甲硝唑和1g/L新霉素，使用剂量为20mg/kg/天。

本发明的有益效果是：本发明提供了广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。广谱抗生素能够重塑肠道菌群，并且作用于肝脏IRI病理过程符合当今研制治疗肝脏IRI中药物的需求。肝组织HE染色组织图像证明广谱抗生素预处理能够减轻肝脏IRI中肝细胞损伤；CD68和Ly6G免疫组化切片、mRNA表达水平检测和ELISA检测结果证明广谱抗生素预处理能够减轻炎症反应；TUNEL染色和Western Blotting、流式细胞术结果证明广谱抗生素预处理能够降低细胞凋亡水平及浸润巨噬细胞募集；此外，内源性胆汁酸检测、Western Blotting、mRNA表达水平检测结果还证明广谱抗生素预处理能够通过激活FXR信号从而实现肝脏保护作用。本发明给肝脏IRI治疗提供了新的思路，具有临床实际意义。

附图说明

图1展示了Abx能够减轻肝脏IRI中肝细胞损伤，Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx组血清ALT、AST、LDH及肝组织HE染色组织图像；

图2展示了Abx能够减低肝脏IRI中的炎症反应，Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx组CD68和Ly6G免疫组化切片及定量，RT-PCR检测IL6和TNFa的mRNA水平图以及血清IL-1β表达水平图；

图3表明Abx能够减轻肝脏IRI中的细胞凋亡水平，其中，图A和图B为Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx组小鼠典型的肝脏冰冻切片TUNEL染色结果和定量结果，图C和图D为Western Blot检测四组小鼠肝脏凋亡相关蛋白表达水平和量化结果；

图4表明Abx能够减少IRI肝脏中IMs的募集，其中，图A为Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx组四组小鼠肝脏中免疫细胞(CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞和IMs)的比例，图B和图C为四组小鼠肝脏中不同免疫细胞典型的流式分群情况，图D为Ly6Chi和Ly6Clo IMs的量化；

图5表明Abx能够影响肝脏胆汁酸组成并激活下游FXR信号，其中，图A是四组小鼠肝脏中不同胆汁酸的组成比例，图B是四组小鼠肝脏中非结合胆汁酸、结合胆汁酸和UDCA的水平，图C是四组小鼠肝脏中FXR的mRNA水平，图D和图E是四组小鼠肝脏中FXR的蛋白水平和量化结果；

图6表明肝脏特异性FXR敲低能够加重Abx预处理的肝脏IRI，其中，图A为四组小鼠五个器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的冰冻切片和FXR的Western Blot结果，图B是四组小鼠血清肝酶(ALT、AST和LDH)水平，图C是四组小鼠肝脏典型的HE染色、CD68免疫组化染色、Ly6G免疫组化染色和冰冻切片TUNEL染色图及相应量化结果。

具体实施方式

实施例1

体内研究证明Abx预处理减轻肝脏IRI中的肝细胞损伤：

1)材料和方法

小鼠IRI模型构建：使用6-8周雄性C57BL/6小鼠构建肝脏部分缺血再灌注损伤模型(70％肝脏缺血)。将小鼠随机分为Sham+Saline组(假手术+生理盐水组)、Sham+Abx组(假手术组+广谱抗生素组)、IRI+Saline组(肝脏部分缺血再灌注组+生理盐水组)和IRI+Abx组(肝脏部分缺血再灌注组+广谱抗生素组)。IRI+Abx组小鼠在肝脏缺血处理之前口服灌胃广谱抗生素(Abx预处理)(1g/L氨苄霉素、0.5g/L万古霉素、1g/L甲硝唑和1g/L新霉素)，灌胃剂量为20mg/kg/天，灌胃四周，IRI+Saline组小鼠在肝脏缺血处理前使用相同剂量的生理盐水灌胃四周。术后通过小鼠眼球取血收集血液样本，并且收集小鼠肝脏左叶和中叶组织。

苏木精-伊红(HE)染色：收集上述四组小鼠肝脏组织进行4％多聚甲醛固定，并进行乙醇中梯度脱水，然后将肝脏组织依次放入无水乙醇/二甲苯混合溶液(1:1)(2h)、二甲苯I(1.5h)、二甲苯II(1.5h)中进行透化处理，将透化后的肝脏组织浸入蜡水，制成蜡块。继而切出5μm厚的切片进行脱蜡处理。将切片置于苏木精染色液中染色20min，再经过流水去除染液。然后将切片依次浸泡于95％、100％乙醇溶液中清洗、脱水。最后使用中性树脂进行封片。

2)结果

如图1所示，Abx预处理能够减轻肝脏IRI中肝细胞损伤。图A展示了通过Abx预处理能够降低肝脏IRI后肝酶的水平，图B为HE染色观察肝脏损伤面积，发现IRI+Abx组小鼠损伤区域减少，图C为根据HE染色所呈现的病理学改变进行的Suzuki评分量化肝脏损伤情况。以上结果表明，Abx预处理能够减轻IRI中肝细胞损伤。

实施例2

体内研究证明Abx预处理减轻肝脏IRI中的炎症反应：

1)材料和方法

免疫组化：按照实施例1中的分组，将小鼠肝脏组织蜡块进行切片、脱蜡、水化处理，将切片置于EDTA抗体修复液中进行抗体修复，然后使用5％BSA经行封闭1h，甲乳50ulCD68和Ly6G一抗稀释液，4℃孵育过夜，隔天回收一抗，PBST反复冲洗3次，然后孵育2抗室温1h，之后再次进行PBST冲洗3次，然后进行显色、复染、封片，最后观察拍照。

mRNA表达水平检测：提取四组小鼠肝脏组织使用Trizol试剂(Invitrogen)提取mRNA，使用HiScript II Q RT SuperMix(Invitrogen)逆转录生成cDNA，后采用SYBR GreenReagent(Invitrogen)进行RT-PCR，检测IL6，TNF-a和FXR的转录水平。本研究使用的引物序列如下：

β-actin forward primer，5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’

β-actin reverse primer，5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’

IL6 forward primer，5’-TACCACTTCACAAGTCGGAGGC-3’

IL6 reverse primer，5’-CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC-3’

TNF-a forward primer，5’-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’

TNF-a reverse primer，5’-GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3’

FXP forward primer，5’-GCTTGATGTGCTACAAAAGCTG-3’

FXP reverse primer，5’-CGTGGTGATGGTTGAATGTCC-3’

ELISA检测：使用科联生物公司的Mouse IL-1βELISAKit检测小鼠血清中IL-1β的水平。

2)结果

图2展示了Abx预处理能够减低肝脏IRI中的炎症反应。图A、B是四组小鼠肝脏典型的CD68和Ly6G免疫组化切片及定量(n＝5)，显示在Abx预处理后，肝内炎症相关的巨噬细胞与中性粒细胞的浸润减少。图C展示了四组小鼠肝脏il6和tnfα的mRNA水平(n＝5)，显示在Abx预处理后，肝内炎症相关因子il6和tnfα的mRNA水平下降。图D展示了四组小鼠血清的IL-1β的水平，显示在Abx预处理后，小鼠血清中炎症相关的IL-1β的水平下降。以上结果均表明Abx预处理能够减轻肝脏IRI中的炎症反应。

实施例3

体内研究证明Abx预处理减轻肝脏IRI中的细胞凋亡水平：

1)材料与方法

TUNEL染色：Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx组共计四组小鼠肝脏组织免疫荧光染色(TUNEL)。

Western Blotting：使用蛋白裂解液(Invitrogen)对四组小鼠肝脏组织进行提取蛋白样本。采用BCA试剂盒(Sigma-Aldrich)测定蛋白浓度，将等量的蛋白质装载于SDS-PAGE上，转移，与一抗Bcl-2、Bax、Bcl-xl、β-actin(Abcam)和辣根过氧化物酶偶联二抗孵育，ECL化学发光系统显影。使用Image J软件(NIH)对信号强度进行量化。

2)结果

图3表明Abx预处理能够减轻肝脏IRI中的细胞凋亡水平。图A、B是四组小鼠典型的肝脏冰冻切片TUNEL染色结果和定量结果(n＝5)，显示Abx预处理后肝内凋亡相关的TUNEL阳性细胞表达减少。图C、D是Western Blot检测四组小鼠肝脏凋亡相关蛋白表达水平和量化结果，显示了在Abx预处理后肝内凋亡相关蛋白表达减少。以上结果表明IRI造模后肝脏凋亡加重，Abx预处理能够减轻IRI细胞凋亡水平。

实施例4

体内研究证明Abx预处理减少IRI肝脏中浸润巨噬细胞的募集：

1)材料与方法

流式细胞术：收取Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx四组小鼠新鲜肝脏组织，使用Percoll(Sigma–Aldrich)提取小鼠肝脏内非实质细胞(NPC)，10

2)结果

图4表明Abx预处理能够减少IRI肝脏中IMs的募集。图A为流式细胞术检测四组小鼠肝脏中免疫细胞(CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞和IMs)的比例。图B、C是四组小鼠肝脏中不同免疫细胞典型的流式分群情况。图D为Ly6Chi和Ly6Clo IMs的量化。以上结果表明，Abx预处理能够减少IRI肝脏中IMs的募集，主要是Ly6C高表达的IMs的募集。

实施例5

体内研究证明Abx预处理影响肝脏胆汁酸组成并激活下游FXR信号：

1)材料与方法

内源性胆汁酸检测：Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx四组小鼠每个肝脏标本精确称重，用提取液(乙腈-甲醇-水，2:2:1，0.1％甲酸与同位素标记标准混合)提取肝内内源性胆汁酸，使用UHPLC-MS/MS(Agilent Technologies)分析肝内内源性胆汁酸浓度。

Western Blotting：使用实施例3描述的蛋白印记的方法，检测四组小鼠肝脏中FXR蛋白(Abcam)的表达情况。

mRNA表达水平检测：使用实施例2描述的方法，提取四组小鼠肝脏RNA，进行RT-PCR检测肝内FXR转录情况。

2)结果

图5表明Abx预处理能够影响肝脏胆汁酸组成并激活下游FXR信号。图A是四组小鼠肝脏中不同胆汁酸的组成比例，显示Abx预处理后肝脏内胆汁酸的成分发生改变。图B是四组小鼠肝脏中非结合胆汁酸、结合胆汁酸和UDCA的水平，显示在Abx预处理后小鼠肝脏中非结合胆汁酸水平升高。图C是四组小鼠肝脏中FXR的mRNA水平，显示Abx预处理能够激活肝内FXR的mRNA表达水平。图D和E是四组小鼠肝脏中FXR的蛋白水平和量化结果，显示Abx预处理能够激活肝内FXR的蛋白表达。以上结果表明Abx预处理能够影响肝脏胆汁酸组成并激活下游FXR信号。

实施例6

体内研究证明肝脏特异性FXR敲低加重Abx预处理的肝脏IRI：

1)材料与方法

构建肝脏特异性FXR敲除的小鼠模型：构建shFXR腺相关病毒8(AAV8)，以shNCAAV8作为对照。AAV8中包含了一个肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的标签。小鼠尾静脉注射1011pfu shFXR AAV8或1011pfu shNC AAV8四周后进行Sham或IRI造模。使用冰冻切片荧光下观察和Western Blot实验验证shFXR AAV8肝脏特异性FXR敲除效率。

2)结果

图6表明肝脏特异性FXR敲低能够加重Abx预处理的肝脏IRI。图A是Sham+Saline组、Sham+Abx组、IRI+Saline组、IRI+Abx四组小鼠五个器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的冰冻切片和FXR的Western Blot结果。图B是四组小鼠血清肝酶(ALT、AST和LDH)水平。图C是四组小鼠肝脏典型的HE染色、CD68免疫组化染色、Ly6G免疫组化染色和冰冻切片TUNEL染色图及相应量化结果。组织学HE染色、CD68、Ly6G免疫组化染色及冰冻切片TUNEL染色结果均表明肝脏特异性FXR敲低能够加重Abx预处理的肝脏IRI中的肝细胞损伤、免疫细胞浸润和细胞凋亡。以上结果表明肝脏特异性FXR敲低能够逆转Abx预处理在肝脏IRI中的保护作用，同时也说明了Abx预处理对肝脏的保护作用是通过FXR实现的。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京工程学院

<120> 广谱抗生素在制备减轻肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用

<130> NJ22032402-MSL-NO0065

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catccgtaaa gacctctatg ccaac 25

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagccac cgatccaca 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccacttca caagtcggag gc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcaagtgc atcatcgttg ttc 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtgcctatg tctcagcctc tt 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccatagaac tgatgagagg gag 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttgatgtg ctacaaaagc tg 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgtggtgatg gttgaatgtc c 21